CN102065915B - 医疗用组合物及医疗用试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种血管生成效果高，且对患者身体的侵害性低，容易投予到生物体内的医疗用组合物及医疗用试剂盒，所述医疗用组合物包含：具有由生物体吸收性高分子构成的基材及设置在基材上且由羟基磷灰石构成的表层的颗粒状载体；以及置于载体表面的细胞。

Description

医疗用组合物及医疗用试剂盒
技术领域
本发明涉及一种可诱导血管生成的医疗用组合物以及医疗用试剂盒。
背景技术
近年来，随着糖尿病患者及慢性肾功能衰竭患者的增加，患有其并发症，即外周动脉疾病(peripheral arterial disease)(例如闭塞性动脉硬化症(arteriosclerosis obliterans)等)的患者数也有所增加。外周动脉疾病例如会引起四肢外周动脉的狭窄或闭塞，结果导致顽固性溃疡(intractable ulcer)或坏疽(gangrene)。当顽固性溃疡或坏疽扩散时，有时还需要截去四肢，而近几年有此种重症的患者数也有所增加。
在1997年，浅原等人已从成人外周血中分离鉴定出血管内皮祖细胞(vascular endothelial progenitor cell)(例如参照非专利文献1)。其后查明，存在于骨髓中的多能干细胞(pluripotent stemcell)或血管内皮祖细胞会参与各组织中的正常的血管生成及异常的血管生成(血管产生)(例如参照非专利文献2)。
基于所述知识见解，业界已尝试将从骨髓或外周血中分离出的多能干细胞等直接移植到缺血下肢或缺血心肌中来诱导血管生成，由此使正常血流再生(利用细胞移植的血管生成疗法)。
例如，自2000年末以来，日本已在全世界率先进行了针对人的下肢缺血的自体骨髓单核细胞移植(Autologous bone-marrowmononuclear cells transplantation)，目前日本全国的十几个医疗机构正采用此种自体骨髓单核细胞移植(例如参照非专利文献3)。具体而言，大阪市立大学从2002年起至今已对11例(其中，透析患者3例)慢性重症下肢缺血患者进行了自体骨髓单核细胞移植，并且进行了11例(其中，透析患者2例)外周血单核细胞移植。此外，所述自体骨髓单核细胞移植的有效率对于所有患者而言为62.5％，对于透析患者而言为33.3％(例如参照非专利文献4)。
近年来，业界也尝试了将骨髓细胞中更不成熟的CD34阳性细胞浓缩并移植的方法(例如参照非专利文献5)，或者在外周血单核细胞移植时并用粒细胞集落刺激因子(G-CSF，Granulocyte-ColonyStimulating Factor)的方法(例如参照非专利文献6)等。然而，所述方法仍无法超越原有方法的有效性。
另外，业界也做过将血管增生性细胞因子(例如bFGF等)用于溃疡治疗或血管生成疗法中的尝试。具体而言，使明胶水凝胶(gelatinhydrogel)(例如参照非专利文献7)或明胶微球(gelatinmicrosphere)(例如参照非专利文献8)等载体承载血管增生性细胞因子，并将此载体投予给生物体。
另外，近年来也做过将细胞固定在人工载体上，并通过将此载体埋设于生物体内来诱导血管生成(例如参照专利文献1)的尝试。
[现有技术文献]
[专利文献]
[专利文献1]日本公开专利公报特开2004-51952号(2004年2月19日公开)
[非专利文献]
[非专利文献1]Science，275：964-967，1997
[非专利文献2]Curr.Opin.Mol.Ther.，4：395-402，2002
[非专利文献3]Lancet，360：427-435，2002
[非专利文献4]日本透析医学会杂志，37：1493-1501，2004
[非专利文献5]Hypertension，46：7-18，2005
[非专利文献6]J.Cardiovasc Pharmacol Ther.，12：89-97，2007
[非专利文献7]J.Biomater.Sci.，Polym.Eds.，2005，16，893-902
[非专利文献8]J.Thorac.Cardiovasc.Surg.2002，124：50-56
[非专利文献9]Circulation，109：1543-1549，2004
发明内容
然而，所述现有的血管生成疗法存在如下问题：无法充分生成血管，而且对患者身体的侵害性高。
关于近年来利用细胞移植的血管生成疗法已明确：经移植的细胞中，被导入至新生血管的构造内的细胞仅不到10％。而且，一般认为其他大部分的移植细胞会局部地分泌多种细胞因子，而对于血管生成来说，这些细胞因子是较为重要的(例如参照非专利文献9)。
然而，在所述现有的利用细胞移植的血管生成疗法中，已知经移植的细胞中的70％～80％细胞在被移植后的48小时内开始在体内循环，而停留在局部部位的移植细胞较少。即，在所述血管生成疗法中，由于无法有效地使移植细胞停留在局部部位，所以存在无法充分生成血管的问题。
另外，已知在所述现有的利用细胞移植的血管生成疗法中，如果增加移植细胞数，则在某种程度上能增强治疗效果(例如参照非专利文献4)。然而，移植细胞必须使用来自患者自身的细胞，但患有外周动脉疾病等的患者多数情况下是全身健康状况发生恶化。因此，如果从患者身上采集大量细胞，则对患者身体的负担增大，换言之，存在对患者身体的侵害性加大的问题。
另外，在所述现有的使用血管增生性细胞因子的血管生成疗法中，虽然明胶等源自生物的材料具有优异的生物活性，但另一方面存在化学交联剂的影响、源自生物的材料的抗原性以及病毒或朊病毒(prion)的感染等诸多问题。即，该血管生成疗法存在如下问题：将载体移植到患者体内后，对患者身体的侵害性高。
另外，上述专利文献1中所记载的方法存在如下问题：由于被埋设到生物体内的载体在生物体内不分解，所以此载体会引起副作用。
本发明是鉴于以上所述的现有技术中的问题开发而成的，其目的在于提供一种血管生成效果高，且对患者身体的侵害性低，并且容易投予到生物体的医疗用组合物以及医疗用试剂盒。
本发明的发明人针对所述课题进行努力研究，结果发现：通过使细胞附着在涂覆有羟基磷灰石的载体上的结构，可在患者身体内的局部以长时间存活的状态保持细胞，结果即使移植细胞数少，也能有效地诱导血管生成。从而，能够完成本发明。
即，为了实现所述目的，本发明提供的医疗用组合物的特征在于含有：具有由生物体吸收性高分子所构成的基材，以及形成在所述基材上且由羟基磷灰石所构成的表层的颗粒状载体；以及，置于所述载体的表面上的细胞。
在本发明提供的医疗用组合物中，所述载体的粒径优选10μm～200μm。
在本发明提供的医疗用组合物中，所述载体优选具有多孔质结构。
在本发明提供的医疗用组合物中，所述生物体吸收性高分子优选为选自聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙二醇、丙二醇、聚羟基丁酸酯、聚碳酸酯、聚酰胺、纤维素、甲壳素、壳聚糖、淀粉、聚谷氨酸、聚对二氧环己酮、氰基丙烯酸酯聚合物、聚己内酯、合成多肽、玻尿酸、聚苹果酸、聚丁二酸丁二酯，以及组合此等物质而成的共聚物所组成的群中的至少一种。此外，生物体吸收性高分子也可使用合成高分子。
在本发明提供的医疗用组合物中，所述细胞优选为选自由骨髓单核细胞、外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell)、多能干细胞(pluripotent stem cell)、造血干细胞(hematopoieticstem cell)、血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cell)、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell)、胚胎干细胞(Embryonic Stem cell)、血小板以及间充质干细胞(mesenchymalstem cell)所组成群中的至少一种细胞。
在本发明提供的医疗用组合物中，优选在所述载体的表面具备血管生成细胞因子。
在本发明提供的医疗用组合物中，所述血管生成细胞因子优选为选自由aFGF、bFGF、VEGF、HGF、PDGF、PIGF、TNF、EGF、血管生成素、IL、HAPO、Shh、TGF-β、G-CSF、M-CSF、SCF、EPO、TPO以及Flt所组成的群中的至少一种细胞因子。
为了实现所述目的，本发明的医疗用试剂盒的特征在于具备：所述医疗用组合物、以及用于将所述医疗用组合物投予给生物体的注射器。
为了实现所述目的，本发明提供的医疗用组合物的制造方法的特征在于包括如下工序：将具有由生物体吸收性高分子构成的基材、设置在所述基材上且由羟基磷灰石构成成的表层的颗粒状载体，与细胞进行混合。
在本发明提供的医疗用组合物的制造方法中，优选在所述工序中使所述载体的每1个粒子与1×1010个以下的所述细胞混合。
[发明的效果]
如上所述，本发明提供的医疗用组合物包含：具有由生物体吸收性高分子所构成的基材，以及形成在所述基材上且由含羟基磷灰石所构成的表层的颗粒状载体；以及，置于所述载体的表面上的细胞。另外，本发明提供的医疗用组合物视需要也可以含有细胞因子。
另外，如上所述，本发明提供的医疗用试剂盒具备：所述医疗用组合物，以及用于将所述医疗用组合物投予到生物体中的注射器。
另外，如上所述，本发明提供的医疗用组合物，其制造包括如下工序：混合细胞与具有由生物体吸收性高分子所构成的基材以及形成在所述基材上且由羟基磷灰石所构成的表层的颗粒状载体。
在本发明中，由于医疗用组合物可停留在生物体内的局部部位，所以能有效地在目标部位生成血管。
另外，在本发明中，由于在载体的表面具备细胞，所以会发挥利用少量细胞也能有效地生成血管的效果。
另外，在本发明中，由于载体主要由生物体吸收性高分子及羟基磷灰石所形成，所以可将诱导血管生成后的医疗用组合物分解、吸收。即，通过自动去除诱导血管生成后的医疗用组合物，可减轻对生物体的负担。并且，通过改变基材的组成或形态，可调节医疗用组合物的分解、吸收速度。
另外，本发明的医疗用组合物的构成成分对生物体的毒性低，因此可防止投予给生物体时产生副作用(例如炎症等)。
另外，在本发明中，由于不使用胶原蛋白或明胶等源自动物的蛋白质，因此可确保高生物学安全性。
另外，在本发明中，由于使用颗粒状载体，所以可通过注射器将载体投予给生物体。其结果，可通过对患者身体的负担小的方法投予医疗用组合物，并且可容易地将此医疗用组合物投予到局部部位。
另外，在本发明中，由于患者自己也能容易地投予医疗用组合物，所以，即使社会不断老龄化，仍能容易地救助例如受褥疮等困扰的患者。而且，由此可防止患者的QOL(Quality Of Life，基本生活条件)的下降，并且能降低医疗费用。
附图说明
图1(a)是聚乳酸粒子上所具备的骨髓细胞的显微镜照片，图1(b)是羟基磷灰石/聚乳酸粒子上所具备的骨髓细胞的显微镜照片，图1(c)是聚乳酸膜上所具备的骨髓细胞的显微镜照片，图1(d)是羟基磷灰石/聚乳酸膜上所具备的骨髓细胞的显微镜照片。
图2(a)是进行胰蛋白酶处理前的聚乳酸膜/L929细胞复合物的显微镜照片，图2(b)是进行胰蛋白酶处理后的聚乳酸膜/L929细胞复合物的显微镜照片，图2(c)是进行胰蛋白酶处理前的羟基磷灰石/聚乳酸膜/L929细胞复合物的显微镜照片，图2(d)是胰蛋白酶处理后的羟基磷灰石/聚乳酸膜/L929细胞复合物的显微镜照片。
图3(a)是表示移植膜状的羟基磷灰石/聚乳酸膜/骨髓细胞复合物时的状态的示意图，图3(b)是表示将颗粒状的羟基磷灰石/聚乳酸粒子/骨髓细胞复合物注射到肌肉中时状态的示意图。
图4(a)～图4(c)是羟基磷灰石/聚乳酸膜/骨髓细胞复合物的投予部位的显微镜照片。
图5是羟基磷灰石/聚乳酸膜复合物的投予部位的显微镜照片。
图6(c)及图6(d)是羟基磷灰石/聚乳酸膜/骨髓细胞复合物的投予部位的显微镜照片，图6(a)及图6(b)是羟基磷灰石/聚乳酸膜复合物的投予部位的显微镜照片。
图7是表示在羟基磷灰石/聚乳酸膜/骨髓细胞复合物、及羟基磷灰石/聚乳酸膜复合物的投予部位上所观察到的血管长度的合计长度的图表。
图8(a)是表示投予基于颗粒状支架(scaffold)的各种复合物后的小鼠下肢的状态的照片，图8(b)是通过乘积极限法(Kaplan-Meier method)分析小鼠的生存率的图表。
图9是表示使用本发明的医疗用组合物治疗外周动脉疾病的一例的示意图。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。此外，本发明并不限定于此实施方式。
〔1.医疗用组合物〕
本实施方式所涉及的医疗用组合物，包含：具有基材以及形成在此基材上的表层的载体；以及，置于所述载体的表面上的细胞。以下，对各构成进行详细说明。此外，本实施方式的医疗用组合物尤其可用作血管生成用组合物。
[1-1.基材]
所述基材是由生物体吸收性高分子形成的。
生物体吸收性高分子在生物体内毒性低，并且在生物体内被缓慢地分解、吸收。因此，如果用生物体吸收性高分子来形成基材，则可将本实施方式的医疗用组合物维持在体内的所需位置直至充分地诱导血管生成为止，并且在充分地诱导血管生成后，可使本实施方式所涉及的医疗生用组合物迅速地分解、吸收。另外，根据所述构成，由于对生物体的毒性低，因此可抑制产生炎症等副作用。
对于构成所述基材的生物体吸收性高分子并无特别限定，优选使用选自聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙二醇、丙二醇、聚羟基丁酸酯、聚碳酸酯、聚酰胺、纤维素、甲壳素、壳聚糖、淀粉、聚谷氨酸、聚对二氧环己酮、氰基丙烯酸酯聚合物、聚己内酯、合成多肽、玻尿酸、聚苹果酸、聚丁二酸丁二酯，以及组合这些物质而成的共聚物所组成群中的至少一种。在这些生物体吸收性高分子中，优选使用聚乳酸。另外，更优选的是，并用聚乳酸与其他生物体吸收性高分子来形成基材。即，针对所述基材来说，优选的是基材仅用聚乳酸来形成，更优选的是，用聚乳酸与其他生物体吸收性高分子的混合物来形成。
对于与聚乳酸并用的生物体吸收性高分子，并无特别限定，例如，可并用一种上述聚乳酸以外的生物体吸收性高分子，也可并用多种。如果将聚乳酸以外的生物体吸收性高分子与聚乳酸并用，则可形成生物降解性优异的基材，并且可调节聚乳酸的分解速度。
与聚乳酸并用的生物体吸收性高分子例如最优选聚乙醇酸、聚己内酯或聚乙二醇、以及包含此等的组合的共聚物。如果采用所述构成，则可提高本实施方式的医疗用组合物的分解、吸收速度。而且，结果可提高医疗用组合物的安全性。
对于构成所述基材的原料中的聚乳酸以外的物质的含量，并无特别限定，例如当此聚乳酸以外的物质为聚乙醇酸时，其含量优选为所述原料的0重量％～100重量％，更优选为所述原料的20重量％～80重量％。另外，当此聚乳酸以外的物质为聚乙二醇时，其含量优选为所述原料的0重量％～100重量％，更优选为所述原料的20重量％～80重量％。如果采用所述构成，则可将本实施方式的医疗用组合物在体内的持续存在时间调节成所需时间。
对于形成基材的生物体吸收性高分子的形状，即基材中的生物体吸收性高分子的形状，并无特别限定，可适当采用所需形状。例如，所述生物体吸收性高分子的形状优选颗粒状、纤维状、膜状或无纺布。此外，本说明书中的“无纺布”是指不经过编织工学而形成的布状纤维。在所述形状中，最优选的是无纺布。根据所述构成，可增加基材的表面积，因此可使较多的细胞附着在基材上。其结果，能更有效地诱导血管生成。另外，根据所述构成，当将本实施方式所涉及的医疗用组合物投予到体内时，可增加基材与生物体(例如体液中的各种酶)的接触面积，因此可迅速地分解、吸收已发挥血管生成作用的医疗用组合物。
对于所述基材的形状也没有特别限定，可适当采用所需形状。所述基材的形状例如优选的是球状、膜状或扁平状，最优选的是球状。
另外，所述基材也可使用非多孔质的物质基材，但优选的是多孔质(海绵状)结构。此外，如果将基材形成为多孔质，则可以将后述的载体也形成为多孔质。而且，将载体形成为多孔质结构时，可以增加载体的表面积，因此可以使较多的细胞附着在载体上。其结果，可以更有效地诱导血管生成。另外，当将本实施方式所涉及的医疗用组合物投予到体内时，可增加基材与生物体(例如体液中的各种酶)的接触面积，因此可迅速地分解、吸收已发挥血管生成作用的医疗用组合物。
对于所述基材的大小(剖面的直径)并无特别限定，只要在形成下述的表层而形成载体时，以此载体的粒径优选达到0.01μm～5cm，更优选达到1μm～1mm，最优选达到10μm～200μm的方式形成基材即可。即，基材的大小取决于与下述的表层的厚度之间的关系。此外，如果所述粒径为1mm以下，则可通过注射器将载体容易地投予给生物体。另外，对于所述粒径大于1mm的载体，也可通过切开移植的方法将载体投予给生物体。
[1-2.表层]
在本实施方式所涉及的医疗用组合物中，在上述基材上设置了由羟基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2)所构成的表层。而且，主要由此表层与所述基材形成具备细胞的后述的载体。
对于所述表层在所述基材上的设置部位并无特别限定，可通过覆盖基材表面的一部分的方式设置所述表层，也可通过覆盖整个基材表面的方式设置所述表层。
另外，对于所述表层的厚度也没有特别限定。如先前所说明般，调节所述表层的厚度，使得载体的粒径优选达到0.01μm～5cm，更优选达到1μm～1mm，最优选达到10μm～200μm即可。即，表层的厚度取决于与先前所说明的基材的大小之间的关系。
对于形成所述表层的方法并无特别限定，例如，优选的方法有：首先形成纳米级的羟基磷灰石粒子，即形成羟基磷灰石纳米结晶，然后利用此羟基磷灰石纳米粒子涂覆所述基材。此结晶(粒子)可以是未煅烧体(非结晶)，也可以是煅烧体。
对于涂覆所述基材的羟基磷灰石粒子的尺寸并无特别限定，例如，可优选使用粒径为10nm～700nm，更优选为20nm～600nm，最优选为25nm～500nm的范围内的羟基磷灰石粒子。
以下，对所述羟基磷灰石粒子、表层(换言之，指载体)的形成方法的一例进行更具体说明。
虽然对所述表层的形成方法无特别限定，但优选的是，至少包括“一次粒子生成工序”、“烧结工序”、“表层形成工序”。另外，除所述工序以外，还可包括“去除工序”、“混合工序”。此外，在以下的说明中，作为对表层形成方法的一例，说明包括所述全部5个工序的制造方法进行说明，但并不限定于此方法。
所述5个工序将以“1.一次粒子生成工序”→“2.混合工序”→“3.烧结工序”→“4.去除工序”→“5.表层形成工序”的顺序进行。此外，“1.一次粒子生成工序”～“4.去除工序”是制作成为表层原料的羟基磷灰石粒子的工序，表层形成工序是使用此羟基磷灰石粒子在基材上形成表层，并形成由基材与表层所构成的载体的工序。以下，对各工序进行说明。
<1.一次粒子生成工序>
此处的“一次粒子”是指，在烧结工序之前，由羟基磷灰石(HAp)所形成的粒子。即，在羟基磷灰石粒子的制造工序中，初次被形成的粒子。另外，狭义上是指单晶粒子。此外，本说明书中的“一次粒子”包括非晶质(非结晶)状态的粒子，以及其后进行烧结所得的烧结体状态的粒子。
相对于此，“二次粒子”是指多个“一次粒子”彼此通过物理结合(例如融合等)或化学结合(例如离子键或共价键等)而成的结合状态的粒子。此时，对于相结合的一次粒子的个数、结合后的形状等并无特别限定。
另外，尤其是“单晶一次粒子”是指由羟基磷灰石的单晶所构成的一次粒子，或者由此单晶所构成的一次粒子通过离子性相互作用聚集而成的粒子块。此外，所述“通过离子性相互作用聚集而成的粒子块”是指，在含有水或有机溶剂的介质中分散时通过离子性相互作用而自我聚集而成的粒子块，不包括通过烧结使粒子间熔融而进行多晶化的二次粒子。
一次粒子生成工序只要是可生成所述一次粒子的工序即可，并无特别限定。例如，对于将pH值调制成碱性(例如pH值为12.0)的Ca(NO3)2水溶液中，在高温(例如80℃)下缓慢地添加将pH值调制成碱性(例如pH值为12.0)的(NH4)2HPO4水溶液即可。
通过一次粒子生成工序所生成的一次粒子的状态(例如粒径、粒度分布)会直接反映到羟基磷灰石粒子的状态(粒径、粒度分布)上。因此，如果要制造粒径微细(纳米级)且粒径均匀(粒度分布狭)的羟基磷灰石粒子，则优选在此一次粒子生成工序中预先生成粒径微细(纳米级)且粒径均匀(粒度分布狭小)的一次粒子。
一次粒子的粒径并无特别限定，优选的是10nm～500nm，更优选的是20nm～450nm，最优选的是25nm～400nm。另外，就包含一次粒子的一次粒子群的粒径的变异系数来说，优选的是20％以下，更优选的是18％以下，最优选的是15％以下。此外，一次粒子的粒径及变异系数可通过如下方法进行计算，即使用动态光散射法或电子显微镜对至少100个以上的一次粒子测量粒径，并根据测量结果进行计算。通过预先生成如上所述的一次粒子群，可形成后述的细胞附着效率较佳的表层。此外，“变异系数”是，可通过标准偏差÷平均粒径×100(％)进行计算的，表示粒子间的粒径偏差的值。
关于生成如上所述的微细(纳米级)且粒径均匀(粒度分布狭小)的一次粒子的方法，并无特别限定，例如可利用日本专利申请特开2002-137910号公报中所记载的方法。即，使钙溶液及磷酸溶液在表面活性剂/水/油系乳液相中可溶化并加以混合，然后于表面活性剂的浊点以上进行反应，由此可合成一次粒子。另外，此时通过改变所述表面活性剂的官能基及亲水性/疏水性比的比例，可控制一次粒子的大小。
以下，简单地说明制造所述一次粒子的原理。在将钙溶液及磷酸溶液混合至表面活性剂/水/油系乳液相中，并进行反应来合成羟基磷灰石微粒子的方法中，羟基磷灰石的核在表面活性剂的微胞中成长，并进行结晶成长。此时，通过将反应温度设定为表面活性剂的浊点以上，可控制微胞的热力学稳定性。即，通过将反应温度提高到表面活性剂的浊点以上，可使表面活性剂的形成微胞的能力下降。其结果，在微胞形态下受到限制的羟基磷灰石的结晶成长的驱动力大于欲维持微胞形态的驱动力。而且，利用此机制可控制结晶的形态(例如形状或大小等)。
当利用表面活性剂制作微胞时，重要的是表面活性剂的官能基(亲水性部位)及此表面活性剂的亲水性/疏水性，如果此等不同，则微胞的稳定性及浊点也不同。另外，表面活性剂的浊点根据表面活性剂的种类而有所不同。因此，通过适当变更表面活性剂的种类，可变更微胞的稳定性及浊点，由此可控制羟基磷灰石微粒子的大小。
此外，对于在所述方法中被使用的表面活性剂的种类并无特别限定，例如可使用日本专利申请特开平5-17111号公报中所揭示的，众所周知的阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂，或非离子表面活性剂。更具体而言，作为非离子性表面活性剂，优选使用聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烯丙基醚、聚氧乙烯烷基烯丙基醚、聚氧乙烯衍生物、环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物、山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基胺等。而且，作为阳离子表面活性剂，优选使用硬脂胺盐酸盐、月桂基三甲基氯化铵、烷基苯二甲基氯化铵等四级铵盐等。另外，作为阴离子表面活性剂，优选使用月桂醇硫酸酯钠、油醇硫酸酯钠等高级醇硫酸酯盐类，月桂基硫酸钠、月桂基硫酸铵等烷基硫酸盐类，十二烷基苯磺酸钠、十二烷基萘磺酸钠等烷基芳基磺酸盐类等。另外，作为两性表面活性剂，优选使用烷基甜菜碱型、烷基酰胺甜菜碱型、氧化胺型的两性表面活性剂。所述表面活性剂可使用一种，或者使用两种以上的组合。其中，就浊点及溶解性的观点而言，使用五乙二醇十二烷基醚为最优选。
另外，作为可用于所述方法的油相，例如可列举：甲苯、二甲苯、己烷、十二烷、环己烷等烃类，氯苯、氯仿等卤化烃类，乙醚等醚类，丁醇等醇类，甲基异丁基酮、环己酮等酮类等。
根据所使用的表面活性剂，可选择一种或两种所述油相，从而能减小水的溶解度的同时溶解所述表面活性剂的任一种。就水的溶解度及表面活性剂的溶解性的观点而言，作为所述油相最优选使用十二烷。除此以外，反应温度、反应时间、原料的添加量等可根据一次粒子的组成适当选择并采用最佳条件即可。但是，由于是水溶液的反应，因此反应温度的上限是不会使溶液沸腾的温度为好，具体而言，90℃以下温度为优选。
另外，本工序还可以包含利用水等来清洗所生成的一次粒子的工序，以及通过离心分离、过滤等回收一次粒子的工序。
<2.混合工序>
混合工序是将一次粒子与抗融合剂混合的工序。即，预先使抗融合剂介于通过所述一次粒子生成工序而获得的一次粒子群的粒子之间，由此来防止在其后的烧结工序中的一次粒子之间的融合。此外，将通过本混合工序获得的一次粒子与抗融合剂的混合物称为“混合粒子”。
作为所述抗融合剂，只要可防止一次粒子间的融合则并无特别限定，但优选的是在后续的烧结工序的烧结温度下不会挥发的抗融合剂。只要在烧结温度条件下具有不挥发性，在烧结工序中就不会从一次粒子间消失，可切实地防止一次粒子彼此的融合。但是，无需在烧结温度下具有100％的不挥发性，只要具有在烧结工序结束后于一次粒子间残存10％以上程度的不挥发性即可。
另外，所述抗融合剂也可以是在烧结工序结束后通过加热而进行化学分解的抗融合剂。即，只要为在烧结工序结束后残存的抗融合剂即可，没有必要在烧结工序的开始前后是同一物质(化合物)。
另外，抗融合剂是溶解于溶剂，尤其是水系溶剂的物质为佳。如果使用溶解于溶剂的抗融合剂，则只要将混合有抗融合剂的混合粒子悬浮于纯水等水系溶剂中，便可去除抗融合剂(例如碳酸钙等)。尤其，如果是可溶于水系溶剂的抗融合剂，则当去除抗融合剂时无需使用有机溶剂，因此去除工序中不需要专门对应有机溶剂而使用的设备、有机溶剂废液处理。因此，可更简便地从混合粒子中去除抗融合剂。此外，对于所述溶剂并无特别限定，例如，作为水系溶剂可列举水、乙醇、甲醇等，作为有机溶剂可列举丙酮、甲苯等。
另外，为了提高抗融合剂在水中的溶解性，所述水系溶剂优选含有草酸盐、乙二胺、联吡啶、乙二胺四乙酸盐等螯合物。并且，为了提高抗融合剂在水中的溶解性，所述水系溶剂优选含有氯化钠、硝酸铵、碳酸钾等的电解质离子。
在此，抗融合剂在溶剂中的溶解度越高，去除效率越高，因此为优选。如果将相对于溶剂100g的溶质的量(g)设定为溶解度，则所述抗融合剂的溶解度优选是0.01g以上，更优选是1g以上，最优选是10g以上。
作为所述抗融合剂的具体例并无特别限定，例如，可优选使用氯化钙、氧化钙、硫酸钙、硝酸钙、碳酸钙、氢氧化钙、乙酸钙、柠檬酸钙等钙盐(或络合物)，聚丙烯酸钙，氯化钾、氧化钾、硫酸钾、硝酸钾、碳酸钾、氢氧化钾、磷酸钾等钾盐，氯化钠、氧化钠、硫酸钠、硝酸钠、碳酸钠、氢氧化钠、磷酸钠等钠盐等。
此外，对于在此混合工序中混合一次粒子与抗融合剂的方法并无特别限定，例如可采用在固体状的羟基磷灰石一次粒子中混合固体状的抗融合剂后，使用搅拌机进行混合的方法；也可以采用将一次粒子分散于抗融合剂的溶液中的方法。但是，由于难以将固体与固体均匀混合，因此为了使抗融合剂均匀且切实地介于一次粒子间，后一方法为更优选。当采用后一方法时，优选将分散了羟基磷灰石一次粒子后的抗融合剂溶液加以干燥。由此，可长时间地维持羟基磷灰石一次粒子与抗融合剂均匀混合的状态。
<3.烧结工序>
烧结工序是，将通过所述混合工序所获得的混合粒子曝露在烧结温度下，使包含在此混合粒子中的混合粒子变成陶瓷粒子(烧结体粒子)的工序。此时，由于抗融合剂介于混合粒子的粒子之间，因此即使曝露在烧结工序中的高温条件下，也能防止羟基磷灰石一次粒子彼此的融合。
所述烧结工序中的烧结温度只要设定为可使陶瓷粒子的硬度达到所需的硬度即可，并无特别限定。例如，优选的烧结温度是100℃～1800℃，更优选的是150℃～1500℃，最优选的是200℃～1200℃。此外，烧结时间只要以所需的陶瓷粒子硬度等为基准适当设定即可。
此外，对于此烧结工序中所使用的装置等并无特别限定，可适当使用市场上销售的煅烧炉。
<4.去除工序>
去除工序是为了去除介于通过烧结工序获得的烧结体粒子的粒子间的抗融合剂的工序。
关于具体的去除手段、方法并无特别限定，只要根据所述混合工序中所使用的抗融合剂而适当采用即可。例如，当使用在溶剂中具有溶解性的抗融合剂时，通过使用不溶解羟基磷灰石粒子(非溶解性)，且能溶解抗融合剂(溶解性)的溶剂，可以仅溶解去除抗融合剂。
对于所使用的溶剂无特别限定，只要是满足所述条件的溶剂即可，可为水系溶剂，也可为有机溶剂。在此去除工序中，就无需使用有机溶剂时所必需的设备、无需处理有机溶剂的废液时所必需的设备、制造作业的安全性较高以及对环境的风险较低等理由而言，使用水系溶剂为优选。
例如，作为水系溶剂，可优选使用水、乙醇或甲醇等。另外，作为有机溶剂，可优选使用丙酮或甲苯等。
另外，为了提高抗融合剂的溶解性，所述水系溶剂含有草酸盐、乙二胺、联吡啶、乙二胺四乙酸盐等螯合物为佳。而且，为了提高抗融合剂的溶解性，所述水系溶剂含有氯化钠、硝酸铵、碳酸钾等的电解质离子为佳。
此外，由于羟基磷灰石(HAp)的烧结体粒子在pH值为4.0以下的条件下会溶解，因此优选在pH值为4.0～12.0的条件下进行去除工序。
当使用溶剂去除抗融合剂时，只要将通过烧结工序获得的含有抗融合剂的烧结体粒子群悬浮于溶剂中，再利用过滤或离心分离仅回收羟基磷灰石粒子即可。在所述羟基磷灰石粒子的制造方法中，所述去除工序并不限于进行1次，也可进行2次以上。通过多次进行所述去除工序，会进一步提高羟基磷灰石粒子间的抗融合剂的去除率。
除了所述用溶剂去除抗融合剂的方法以外，也可以使用磁性体作为抗融合剂，从而利用磁铁去除抗融合剂。更具体而言，可以将通过烧结工序获得的含有抗融合剂的烧结体粒子群悬浮并分散于适当的溶剂(水等)中，再对此悬浮液施加磁力，从而仅使抗融合剂吸附于磁铁上，并只回收未吸附的羟基磷灰石粒子即可。另外，也可以不将烧结体粒子群悬浮于溶剂中，可以将烧结体粒子磨碎而使其变成粉末后，利用磁铁来分离抗融合剂。
在去除工序中，包括用于使羟基磷灰石粒子的粒径变得均匀的分级工序为佳。对于所述分级工序并无特别限定，只要是能使羟基磷灰石粒子的粒径变得均匀的工序即可。例如，可利用过滤器过滤、离心分离等进行分级，但并不限定于此等方法。
通过以上工序可制作出用于涂覆基材表面的羟基磷灰石粒子。
<5.表层形成工序>
表层形成工序是，利用通过上述一系列工序获得的羟基磷灰石粒子涂覆基材，并由此在基材上形成表层的工序。换言之，表层形成工序是形成具有基材与表层的载体的工序。
表层形成工序只要是可在基材上形成表层，而形成含有基材与表层的载体的工序即可，对其具体构成并无特别限定。例如，可将所述羟基磷灰石粒子溶解于适当的溶剂中，再将基材分散于所述溶液中。
对于所述溶剂并无特别限定，例如可使用水系溶剂或有机溶剂。更具体而言，作为水系溶剂，可优选使用水、乙醇或甲醇等，作为有机溶剂，可优选使用丙酮或甲苯等。
优选的，对含有羟基磷灰石粒子以及基材的溶剂进行超声波处理。通过进行超声波处理，可在所述基材的整个表面形成厚度更加均匀的表层。此外，对于所述超声波处理的具体条件并无特别限定。另外，施加超声波的装置也可适当使用市场上销售的装置。
在表层形成工序中，优选包括如下工序：经所述超声波处理后，对涂覆了羟基磷灰石粒子的基材(载体)进行分离并清洗，然后干燥此载体。
对于分离所述载体的工序并无特别限定，例如，可优选通过离心分离或过滤器过滤将所述载体分离。另外，所述载体可使用溶剂来进行清洗。对所述溶剂并无特别限定，例如可优选使用水系溶剂或有机溶剂。更具体而言，作为水系溶剂，可优选使用水、乙醇或甲醇等，作为有机溶剂，可优选使用丙酮或甲苯等。
优选对经清洗后的载体进行干燥。对干燥方法并无特别限定，例如可在室温下进行干燥，也可通过加热至所需温度来进行干燥。
通过以上工序，可制作具备后述的细胞的载体。
此外，通过以上工序所形成的载体是颗粒状载体。此外，本说明书中的“颗粒状”是指，用注射器可投予的那种程度的大小及形状的微细的粒子。对于此粒子的形状并无特别限定，优选的有球状、棒状、针状、鳞片状、布状、薄片状或这些形状的组合形状。
具体而言，所述载体的优选的粒径是0.01μm～5cm，更优选的是1μm～1mm。在载体的大小小于10μm，则本实施方式的医疗用组合物存在易进入毛细血管的倾向，在载体的大小大于200μm，则医疗用组合物易发生凝聚，换言之，用注射器投予到生物体中时，会出现堵塞注射针的倾向。因此，所述载体的最优选的粒径是10μm～200μm。此外，在所述粒径为1mm以下时，则可用注射器容易地投予给生物体。另外，关于所述粒径大于1mm的载体，也可通过切开移植来投予给生物体。
此外，所述载体的粒径可通过众所周知的方法进行测定。例如可使用动态光散射法或电子显微镜，与上述一次粒子同样地进行测定。
[1-3.细胞]
在本实施方式的医疗用组合物中，在通过以上工序所形成的载体上具备细胞。
对于所述细胞只要是可诱导血管生成的细胞即可，并无特别限定。例如，所述细胞可优选使用选自由骨髓单核细胞、外周血单核细胞、多能干细胞、造血干细胞、血管内皮祖细胞、诱导多能干细胞、胚胎干细胞、血小板以及间充质干细胞所组成群中的至少一种细胞。尤其是，骨髓单核细胞、外周血单核细胞、多能干细胞、造血干细胞以及血管内皮祖细胞是，在人或动物体内已表现出血管生成疗法的有效性的细胞，因此更为优选。另外，就细胞的供给源的观点而言，诱导多能干细胞及胚胎干细胞不会对患者造成负担，因此更为优选。
对于将所述细胞设置于载体表面的方法并无特别限定，例如，优选的是利用所述细胞与所述表层之间的相互作用来设置。所述相互作用并无特别限定，例如，可利用交联剂将细胞固定在载体上，也可通过细胞的附着能力使细胞附着到载体上，还可通过羟基磷灰石的吸附能力将细胞吸附到载体上。另外，也可利用多种所述相互作用而将细胞固定到载体上。此外，对于所述交联剂并无特别限定，可适当使用众所周知的交联剂。另外，置于载体表面的细胞可直接存在于载体表面，也可间隔其他细胞而间接地设置于载体表面。即，也可将包含多个细胞的细胞块中的一部分细胞固定在载体上，由此将此细胞块整体设置于载体表面。另外，当使用多孔质载体时，也可将细胞设置在孔内。
对于将所述细胞固定在载体上的具体方法并无特别限定，例如，可优选将所述载体与细胞混合，更优选在所述载体上以规定时间培养细胞。培养时，对培养时间并无特别限定，例如，可优选培养0.1小时～24小时。如果采用所述培养时间，则可使细胞更牢固地附着于载体上。另外，如果采用所述培养时间，则会使经附着的细胞增殖，以此能增强本实施方式的医疗用组合物的血管生成作用。
对于载体与此载体上所具备的细胞的比率并无特别限定，例如，优选的载体与细胞的重量比可以是1/10～10/1。如果此重量比为1/10以上，则载体上会具备足够数量的细胞，从而能有效地使血管生成。另外，如果此重量比为10/1以下，则不仅能有效地使血管生成，而且还能切实地防止羟基磷灰石等在生物体内引发的副作用(例如炎症等)。
此外，在本实施方式的医疗用组合物中，除了所述细胞以外，在所述载体的表面具备各种生理活性物质为佳。
至于所述生理活性物质并无特别限定，例如，优选的是选自由抗炎症剂、血管生成细胞因子、抗生素及细胞生长因子所组成的群中的至少一种生理活性物质。例如，如果在载体上具备血管生成细胞因子，则能更有效地诱导血管生成。另外，如果在载体上具备抗炎症剂，则即使将大量的医疗用组合物投予到生物体内时，也能防止炎症的发生。另外，如果在载体上具备抗生素，则能防止各种二次感染等。另外，如果在载体上具备细胞生长因子，则不仅能使血管生成，而且视需要也能再生各种细胞(各种组织)。
例如，作为所述血管生成细胞因子并无特别限定，例如，优选为选自由aFGF(acidic fibroblast growth factor，酸性成纤维细胞生长因子)、bFGF(basic fibroblast growth factor，碱性成纤维细胞生长因子)、VEGF(vascular endothelial growth factor，血管内皮生长因子)、HGF(hepatocyte growth factor，肝细胞生长因子)、PDGF(platelet-derived growth factor，血小板源性生长因子)，PIGF(placenta growth factor，胎盘生长因子)、TNF(tumornecrosis factor，肿瘤坏死因子)、EGF(epidermal growth factor，表皮生长因子)、血管生成素(angiopoietin)、IL(interleukin，白细胞介素)、HAPO(hemangiopoietin，人促血液血管细胞生成素)、Shh(sonic hedgehog，音猬因子)、TGF-β(transforming growthfactor-beta，转化生长因子β)、G-CSF(granulocyte-colonystimulating factor，粒细胞集落刺激因子)、M-CSF(macrophage-colony stimulating factor，巨噬细胞集落刺激因子)、SCF(stem cell factor，干细胞因子)、EPO(erythropoietin，促红细胞生成素)、TPO(thrombopoietin，促血小板生成素)以及Flt(FMS-like tyrosine kinase，FMS样酪氨酸激酶)所组成的群中的至少一种细胞因子。根据所述构成，与在载体上仅具备细胞的情形相比，可更有效地诱导血管生成。
此外，将所述生理活性物质设置于载体表面的方法并无特别限定，例如，可优选通过所述细胞与所述表层之间的相互作用来设置。所述相互作用也无特别限定，例如，可以利用交联剂将生理活性物质固定在载体上，也可以利用羟基磷灰石的吸附能力使所述生理活性物质吸附在载体上。另外，还可以利用多种所述相互作用使生理活性物质固定在载体上。此外，对于所述交联剂也没有无特别限定，可适当使用众所周知的交联剂。
〔2.医疗用试剂盒〕
本实施方式所涉及的医疗用试剂盒具备所述的本发明的医疗用组合物，以及用于将此医疗用组合物投予到生物体(例如患者)内的注射器。此外，本实施方式的医疗用试剂盒尤其适用为血管生成用试剂盒。
关于医疗用组合物，上文已经进行了说明，因此在此省略其说明。
所述注射器并无特别限定，只要是通过针将所述医疗用组合物投予到生物体内的注射器即可。例如，所述注射器不仅包括一般注射器，还包括导管及点滴等。
另外，在本实施方式所涉及的医疗用试剂盒中，除了注射器以外，视需要也可追加各种构成。而对于此各种构成并无特别限定，例如优选为选自由注射针、消毒药、覆盖布及手术刀所组成的群中的至少一种。如果是含有此等构成的医疗用试剂盒，则可更简便且安全地将本发明所提供的医疗用组合物投予到生物体内。
根据本实施方式所涉及的医疗用试剂盒，则可用注射器将医疗用组合物投予到体内。即，患者自己也能容易地将医疗用组合物投予到局部体内。
另外，优选的，本实施方式所涉及的医疗用试剂盒具备可用作注射液的各种液体。所述液体只要是可溶解本发明所提供的医疗用组合物并且对生物体的毒性低的液体即可。例如，作为所述液体可列举生理盐水等，但并不限定于此。
〔3.医疗用组合物的制造方法〕
本实施方式所涉及的医疗用组合物的制造方法包括混合颗粒状载体和细胞的工序，其中此颗粒状载体具有由生物体吸收性高分子构成的基材，以及设置在此基材上且由羟基磷灰石构成的表层。
关于所述生物体吸收性高分子、基材、表层、载体及细胞的具体构成，上文已进行了说明，因此在此省略其说明。
在所述工序中载体与细胞混合，由此使载体的表面具备细胞。此外，载体的表面所具备的细胞可直接存在于载体表面，也可间隔其他细胞而间接地存在于载体表面。
进行所述工序的具体方法并无特别限定。例如，在液体(例如液体培养基、生理盐水、磷酸缓冲液等缓冲液)中混合所述载体与所述细胞即可。
在所述工序中，载体的每1个粒子优选与1×1010个以下的细胞混合，再优选与1×108个以下的细胞混合，更优选与1×106个以下的细胞混合，最优选与1×104个以下的细胞混合。根据所述构成，可较佳地诱导血管生成，并且可抑制炎症等副作用。
此外，通过本实施方式的制造方法所制造的医疗用组合物，即本发明所提供的医疗用组合物，也包括在所述工序中混合了载体与细胞时的状态的液体。即，本发明所提供的医疗用组合物中可含有未直接附着在载体上的细胞。
[实施例]
在以下实施例中，为了简便地研究本发明所提供的医疗用组合物的血管生成效果，对使用了聚乳酸膜的构成与使用了聚乳酸粒子的构成这两种构成进行了研究。使用了聚乳酸膜的构成与使用了聚乳酸粒子的构成在血管生成方面表现出同等效果，但就投予的容易性、投予时是否产生伤痕、治疗此伤痕的必要性等观点而言，使用聚乳酸粒子的构成更为优异。关于所述情况，可通过以下具体的记载而容易地得以理解。
[1.羟基磷灰石粒子的制作]
向设置有冷凝器及半月形搅拌翼的1L烧瓶中注入利用氨水将pH值调整成12.0的Ca(NO3)2水溶液(42mN，800mL)，并保持在80℃的条件下。
在80℃条件下以10mL/h的速度向所述烧瓶中添加利用氨水将pH值调整成12.0的(NH4)2HPO4水溶液(100mN，200mL)，反应24小时。由此制成羟基磷灰石的一次粒子。
将1.0g的羟基磷灰石的一次粒子分散至含有1.0g聚丙烯酸(ALDRICH公司制造，重量平均分子量为15,000g/mol)的pH值为12.0的水溶液100mL中，由此使聚丙烯酸吸附到所述一次粒子的表面上。关于所述工序，以下将进行更详细的说明。
首先，将1.0g聚丙烯酸(ALDRICH公司制造，重量平均分子量为15,000g/mol)溶解到纯水100mL中。接着，在室温下一边进行搅拌一边添加氨水溶液(25％水溶液)，由此将聚丙烯酸水溶液的pH值调整到12.0。此外，使用堀场制作所股份有限公司制造的pH值计D-24SE测定了此水溶液的pH值。接着，将1.0g羟基磷灰石的一次粒子分散至此水溶液100mL中之后，向此分散液中添加了0.12mol/L的硝酸钙(Ca(NO3)2)水溶液100mL，由此使聚丙烯酸钙析出至一次粒子的表面上。此外，此聚丙烯酸钙发挥出抗融合剂的功能。
回收所生成的沉淀物，在减压(约0.1Pa)且80℃的条件下进行了干燥，由此获得了混合粒子。
将此混合粒子放入坩埚中，在800℃的烧结温度下煅烧1小时。此时，聚丙烯酸钙热分解成氧化钙(CaO)。
此外，烧结工序结束后的氧化钙(CaO)的残存率为25％以上。
接着，将通过所述烧结工序获得的烧结体粒子悬浮于50mmol/L硝酸铵(NH4NO3)水溶液500mL中，其后通过离心分离将此烧结体粒子分离，并清洗。接着，将所述烧结体粒子悬浮到蒸馏水中之后，同样地进行分离、清洗，由此去除了抗融合剂及硝酸铵，并回收了羟基磷灰石粒子(羟基磷灰石纳米结晶)。
利用动态光散射法测定了所述羟基磷灰石粒子的粒径。此外，动态光散射的测定是，使用大塚电子股份有限公司制造的动态光散射光度计DLS-6000，且在室温、10ppm的粒子浓度、散射角90°的条件下进行测定的。其结果为，所述羟基磷灰石粒子的粒径分布在60nm～100nm之间，并且此时的粒径的变异系数较小，为11％。此结果显示，所述纳米结晶是具有均匀粒径(粒径分布狭小)的粒子群。
[2.羟基磷灰石/聚乳酸膜复合物的制作]
将聚乳酸无纺布膜(厚度为140μm，单位面积重量为20g/m2，撕裂强度为3N)在氨水溶液(pH值为12.0)中浸渍30分钟，由此在聚乳酸无纺布膜表面导入了羧基。利用水及乙醇清洗了所述处理后的聚乳酸粒子。
将通过实施例1中所制作的羟基磷灰石粒子以2重量％的浓度分散至乙醇中。
将经清洗的聚乳酸无纺布膜浸渍于分散有所述羟基磷灰石粒子的乙醇中，在室温下进行了5分钟的超声波照射(超声波照射器：NND股份有限公司制造的US-2，功率：120W，频率：38kHz)。在室温下放置30分钟后，利用乙醇清洗可聚乳酸无纺布膜，然后在室温下进行了干燥。
利用扫描型电子显微镜观察了所制作的羟基磷灰石/聚乳酸膜复合物，结果确认到聚乳酸膜的表面上均匀地涂覆有羟基磷灰石粒子。另外，羟基磷灰石粒子在聚乳酸膜表面的被覆率约为40％。此外，扫描型电子显微镜使用的是日本电子股份有限公司制造的JSM-6301F，以9万倍的倍率观察了羟基磷灰石/聚乳酸膜复合物。
[3.羟基磷灰石/聚乳酸粒子复合物的制作]
在室温下利用乙醇清洗了聚乳酸粒子(粒径为100μm)。接着，将通过实施例1中所制作的羟基磷灰石粒子以2重量％的浓度分散至乙醇中。
将经清洗的聚乳酸粒子浸渍于分散有所述羟基磷灰石粒子的乙醇中，在室温下进行了5分钟的超声波照射(超声波照射器：NND股份有限公司制造的US-2，功率：120W，频率：38kHz)。在室温下放置30分钟后，利用乙醇清洗了聚乳酸粒子，然后在室温下进行了干燥。
利用扫描型电子显微镜观察了所制作的羟基磷灰石/聚乳酸粒子复合物，结果确认到聚乳酸粒子的表面上均匀地涂覆有羟基磷灰石纳米结晶。另外，羟基磷灰石粒子在聚乳酸粒子表面的被覆率大致为100％。此外，扫描型电子显微镜使用的是日本电子股份有限公司制造的JSM-6301F，以9万倍的倍率观察了羟基磷灰石/聚乳酸粒子复合物。
[4.骨髓细胞对羟基磷灰石/聚乳酸膜复合物的附着性]
在实施例2及3中所制作的羟基磷灰石/聚乳酸膜复合物上以及羟基磷灰石/聚乳酸粒子复合物上，培养骨髓细胞2.5小时。此外，使用不具备羟基磷灰石粒子的聚乳酸膜或聚乳酸粒子作为对照。
培养后，利用磷酸缓冲液/戊二醛固定羟基磷灰石/聚乳酸膜复合物上以及羟基磷灰石/聚乳酸粒子复合物上所附着的骨髓细胞，其后将羟基磷灰石/聚乳酸膜/骨髓细胞复合物依次浸渍到50％乙醇水溶液、100％乙醇水溶液中而进行了脱水处理。
接着，对羟基磷灰石/聚乳酸膜/骨髓细胞复合物以及羟基磷灰石/聚乳酸粒子/骨髓细胞复合物进行丁醇处理及冷冻干燥后，利用扫描型电子显微镜进行了观察。图1()表示聚乳酸粒子的结果，图1(b)表示羟基磷灰石/聚乳酸粒子的结果。而且，图1(c)表示聚乳酸膜的结果，图1(d)表示羟基磷灰石/聚乳酸膜的结果。
如图1(a)以及图1(c)所示，在不具备羟基磷灰石粒子的聚乳酸粒子及聚乳酸膜上未发现骨髓细胞，相对于此，如图1(b)及图1(d)所示，在羟基磷灰石/聚乳酸粒子复合物上以及羟基磷灰石聚乳酸膜上观察到了许多粒状骨髓细胞。此外，扫描型电子显微镜使用的是日本电子股份有限公司制造的JSM-6301F，以300倍的倍率观察了羟基磷灰石/聚乳酸膜/骨髓细胞复合物。
另外，在实施例2中所制作的羟基磷灰石/聚乳酸膜复合物上，培养L929细胞6天。此外，使用未被羟基磷灰石粒子被覆的聚乳酸膜作为阴性对照。
培养6天后，利用胰蛋白酶分别对羟基磷灰石/聚乳酸膜/L929细胞复合物以及聚乳酸膜/L929细胞复合物进行了处理，其后利用光学显微镜观察了L929细胞的附着状态。
图2(a)表示进行胰蛋白酶处理前的聚乳酸膜/L929细胞复合物，图2(b)表示进行胰蛋白酶处理后的聚乳酸膜/L929细胞复合物。另外，图2(c)表示进行胰蛋白酶处理前的羟基磷灰石/聚乳酸膜/L929细胞复合物，图2(d)表示胰蛋白酶处理后的羟基磷灰石/聚乳酸膜/L929细胞复合物。
如图2(a)～图2(d)所示，明确到L929细胞易从未被羟基磷灰石粒子被覆的聚乳酸膜上剥离，但L929细胞不易从被羟基磷灰石粒子被覆的聚乳酸膜上剥离。即，可明确由羟基磷灰石粒子被覆的纳米基材上的细胞表现出如即使进行胰蛋白酶处理也不容易剥离的牢固附着性。
[5.骨髓细胞对羟基磷灰石/聚乳酸粒子复合物的附着性]
在实施例3中所制作的羟基磷灰石/聚乳酸粒子复合物上，培养骨髓细胞2.5小时。
培养后，利用磷酸缓冲液/戊二醛固定羟基磷灰石/聚乳酸粒子复合物上所附着的骨髓细胞，其后将羟基磷灰石/聚乳酸粒子/骨髓细胞复合物依次浸渍到50％乙醇水溶液、100％乙醇水溶液中而进行了脱水处理。
接着，对羟基磷灰石/聚乳酸粒子/骨髓细胞复合物进行丁醇处理及冷冻干燥后，利用扫描型电子显微镜观察了羟基磷灰石/聚乳酸粒子/骨髓细胞复合物。其结果为，与羟基磷灰石/聚乳酸膜复合物的情形相同，在羟基磷灰石/聚乳酸粒子复合物上也观察到了许多粒状骨髓细胞。此外，扫描型电子显微镜使用的是日本电子股份有限公司制造的JSM-6301F，以300倍的倍率观察了羟基磷灰石/聚乳酸粒子/骨髓细胞复合物。
[6.羟基磷灰石/聚乳酸膜/骨髓细胞复合物的血管生成增强作用]
通过众所周知的大腿动脉切除法制作下肢缺血模型小鼠，将膜状的羟基磷灰石/聚乳酸膜/骨髓细胞复合物以及羟基磷灰石/聚乳酸膜复合物分别附着到切除了大腿动脉的下肢的肌肉表面上，之后缝合皮肤(参照图3(a))。另外，使用注射器将颗粒状的羟基磷灰石/聚乳酸粒子/骨髓细胞复合物以及羟基磷灰石/聚乳酸粒子复合物分别投予到肌肉内(参照图3(b))。投予2周后，利用扫描型显微镜确认了有无血管生成。
在投予2周后打开投予部位并进行了观察，可确认羟基磷灰石/聚乳酸膜/骨髓细胞复合物，以及羟基磷灰石/聚乳酸膜复合物已分别被投予到组织下。
接着，经确认有无血管生成的结果，如图4(a)～图4(c)所示，当投予了羟基磷灰石/聚乳酸粒子/骨髓细胞复合物或羟基磷灰石/聚乳酸膜/骨髓细胞复合物时，在此复合物的表面附近发现了大量的血管生成。具体而言，由图4(a)及图4(b)的虚线所包围的区域表示投予了羟基磷灰石/聚乳酸粒子/骨髓细胞复合物或羟基磷灰石/聚乳酸膜/骨髓细胞复合物的部位，在此部位发现了大量的血管生成。此外，图4(c)是发生血管生成的部位的放大照片。
另一方面，图5是羟基磷灰石/聚乳酸粒子复合物或羟基磷灰石/聚乳酸膜复合物的投予部位的显微镜照片，在羟基磷灰石/聚乳酸膜复合物的投予部位未发现血管生成。
在使用了立体显微镜的观察中，当投予了羟基磷灰石/聚乳酸粒子/骨髓细胞复合物或羟基磷灰石/聚乳酸膜/骨髓细胞复合物时，在此复合物的内外也发现大量的血管生成。例如，图6(c)是羟基磷灰石/聚乳酸膜/骨髓细胞复合物的投予部位的显微镜照片，在此投予部位确认到血管生成。另外，图6(d)是焦点对准到所投予的羟基磷灰石/聚乳酸膜/骨髓细胞复合物时的显微镜照片，白色箭头表示骨髓细胞。即，可确认当投予了羟基磷灰石/聚乳酸膜/骨髓细胞复合物时，即使移植后经过了2周，附着于复合物上的骨髓细胞仍停留在羟基磷灰石/聚乳酸膜复合物的表面。
另一方面，如图6(a)所示，当投予了羟基磷灰石/聚乳酸膜复合物时，在此复合物的附近未发现血管生成。而且，如图6(b)所示，当投予了羟基磷灰石/聚乳酸膜复合物时，在此复合物的附近未确认到骨髓细胞。
根据以上所述，可明确羟基磷灰石/聚乳酸膜/骨髓细胞复合物及羟基磷灰石/聚乳酸粒子/骨髓细胞复合物具有高的血管生成作用，并且可长时间地保持所附着的细胞(例如骨髓细胞)的存活状态。
另外，在显微镜观察下测定了在羟基磷灰石/聚乳酸膜/骨髓细胞复合物以及羟基磷灰石/聚乳酸膜复合物的投予部位所观察到的血管长度的合计长度。如图7所示，可明确羟基磷灰石/聚乳酸膜/骨髓细胞复合物的投予部位所存在的血管的合计长度是羟基磷灰石/聚乳酸膜复合物的投予部位上所存在的血管的合计长度的约3倍。由此也可明确羟基磷灰石/聚乳酸膜/骨髓细胞复合物诱导了血管生成。
羟基磷灰石/聚乳酸粒子/骨髓细胞复合物及羟基磷灰石/聚乳酸膜/骨髓细胞复合物在血管生成效果方面表现出大致相同的效果，但就投予的容易性、投予时是否产生伤痕、治疗此伤痕的必要性等观点而言，羟基磷灰石/聚乳酸粒子/骨髓细胞复合物更为优异。因此，对羟基磷灰石/聚乳酸粒子/骨髓细胞复合物的效果进行了更详细的研究。
[7.羟基磷灰石/聚乳酸粒子/骨髓细胞复合物的血管生成增强作用]
使用BALB/C小鼠，通过众所周知的方法制作缺血肢，利用注射器向切除了大腿动脉的下肢的肌肉中分别仅投予了羟基磷灰石/聚乳酸粒子/骨髓细胞复合物、羟基磷灰石/聚乳酸粒子复合物、骨髓细胞。其后，观察了缺血下肢的预后。此外，骨髓细胞是从所移植的小鼠之外的其他BALB/C小鼠上采集的。
如图8(a)所示，在仅投予了羟基磷灰石/聚乳酸粒子复合物或骨髓细胞的小鼠中，观察到有下肢脱落、坏死的小鼠。另一方面，在对投予了羟基磷灰石/聚乳酸粒子/骨髓细胞复合物的小鼠中，观察到了下肢的恢复。此外，通过乘积极限法(kaplan-meier method)详细地分析小鼠的生存率，将所得结果示于图8(b)中。从图8(b)明确到，投予了羟基磷灰石/聚乳酸粒子/骨髓细胞复合物的小鼠的下肢也得到了恢复。
此外，本发明并不限定于以上所说明的各构成，可在权利要求范围所示的范围内进行各种变更，将不同的实施方式或实施例中分别揭示的技术方法适当组合而获得的实施方式或实施例也包括在本发明的技术范围内。
[产业上的可利用性]
本发明所提供的医疗用组合物不仅能在血管被破坏的组织内使血管再生，而且在所需的组织内也能使血管再生。因此，本发明所提供的医疗用组合物可用于外周动脉疾病(例如闭塞性动脉硬化症、伯格氏病(Buerger′s disease)、胶原性疾病及雷诺氏病(Raynaud′sdisease)等)，或顽固性溃疡(例如褥疮、糖尿病足(Diabetic foot)、胶原性疾病及缺血性溃疡等)的治疗(例如参照图9)。另外，根据本发明，尤其可提供一种目的在于利用注射器投予的医疗用组合物。特别是，本发明提供的医疗用组合物及医疗用试剂盒可用作血管生成用组合物(血管再生用组合物)及血管生成用试剂盒(血管再生用试剂盒)。

Claims (8)

1.一种血管生成用的医疗用组合物，其特征在于包含：
颗粒状载体，其具有由生物体吸收性高分子所构成的基材，以及形成在所述基材上且由羟基磷灰石所构成的表层；
可诱导血管生成的细胞，其置于所述载体的表面；
所述细胞是骨髓单核细胞，
使所述载体的每1个粒子与1×1010个以下的所述细胞混合。
2.根据权利要求1所述的血管生成用的医疗用组合物，其特征在于：
所述载体的粒径为10μm～200μm。
3.根据权利要求1所述的血管生成用的医疗用组合物，其特征在于：
所述载体为多孔质载体。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的血管生成用的医疗用组合物，其特征在于：
所述生物体吸收性高分子是选自聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙二醇、聚羟基丁酸酯、聚碳酸酯、聚酰胺、纤维素、甲壳素、壳聚糖、淀粉、聚谷氨酸、聚对二氧环己酮、氰基丙烯酸酯聚合物、聚己内酯、合成多肽、玻尿酸、聚苹果酸、聚丁二酸丁二酯，以及由此等物质组合而成的共聚物所组成的群中的至少一种。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的血管生成用的医疗用组合物，其特征在于：
所述载体的表面具备血管生成细胞因子。
6.根据权利要求5所述的血管生成用的医疗用组合物，其特征在于：
所述血管生成细胞因子是选自由aFGF、bFGF、VEGF、HGF、PDGF、PIGF、TNF、EGF、血管生成素、IL、HAPO、Shh、TGF-β、G-CSF、M-CSF、SCF、EPO、TPO以及Flt所组成的群中的至少一种细胞因子。
7.一种医疗用试剂盒，其特征在于具备：
权利要求1至6中任一项所述的血管生成用的医疗用组合物；以及
用于将所述血管生成用的医疗用组合物投予到生物体中的注射器。
8.一种血管生成用的医疗用组合物的制造方法，其特征在于包括：
混合颗粒状载体与可诱导血管生成的细胞的工序，
其中，所述颗粒状载体具有由生物体吸收性高分子所构成的基材以及形成在所述基材上且由羟基磷灰石所构成的表层；
在所述工序中，使所述载体的每1个粒子与1×1010个以下的所述细胞混合，
所述细胞是骨髓单核细胞。
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