KR20200114843A

KR20200114843A - 자기 구동력이 증가된 조직재생용 다공성 마이크로스캐폴드 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20200114843A
Application number: KR1020190037236A
Authority: KR
Inventors: 박종오; 최은표; 김창세; 고광준; 김석재; 유아미; 한지원; 강병전; 이호; 선종근
Original assignee: 전남대학교산학협력단; 재단법인 한국마이크로의료로봇연구원
Priority date: 2019-03-29
Filing date: 2019-03-29
Publication date: 2020-10-07
Also published as: KR102366334B1

Abstract

본 발명은 마이크로스캐폴드 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 상기 마이크로스캐폴드는 다공성 고분자 스캐폴드 및 양전하를 띠는 고분자로 코팅된 자성 나노입자를 포함함으로써, 자기 구동력이 증가된 것을 특징으로 하므로, 조직재생 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

자기 구동력이 증가된 조직재생용 다공성 마이크로스캐폴드 및 이의 제조방법{Porous Microscaffold for tissue regeneration having increased Magnetic driving force and Preparation Method thereof}

본 발명은 자기 구동력이 증가된 조직재생용 다공성 자기-구동 마이크로스캐폴드 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

조직재생은 손상되고 퇴화한 조직의 기능을 회복하기 위한 차세대 의료용 치료법으로 여겨지는 중요한 패러다임이다. 조직재생 치료법에 있어서 가능한 수단으로는 약물, 성장인자(GF) 및 핵산과 같은 치료용 분자뿐만 아니라 조직 세포, 특히 전구세포 및/또는 줄기세포로의 전달 시스템이 사용될 수 있다.

세포를 이용하여 손상된 조직을 다시 회복시키기 위해서는 세포가 조직의 형상을 이루도록 돕는 뼈대인 스캐폴드(Scaffold)가 필수적으로 요구된다. 이러한 스캐폴드는 조직재생 분야에서 기존 조직과의 연결 및 본래 형태를 복원하는 데 매우 중요한 역할을 하고 있다.

그러나, 기존 개발 중인 자기 구동 스캐폴드는 자성 나노입자의 부착 정도가 낮아 원활한 구동을 위해 높은 자기장을 필요로 하며, 이에 따라 대동물 적용을 위해 큰 자기장 발생 장치가 필요하다는 문제점이 존재한다.

이에, 자기 구동력이 증가된 스캐폴드에 대한 연구가 시급한 실정이다.

국내공개특허 제10-2011-0028019호

본 발명자들은 자기 구동력이 증가된 마이크로스캐폴드를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 다공성 고분자에 양전하를 띠는 고분자로 코팅된 자성 나노입자를 결합시켜 자기 구동력이 증가된 스캐폴드를 제조할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 다공성(Porous) 고분자 스캐폴드(Scaffold); 및 상기 다공성 고분자 스캐폴드 표면에 결합된 자성 나노입자;를 포함하는 마이크로스캐폴드(Microscaffold)를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 마이크로스캐폴드(Microscaffold)의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 자기 구동력이 증가된 마이크로스캐폴드를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 다공성 고분자에 양전하를 띠는 고분자로 코팅된 자성 나노입자를 결합시켜 자기 구동력이 증가된 스캐폴드를 제조할 수 있음을 규명하였다.

본 발명은 생분해성 다공성(Porous) 고분자 스캐폴드(Scaffold) 및 상기 다공성 고분자 스캐폴드 표면에 결합된 자성 나노입자를 포함하는 마이크로스캐폴드(Microscaffold) 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 양태는 다공성(Porous) 고분자 스캐폴드(Scaffold); 및 상기 다공성 고분자 스캐폴드 표면에 결합된 자성 나노입자;를 포함하는 마이크로스캐폴드(Microscaffold)에 관한 것이다.

본 발명에서 "다공성"이란 기공(pore), 채널(channel) 및 케이지(cage)의 배열을 지칭하며, 기공, 채널 및 케이지의 배열은 불규칙적이거나 규칙적 또는 주기적일 수 있다. 또한, 상기 기공 또는 채널은 분리되거나 상호 연결될 수 있고 1차원, 2차원 또는 3차원적일 수 있다.

본 발명에서 "스캐폴드"란 조직공학 분야에서 중요한 기본 요소 중의 하나로서 세포의 부착, 분화 및 조직 주변으로부터 이동되는 세포의 증식과 분화에 적합한 환경을 제공하는 역할을 하는 구조물을 의미하며, 3차원 구형(spherical)의 구조물일 수 있다.

구체적으로는, 조직공학 기술은 인공피부, 인공뼈, 인공연골, 인공각막, 인공혈관 및 인공근육 등 인체의 거의 모든 장기에 적용되고 있는데, 이러한 생체조직 및 장기의 재생을 최적화하기 위해서는 기본적으로 생체조직과 유사한 스캐폴드가 제공되어야 한다. 이상적인 스캐폴드의 기본 요건은 크게 무독성, 기계적 물성 그리고 다공성을 들 수 있다.

한편, 스캐폴드는 생체적합성이 있어야 하며, 세포는 조직 또는 기관의 등가물을 형성하기 위하여 스캐폴드 상에 부착되고 증식할 수 있어야 한다. 따라서, 상기 다공성 고분자는 생체 외 또는 생체 내에서 세포 성장을 위한 기질로서 고려될 수 있다.

상기 다공성 고분자는 다공성의 구조체를 형성할 수 있는 입자라면 그 구체적인 종류는 특별히 제한되지 않으나, 천연 폴리머 또는 합성 폴리머를 포함할 수 있다.

상기 천연 폴리머는 콜라겐(Collagen), 히알루론산(Hyaluronic acid), 젤라틴(Gelatin) 또는 키토산(Chitosan)일 수 있고, 상기 합성 폴리머는 PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), PGA(poly(glycolic acid)), PLA(poly(lactic acid)), PEG(poyethylene glycol), 폴리에스터(polyester), 테플론(teflon), PET(polyethylene terephthalate), 나일론(nylon), 폴리프로필렌(polypropylene) 또는 폴리스티렌(polystyrene)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 다공성 고분자 스캐폴드는 상기와 같은 다공성 형태를 나타냄으로써, 상기 기공, 채널 및 케이지 내로 성장인자가 효과적으로 담지 될 수 있다.

상기 다공성 고분자 스캐폴드는 생분해성으로 가수분해 및/또는 산화 분해를 통해 분해되거나, 효소적으로 또는 박테리아, 효모, 균류 및 조류 등의 미생물의 영향에 의해 적당한 시간 내에 분해될 수 있다.

상기 다공상 고분자 스캐폴드의 직경은 100-500μm일 수 있다.

구체적으로는, 상기 다공성 고분자 스캐폴드의 직경은 충분한 크기의 공극을 지니기 위하여 100 μm 이상일 수 있으며, 주사기 바늘을 통하여 관절강 내에 주입되기 용이하도록 하기 위하여 500 μm 이하일 수 있다.

또한, 상기 다공상 고분자 스캐폴드의 공극(pore)의 직경은 20 μm 이상일 수 있다.

구체적으로는, 상기 다공성 고분자 스캐폴드의 공극의 직경이 20 μm 미만인 경우 상기 다공성 고분자 스캐폴드 내부로 세포가 침투하기 어려울 뿐만 아니라 세포로의 영양분 전달이 어려운 한계가 있다.

상기 자성 나노입자는 내부에 자성체를 포함하여 자성 민감도를 가지는 다양한 물질의 나노입자를 의미하며, 상기 자성 나노입자는 자성 민감도를 갖는 입자라면 그 구체적인 종류는 특별히 제한되지 않으나, 자성 물질 또는 자성 합금일 수 있다.

상기 자성 물질은 Fe, Co, Mn, Ni, Gd, Mo, MM'₂O₄ 또는 M_xO_y(M 및 M'은 각각 독립적으로 Fe, Co, Ni, Mn, Zn, Gd 또는 Cr이고, x는 1 내지 3의 정수, y는 1 내지 5의 정수 임)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 자성 합금은 CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe 또는 NiFeCo일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 자성 나노입자는 상기와 같은 자성 민감도를 나타냄으로써, 자기장 제어를 통하여 본 발명의 마이크로스캐폴드를 재생이 필요한 조직으로 정밀 타겟팅할 수 있다.

또한, 상기 자성 나노입자는 친수성(Hydrophilic)을 띠고, 음이온성 전하(Negative ionic charge)를 지니므로, 자성 나노입자의 체내 순환을 통한 원활한 분해 및 배출이 가능하다.

상기 자성 나노입자 직경은 1-1,000 nm 또는 50-500 nm일 수 있다. 상기 자성 나노입자 직경이 1,000 nm를 초과하는 경우 생체로 투입 시 혈관을 막는 등 생체로의 적용성이 저하될 우려가 있다.

상기 자성 나노입자는 양전하를 띠는 고분자에 의해 코팅될 수 있다.

상기 양전하를 띠는 고분자는 키토산(Chitosan), 콜라겐(Collagen) 또는 폴리에틸렌이민(Polyethyleneimine)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 양전하를 띠는 고분자는 상기 자성 나노입자에 정전기적(Electrostatic)으로 결합된 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 상기 자성 나노입자로 FDA로부터 임상 적용(Clinical application) 안전성이 검증된 페라헴(Feraheme)을 사용하였다.

상기 페라헴은 30 nm의 작은 크기, -37.27 mV의 높은 음이온성 전하(negative ionic charge), 높은 콜로이드 안정성(colloidal stability) 및 높은 체내 투여량 안전성을 갖는 반면, 다공성 고분자 스캐폴드의 제한된 표면적 및 이의 강한 음이온성 전하에 의해 표면에 흡착 가능한 페라헴의 양을 제한될 수 있다.

이에, 상기 페라헴(자성 나노입자)의 크기 증가 및 이온 전하(ionic charge)의 변화에 따른 응집(aggregation)을 유도하기 위하여, 키토산(양전하를 띠는 고분자)을 페라헴에 코팅하여 사용하였다.

즉, 상기 자성 나노입자는 상기 양전하를 띠는 고분자에 의해 코팅되므로, 본 발명의 마이크로스캐폴드 내 자성 나노입자의 담지량을 높임으로써 마이크로스캐폴드의 자성 특성을 높일 수 있다.

구체적으로, 일반적으로 자성 나노입자는 다공성 고분자 스캐폴드 표면에 공유결합에 의해 결합될 수 있다. 그러나, 이 경우 공유결합의 강한 결합력으로 인해 자성 나노입자를 스캐폴드 표면에 안정적으로 부착할 수 있으나, 결합이 끊어지는 시간이 길어 분해 기간이 늘어나는 문제가 발생할 수 있다.

이에, 본 발명의 마이크로스캐폴드는 상기 양전하를 띠는 고분자에 의해 코팅된 자성 나노입자를 포함하므로, 공유결합보다 약한 정전기력의 결합력으로 인해 상기 다공성 고분자 스캐폴드 표면에 자성 나노입자를 약하게 부착할 수 있고, 이에 따라 공유결합보다 짧은 시간 내에 분해될 수 있는 장점이 있다.

상기 양전하를 띠는 고분자와 결합된 자성 나노입자는 마이크로미터(μm)의 크기를 지니며, 상기 다공성 고분자 스캐폴드 표면에 정전기적(Electrostatic)으로 결합된 것일 수 있다.

구체적으로는, 음전하를 띠는 자성 나노입자가 양전하를 띠는 키토산과 결합된 경우, 이에 따라 음전하를 띠는 다공성 고분자 스캐폴드 표면에 정전기적으로 결합될 수 있다.

상기 마이크로스캐폴드의 직경은 100-500μm일 수 있다.

구체적으로는, 상기 마이크로스캐폴드의 직경은 충분한 크기의 공극을 지니기 위하여 100 μm 이상일 수 있으며, 주사기 바늘을 통하여 관절강 내에 주입되기 용이하도록 하기 위하여 500 μm 이하일 수 있다.

상기 마이크로스캐폴드는 조직공학, 의학, 약학 및 재료과학 분야에서 약물, 세포, 단백질 및 성장인자 전달용 재료 또는 인공피부 등으로 폭넓게 사용할 수 있다.

구체적으로는, 상기 마이크로스캐폴드는 조직재생 용도로 사용될 수 있다.

특히, 상기 마이크로스캐폴드는 상대적으로 짧은 생분해 기간(1-2 months)이 필요한 관절연골재생 용도로 사용될 수 있다.

이에 따라, 본 발명의 다른 양태는 상기 마이크로스캐폴드를 포함하는 조직재생용 조성물에 관한 것이다.

따라서, 상기 마이크로스캐폴드는 결손 부위로의 이식을 통해 조직재생을 수행하기 위한 유효성분으로서 사용될 수 있다.

상기 조성물은 본 발명에 따른 마이크로스캐폴드뿐만 아니라 이를 이식에 적절한 상태로 유지하기 위한 수용액, 예를 들어 완충액 또는 주사제용 수용액 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 하기 단계를 포함하는 마이크로스캐폴드(Microscaffold)의 제조방법에 관한 것이다.

다공성 고분자 스캐폴드를 제조하는 스캐폴드 제조 단계;

자성 나노입자를 양전하를 띠는 고분자로 코팅하는 코팅 단계; 및

상기 다공성 고분자 스캐폴드 및 상기 코팅된 자성 나노입자를 결합하는 자성-스캐폴드 제조 단계.

이하, 본 발명의 마이크로스캐폴드 제조방법에 대하여 상세히 설명한다.

스캐폴드 제조 단계

스캐폴드 제조 단계는 유체장치(Fluidic device)를 이용한 에멀전화(Emulsification)에 의해 수행될 수 있다.

상기 에멀전은 일반적으로 혼합할 수 없는 두 가지 이상의 액체의 혼합물을 의미하며, 상기 두 가지 이상의 액체가 혼합하여 다양한 유형의 에멀전을 형성할 수 있다.

구체적으로는 상기 에멀전은 예를 들어, 오일이 분산 상(Dispersed phase)이고 물이 분산 매질(Dispersed medium)인 수중 유(oil-in-water) 에멀전일 수도 있고, 물이 분산 상이고 오일이 분산 매질인 유중 수(water-in-oil) 에멀전일 수도 있다. 또한, 유중 수 에멀전이 분산 상이고 물이 분산 매질인 수중 유중 수(water-in-oil-in-water) 에멜전일 수도 있고, 수중 유 에멀전이 분산 상이고 오일이 분산 매질인 유중 수중 유(oil-in-water-in-oil) 에멜전일 수도 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 에멀전화는 (다중) 에멀전 제조에서 통상적으로 이용되는 모든 방법을 모두 포함하며, 유체장치(Fluidic device)를 사용한 유체 채널(flow channels) 내 물질 이동(mass transfer)을 이용하는 방법일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

코팅 단계

본 단계는 상기 스캐폴드 제조 단계와 독립적으로 수행될 수 있으며, 그 순서는 무관하다.

본 단계에서, 양전하를 띠는 고분자는 자성 나노입자에 정전기적(Electrostatic)으로 결합함으로써 자성 나노입자를 코팅하는 것일 수 있다.

자성-스캐폴드 제조 단계

자성-스캐폴드 제조 단계는 상기 스캐폴드 제조 단계에서 제조된 다공성 고분자 스캐폴드 표면에 상기 제1 코팅 단계에서 양전하를 띠는 고분자에 의해 코팅된 자성 나노입자를 정전기적(Electrostatic)으로 결합하는 방법에 의해 수행될 수 있다.

상기 마이크로스캐폴드의 제조방법에 있어, 상기 마이크로스캐폴드의 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생락한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로스캐폴드의 개요도이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 키토산-코팅 자성 나노입자의 주사 전자 현미경(SEM) 이미지 사진이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로스캐폴드의 제타 전위 값을 측정한 결과이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로스캐폴드의 주사 전자 현미경(SEM) 이미지 사진이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로스캐폴드의 구성 성분을 확인한 결과이다.
도 3c는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로스캐폴드의 크기 및 공극의 크기를 측정한 결과이다.
도 3d는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로스캐폴드의 화학적 구성을 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로스캐폴드의 자기 반응성을 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로스캐폴드의 자기 구동성을 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로스캐폴드의 줄기세포 배양 가능성 및 독성을 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로스캐폴드의 줄기세포 분화능을 확인한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

제조예. 마이크로스캐폴드의 제조

가. 유체장치(Fluidic device)의 제작

고분자 용액 저장부; 유화제 용액 저장부; 상기 고분자 용액 및 유화제 용액을 이송하는 이송가스 제공부; 상기 이송가스에 압력을 제공하는 가압부; 상기 고분자 용액 및 유화제 용액의 혼합으로 스캐폴드 분산액을 생성하여 배출하는 인젝터부; 상기 스캐폴드 분산액을 공급받아 이에 포함된 유기용매 및 분산매를 제거한 후 마이크로스캐폴드를 생성하는 스캐폴드 생성부;로 구성된 유체장치(fluidic device)를 제작하였다.

나. 다공성 고분자 스캐폴드의 제조

증류수에 PVA(Polyvinyl alcohol)를 1%의 중량비로 첨가한 후, 270℃에서 500rpm으로 1시간 교반하여 외부 용액(Water phase)을 제조하였다.

다음으로, 0.07g의 PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid))를 0.931mL의 다이클로로메테인(Dichloromethane)에 용해시킨 후, 15uL의 Span 80을 첨가하였다. 볼텍스 믹서(Vortex mixer)로 3200rpm에서 7분간 교반하여 오일 상(Oil phase) 내부 용액을 제조하였다. 3g의 젤라틴(Gelatin)을 1% PVA 용액에 6%의 중량비로 첨가하고 41.5℃로 가열·교반하여 수 상(Water phase) 내부 용액을 제조하였다. 상기 오일 상 내부 용액에 수 상 내부 용액 850uL를 첨가한 후, 볼텍스 믹서로 3200rpm에서 2분 30초 이상 교반하여 혼합하였다.

상기 가.에서 제작한 유체장치의 인젝터(이중 미세관)의 외부 미세관에 상기 외부 용액을 10kPa의 주입압력으로 흘려주었고, 내부 미세관에는 상기 혼합된 내부 용액을 20kPa의 주입압력으로 흘려주어 다공성 고분자 스캐폴드를 제조하였다.

제조된 스캐폴드는 10℃의 증류수에 3시간 이상 방치한 후, 35℃의 증류수에 3번 세척하여 구조체 내 젤라틴을 제거하고, 상온 건조하여 보관하였다.

다. 키토산-코팅 자성 나노입자의 제조

20 mL 1% 아세트산에 10 mg 키토산(Chitosan)을 용해시켜 키토산 용액 0.5 mg/mL를 제조하고, 이에 1 mL 페라헴(Feraheme, 30 mg/mL)을 넣고 혼합하였다. 그 다음, 키토산@페라헴 파티클이 분산되지 않도록 자석으로 밀착한 후, 원심분리(10000 rpm, 5 분)하여 파티클을 제외한 상층액을 제거하였다. 탈이온수(Deionized water) 30 mL를 넣은 후, 상기 각 단계를 3회 반복하여 잔류 아세트산을 제거하였다.

실시예. 본 발명의 마이크로스캐폴드(키토산-코팅 자성 나노입자가 결합된 다공성 고분자 스캐폴드)의 제조

상기 나.에서 제조된 다공성 고분자 스캐폴드가 담긴 튜브에 상기 다.에서 제조된 키토산-코팅 자성 나노입자(상기 키토산@페라헴 파티클 해당) 용액 10-30 mg/mL를 넣고 6시간 동안 반응시켰다. 탈이온수 세척 후 보관하였다.

실험예 1. 키토산-코팅 자성 나노입자 특성 확인

주사 전자 현미경(scanning electron microscopy, SEM)을 이용하여 상기 제조예 다.에서 제조된 키토산-코팅 자성 나노입자의 이미지를 촬영하였다.

도 2a에서 확인할 수 있듯이, 제조된 키토산-코팅 자성 나노입자는 키토산과 페라헴 간의 이온 결합(ionic interaction)에 의해 생긴 자성 응집체(magnetic aggregates)임을 알 수 있었다.

다음으로, 표면 제타 전위 및 입자 크기 분석기(surface zeta potential and particles size analyzer, ELS-8000, Japan)를 이용하여 상기 제조예 다.에서 제조된 키토산-코팅 자성 나노입자의 크기 및 제타 전위를 측정하였다.

도 2b에서 확인할 수 있듯이, 키토산-코팅 자성 나노입자의 크기(직경)는 평균 1.48 μm였고, 코팅되지 않은 페라헴보다 약한 음이온성 전하(-13.17 mV)를 나타냄을 알 수 잇었다. 이러한 결과는, 키토산과 자성 나노입자(페라헴)가 이온 전하(ionic charge) 상호작용(interaction)을 통해 반응하였음을 의미한다.

실험예 2. 키토산-코팅 자성 나노입자가 결합된 다공성 고분자 스캐폴드 특성 확인

주사 전자 현미경(SEM)을 이용하여 상기 실시예의 마이크로스캐폴드의 이미지를 촬영하였다.

도 3a에서 확인할 수 있듯이, 키토산-코팅 자성 나노입자의 부착에 관계 없이 제작된 마이크로스캐폴드의 크기 및 공극의 크기가 상기 제조예 나.에서 제조된 다공성 고분자 스캐폴드와 비교하여 거의 변하지 않은 것을 알 수 있었다.

금속성분 분석기(energy dispersive X-ray spectrometry, EDX)를 이용하여 상기 실시예의 구성 성분을 확인하였다.

도 3b에서 확인할 수 있듯이, 실시예의 마이크로스캐폴드에서 탄소(C), 산소(O), 철(Fe)의 신호가 검출되었다. 이러한 결과는, 실시예의 마이크로스캐폴드에 키토산-코팅 자성 나노입자가 존재함을 의미한다.

상기 도 3a의 SEM 이미지를 기반으로, ImageJ 소프트웨어(National Institutes of Health, USA)를 이용하여 상기 실시예의 마이크로스캐폴드 및 이의 공극의 크기를 측정하였다.

도 3c에서 확인할 수 있듯이, 실시예의 마이크로스캐폴드의 크기 및 공극의 크기는 각각 357.55±18.57 μm 및 43.85±13.39 μm 이었다.

마지막으로, 분광광도계(Nicolet Nexus 670 FTIR spectrophotometer, Thermo Nicolet Corporation, USA)를 이용하여 실시예의 IR 흡수 밴드(IR absorption band)를 측정함으로써, 화학적 구성(chemical composition)을 분석하였다. 이때, 키토산, 페라헴, 상기 제조예 다.의 키토산-코팅 자성 나노입자, 및 상기 제조예 나.의 다공성 고분자 스캐폴드도 함께 측정하여 비교하였다.

도 3d에서 확인할 수 있듯이, 실시예는 제조예 다.의 키토산-코팅 자성 나노입자, 및 제조예 나.의 다공성 고분자 스캐폴드의 주요 IR 흡수 밴드를 나타내었다. 따라서, 상기 실시예에 각 담지 혼합물이 포함되어 있음을 알 수 있었다.

특히, 630 및 550 cm^-1 근처 피크는 산화철의 하나인 마그헤마이트(γ-Fe2O3)의 존재를 의미하는데, 이와 유사한 피크는 페라헴과 키토산-코팅 자성 나노입자에서도 함께 나타났다. 이러한 결과는, 페라헴이 γ-Fe2O3의 산화철(iron oxide) 코어(core)로 구성되었음을 의미한다.

실험예 3. 자기 반응성 확인

생리식염수가 채워진 바이알(vial)에 실시예의 마이크로스캐폴드를 넣고 흔든 후, 영구자석을 대어 자기 반응성을 확인하였다.

도 4에서 확인할 수 있듯이, 물리적인 흔들기(physical shaking)(ii) 상태에서 바이알 내 마이크로스캐폴드는 바닥에 위치하거나 액체 상에서 퍼져 있었으나, 영구자석을 가까이 대었을 때(iii) 영구자석 쪽으로 빠르게 이동하는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는, 마이크로스캐폴드가 외부 자기장에 의해 민감하게 반응한다는 것을 의미한다.

실험예 4. 자기 특성 분석

진동시료 자화율 측정기(vibrating sample magnetometer, VSM, Lake Shore Cryotronics 7404, USA)를 이용하여 페라헴, 제조예 다.의 키토산-코팅 자성 나노입자, 및 실시예의 마이크로스캐폴드에 대한 자기이력곡선(magnetic hysteresis curve)을 획득하였다.

도 5에서 확인할 수 있듯이, 페라헴(자성 나노입자) 및 키토산-코팅 자성 나노입자의 자화 특성 값은 각 58.94 emu/g 및 53.67 emu/g으로, 키토산 코팅으로 인해 자성 나노입자의 자화 특성 값이 줄어든 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는, 키토산과 페라헴 간의 결합이 일어났음을 의미하며, 키토산-코팅 자성 나노입자 내 약 9.11 wt%의 키토산이 존재함을 알 수 있다.

또한, 키토산-코팅 자성 나노입자 용액을 농도별(10, 20, 30 mg/mL)로 담지 했을 때, 마이크로스캐폴드의 자기 포화도는 7.78, 11.35, 15.98 emu/g으로 점차 증가함을 알 수 있었다. 이러한 결과는, 고농도의 키토산-코팅 자성 나노입자가 사용되는 경우 마이크로스캐폴드의 표면에 더 많은 키토산-코팅 자성 나노입자가 부착할 수 있음을 의미하며, 특히, 30 mg/mL의 키토산-코팅 자성 나노입자 용액 사용 시 마이크로스캐폴드 내 약 27.15 wt%의 페라헴이 존재함을 알 수 있다.

마지막으로, 이를 기존 공유결합을 이용한 자성 나노입자(PEI-MNP)-담지 마이크로구조체와 비교했을 때, 키토산-코팅 자성 나노입자-담지 마이크로구조체의 자기 포화도가 약 2배정도 큰 것을 알 수 있었다.

실험예 5. 자기 구동성 확인

먼저, 3D 프린터를 이용하여 무릎의 3D CAD 모델로부터 무릎 팬텀(knee phantom)을 제작하였다. 그 후, 표적 영역을 대퇴골(femur)의 내측에 형성하였고, 상기 제작된 무릎 팬텀은 식염수를 채운 아크릴 챔버에 위치시켰다. 그 후, 무릎 팬텀의 관절 결손 부위 사이에 위치한 약 100개의 마이크로스캐폴드에 대한 표적 영역으로의 이동을 관찰하였다.

도 6에서 확인할 수 있듯이, 마이크로스캐폴드들은 전자기장 발생 장치에서 발생된 자기장을 통해 원하는 지점으로 이동할 수 있음을 알 수 있었다. 이러한 결과는, 마이크로스캐폴드의 자기장에 의한 무리 이동(Swarm motion)이 가능함을 의미한다. 따라서, 본 발명의 마이크로스캐폴드는 최소 수 백에서 수 천의 마이크로스캐폴드가 필요한 생체 내 연골 재생을 확인을 위한 임상 적용 시 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

실험예 6. 줄기세포 배양 및 독성 평가

상기 실시예의 마이크로스캐폴드 및 상기 제조예 나.의 다공성 고분자 스캐폴드에 마우스 골수 유래 줄기세포(ATCC, VA, USA)를 약 5.8Х10³개씩 담지하였다.

담지 2, 4 및 6일째에 알라마르 블루(alamar blue) 용액을 이용하여 세포 생존능(cell viability)을 측정하고, 다공성 고분자 스캐폴드 대비 마이크로스캐폴드에 대한 세포의 세포독성(cytotoxicity)을 계산하고 이를 평가하였다.

[계산식]

세포독성(cytotoxicity)=

도 7에서 확인할 수 있듯이, 다공성 고분자 스캐폴드 대비 마이크로스캐폴드에 대한 세포 생존능은 90% 이상으로 세포에 독성이 거의 없음을 확인하였다.

실험예 7. 줄기세포 분화능 확인

상기 실시예의 마이크로스캐폴드(3D-배양) 및 24-웰 마이크로플레이트(2D-배양)에 마우스 골수 유래 줄기세포(ATCC, VA, USA)를 약 5.8Х10³개씩 담지하였다. 대조군(Control)으로는 분화시키지 않은 마우스 골수 유래 줄기세포를 사용하였다.

TGF-β1(Peprotech), 덱사메타손(dexamethasone, Sigma Aldrich), 아스코르브산(ascorbic acid, Sigma Aldrich), 피루브산나트륨(sodium pyruvate, Sigma Aldrich), 프롤린(proline, Sigma Aldrich), 인간 트랜스페린(human transferrin, Gibco) 및 아셀렌산(selenous acid, Gibco)을 포함한 분화배지에 상기 마이크로스캐폴드, 마이크로플레이트 및 분화시키지 않은 마우스 골수 유래 줄기세포를 넣고 5% CO₂, 37℃ 배양 조건에서 3주 동안 분화시켰다. 이때, 2-3일에 한 번씩 분화배지를 교체하였다.

분화 후 RNA 추출 키트(Takara)를 이용하여 RNA를 분리하고, cDNA 합성 키트(Takara)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 그 다음, RT-PCR(real-time PCR)을 이용하여 연골분화 관련 유전인자인 Collagen II, SOX9 및 agreecan의 발현도를 측정하였다.

도 8에서 확인할 수 있듯이, 분화 1주차에는 2D-배양에서 Collagen II, SOX9 및 agreecan의 발현도가 높게 나타났으나, 분화 2, 3주차에는 2D-배양과 비교하여 실시예의 마이크로스캐폴드 내에서 줄기세포를 분화했을 때 상기 유전자들의 발현도가 더 높게 나타났다.

Claims

다공성(Porous) 고분자 스캐폴드(Scaffold); 및
상기 다공성 고분자 스캐폴드 표면에 결합된 자성 나노입자;를 포함하는 마이크로스캐폴드(Microscaffold).
제 1 항에 있어서, 상기 다공성 고분자는 PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), PGA(poly(glycolic acid)), PLA(poly(lactic acid)), PEG(poyethylene glycol), 콜라겐(Collagen), 히알루론산(Hyaluronic acid), 젤라틴(Gelatin) 및 키토산(Chitosan)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것인, 마이크로스캐폴드.
제 1 항에 있어서, 상기 자성 나노입자는 Fe, Co, Mn, Ni, Gd, Mo, MM'₂O₄, M_xO_y(M 및 M'은 각각 독립적으로 Fe, Co, Ni, Mn, Zn, Gd 또는 Cr이고, x는 1 내지 3의 정수, y는 1 내지 5의 정수 임), CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe 및 NiFeCo로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것인, 마이크로스캐폴드.
제 1 항에 있어서, 상기 자성 나노입자는 양전하를 띠는 고분자로 코팅된 것인, 마이크로스캐폴드.
제 4 항에 있어서, 상기 양전하를 띠는 고분자는 키토산(Chitosan), 콜라겐(Collagen) 및 폴리에틸렌이민(Polyethyleneimine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 마이크로스캐폴드.
제 1 항에 있어서, 상기 자성 나노입자는 상기 다공성 고분자 스캐폴드 표면에 정전기적(Electrostatic)으로 결합된 것인, 마이크로스캐폴드.
제 1 항 내지 제 6 항의 마이크로스캐폴드를 포함하는 조직재생용 조성물.
다음의 단계를 포함하는 마이크로스캐폴드(Microscaffold)의 제조방법:
다공성 고분자 스캐폴드를 제조하는 스캐폴드 제조 단계;
자성 나노입자를 양전하를 띠는 고분자로 코팅하는 코팅 단계; 및
상기 다공성 고분자 스캐폴드 및 상기 코팅된 자성 나노입자를 결합하는 마이크로스캐폴드 제조 단계.
제 8 항에 있어서, 상기 스캐폴드 제조 단계는 유체장치(Fluidic device)를 이용한 에멀전화(Emulsification)에 의해 수행되는 것인, 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 양전하를 띠는 고분자는 키토산(Chitosan), 콜라겐(Collagen) 및 폴리에틸렌이민(Polyethyleneimine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 이용하여 수행되는 것인, 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 자성-스캐폴드 제조 단계의 자성 나노입자 및 다공성 고분자 스캐폴드는 정전기적(Electrostatic)으로 결합하는 것인, 방법.