CN104707173A - 一种三维细胞培养平台、其制备方法及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明实施例公开了一种三维细胞培养平台、其制备方法及其使用方法。其中，三维细胞培养平台包括：成骨支架，聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球，胰岛素；所述成骨支架为网状结构，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球附着于所述成骨支架上，所述胰岛素包裹于所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球中，基于所三维细胞培养平台的总质量，所述胰岛素的质量分数为0.5‰～5‰。利用该三维细胞培养平台进行BMSCs培养时，BMSCs的细胞活力，成骨因子的表达显著高于羟基磷灰石等常规材料，因此可以实现持续促进BMSCs成骨分化。

Description

一种三维细胞培养平台、其制备方法及其使用方法

技术领域

本发明涉及骨组织工程领域，特别涉及一种三维细胞培养平台、其制备方法及其使用方法。

背景技术

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stromal cells，BMSCs)具有体外易增殖、多向分化、分泌促生长因子及免疫调节的能力，是当前最理想的骨组织工程种子细胞，可以用来修复骨缺损。但是，在无成骨诱导的情况下，将BMSCs单独注射入体内，其并不能在体内实现成骨转化，无法有效修复骨缺损。

研究表明，通过转基因技术或重组蛋白技术在BMSCs的基因组中加入成骨基因或骨形态发生蛋白-2(BMP-2)，骨形态发生蛋白7(BMP-7)，再将BMSCs结合于成骨支架植入动物体内，可以修复自体不能愈合的临界骨缺损。其中，通过转基因技术干预BMSCs已在动物体内取得了良好的成骨效果，但这种通过转基因增强BMSCs体内成骨的技术并不适用于临床。因为该技术使用腺病毒，质粒等载体将外源基因导入患者的BMSCs，改变了患者本身BMSCs的基因型，存在较大的生物安全隐患，可能产生不可预见的生物学后果。而采用重组蛋白技术，通过在BMSCs的基因组中加入BMP-2，BMP-7等成骨蛋白来促进BMSCs向成骨分化，由于BMP-2，BMP7本身成骨作用过强，效果无法调控，潜在的致瘤性，未获得国内CFDA卫生安全批号。

为解决上述的转基因技术或重组蛋白技术的安全性问题，人们开始研究利用地塞米松，抗坏血酸及甘油磷酸钠配所组成的成骨诱导分化液在体外诱导BMSCs向成骨分化，然后再将有成骨分化倾向的BMSCs结合于成骨支架植入动物体内，修复骨缺损。但是，有成骨分化倾向的BMSCs在体内想要完成成骨转化，还要继续接受成骨诱导分化液的诱导，因此成骨支架一般采用具有多孔特性的材料，例如羟基磷灰石，羟基磷灰石的孔隙可以吸附一定量的成骨诱导分化液从而在体内继续促进BMSCs的成骨转化。但是，吸附在羟基磷灰石孔隙中的成骨诱导分化液在体内很快被血液稀释，其成分中的地塞米松在血液中的半衰期仅为90分钟，抗坏血酸在体内迅速被氧化。因此，上述传统成骨诱导液不能在体内长期稳定的促进BMSCs成骨分化。同时，大量的研究已经证明，地塞米松尽管能够促进BMSCs成骨转化，但是会抑制BMSCs的增殖，并不利于骨缺损的修复。

发明内容

为解决上述问题，本发明实施例公开了一种三维细胞培养平台、其制备方法及其使用方法。技术方案如下：

一种三维细胞培养平台，包括：成骨支架，聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球，胰岛素；所述成骨支架为网状结构，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球附着于所述成骨支架上，所述胰岛素包裹于所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球中，基于所三维细胞培养平台的总质量，所述胰岛素的质量分数为0.5‰～5‰，优选为0.5‰～3‰，更优选为0.5‰～1‰。

其中，所述成骨支架的孔隙率为80％～85％，孔径大小为100～200μm。

其中，基于所述三维细胞培养平台的总质量，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球的质量分数为0.5％～5％，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球的粒径1～5μm。

一种制备如权利要求1所述的三维细胞培养平台的方法，包括以下步骤：

(1)制备含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球

将胰岛素和琥珀酰明胶溶解于pH值为1.5～3的乙酸水溶液中作为第一水相W1，将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于二氯甲烷溶剂中作为油相O，将聚乙烯醇和氯化钠溶解于水中第二水相W2；其中，琥珀酰明胶和胰岛素的质量比为1：(3～8)；胰岛素与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为1：(5～15)；

将第一水相W1和油相O进行初乳化，制成W1/O型初乳液；将W1/O型初乳液与第二水相W2进行复乳化，制成W1/O/W2型乳液；

将制得的W1/O/W2型乳液稀释于水中，通过离心得到含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球；

(2)制备成骨支架

将质量比为1：(1.5～3)的牛腱胶原和羟基磷灰石分别溶解于乙酸中，制成牛腱胶原乙酸溶液和羟基磷灰石乙酸溶液；在0～5℃的条件下，将羟基磷灰石乙酸水溶液加入到牛腱胶原乙酸水溶液中，得到混合溶液，并调节混合溶液的pH值为7.2±0.2；加入戊二醛水溶液，搅拌均匀后真空脱气，然后在-20～-30℃的条件下静置15～30小时以形成成骨支架，最后将成骨支架真空干燥；

(3)制备三维细胞培养平台

将含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球分散于中性磷酸盐缓冲溶液中，然后向其中加入成骨支架，所述含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球与成骨支架的质量比为1：(10～20)，采用负压抽吸法将含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球吸入成骨支架的网状结构，干燥，得到三维细胞培养平台。

其中，用于溶解牛腱胶原和羟基磷灰石的乙酸水溶液的pH值为2～5。

其中，所述第一水相W1中，胰岛素的浓度为1：(10～20)mg/mL；所述第二水相W2中聚乙烯醇和氯化钠的浓度分别为(5～15)mg/mL和(5～15)mg/mL。

其中，初乳化时，乳化线速度为20～40m/s，乳化时间为30～100s；复乳化的乳化的线速度为0.6～1.5m/s，乳化时间为30～100s。

其中，含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球质量与磷酸盐缓冲溶液的体积比为：(2～8)：1mg/mL。

其中，得到三维细胞培养平台后，将其按要求大小或骨缺损形状进行切割，经过钴60辐照灭菌后，得到无菌的三维细胞培养平台。

上述的三维细胞培养平台的使用方法，包括：

将骨髓间充质干细胞重悬以10⁷/cm³接种于三维细胞培养平台；

将接种了骨髓间充质干细胞的三维细胞培养平台整体放入培养瓶中，加入L-DMEM培养基+5％胎牛血清，37°，5％CO₂；骨髓间充质细胞1～4小时后完成贴壁；体外培养1～3天后细胞即可长至70％；在无菌操作条件下，将包含骨髓间充质干细胞的三维细胞培养平台直接置入骨缺损区，无张力缝合。

本发明通将羟基磷灰石,胶原和载胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球混合制作成一种可以持续释放胰岛素的三维细胞培养平台。利用该三维细胞培养平台进行BMSCs培养时，BMSCs的细胞活力，成骨因子的表达显著高于羟基磷灰石等常规材料，因此可以实现持续促进BMSCs成骨分化。该细胞培养平台所用原料均为临床已证明安全可降解，可直接裁剪成骨缺损形态。接种BMSCs后既可体外模拟自然骨培养，也可直接植入体内修复骨缺损，体内良好的成骨效果已在动物模型中得到证明。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为胰岛素释放曲线；其中，图1A为市售羟基磷灰石真空吸入吸入胰岛素的的释放曲线；图1B为实施例1制备三维细胞培养平台的胰岛素释放曲线；

图2为接种BMSCs前、后的纳米羟基磷灰石和三维细胞培养平台的扫描电镜图；其中，A为接种BMSCs前羟基磷灰石的扫描电镜图；B为接种BMSCs前实施例1制备三维细胞培养平台的扫描电镜图；C为接种BMSCs前羟基磷灰石的高倍镜下的扫描电镜图；D为接种BMSCs前实施例1制备三维细胞培养平台的高倍镜下的扫描电镜图；E为接种BMSCs后的羟基磷灰石的扫描电镜图；F为接种BMSCs后实施例1制备三维细胞培养平台的扫描电镜图；

图3为BMSCs在羟基磷灰石和实施例1制备的三维细胞培养平台中的生长曲线；

图4为BMSCs在羟基磷灰石和实施例1制备的三维细胞培养平台上的成骨基因表达结果示意图；

图5为BMSCs在羟基磷灰石和实施例1制备的三维细胞培养平台上的ALP含量与时间的关系图；

图6为BMSCs在羟基磷灰石和实施例1制备的三维细胞培养平台上的OCN含量与时间的关系图。

具体实施方式

发明人在实验过程中意外的发现，在一定浓度范围内胰岛素可同时促进BMSCs增殖和成骨分化，且这种促进作用随胰岛素作用时间的延长而持续增强。因此，可以用胰岛素来代替现有的含有地塞米松的成骨诱导分化液。但是，胰岛素在血中的半衰期只有不到十分钟，而对骨修复过程中骨初级骨是从缺损后的7到14天开始出现，约三个月才能完成骨痂的改建达到临床愈合的标准。为了避免在临床中对患者反复局部注射胰岛素，需要一种能够长期稳定缓释胰岛素的生物材料，和BMSCs一起植入骨缺损增强BMSCs对骨缺损的修复。

羟基磷灰石是常见的用作成骨支架的材料，采用真空吸附法直接负载胰岛素后测试其缓释能力，结果发现缓释时间均不足一周，即在骨修复尚未完全开始即缓释结束。另一种国内已批准临床应用的缓释材料为聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)微球，其物理结构与骨组织本身差异过大，物理性能与生物学骨结构差异过大，材料不能促进细胞粘附，不能提供骨引导作用。

因此，为了能够让具有促进BMSCs增殖和成骨分化作用的胰岛素在体内持续诱导BMSCs进行成骨分化，本发明提供了一种三维细胞培养平台，包括：成骨支架，聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球，胰岛素；其中：

成骨支架为网状结构，孔隙率为80％～85％，孔径大小为100～200μm；发明人发现，当成骨支架的孔径大小在上述的范围内时，三维支架能容纳高密度的细胞黏附，使得细胞间能够有机会接触紧密，有利于细胞间信号传递，更有利于BMSCs的增殖。同时，在上述孔隙率范围内的细胞支架可以为细胞的增殖和代谢活动提供了适宜的微环境，既能将各种生长因子等细胞外基质成分固守在细胞附近，又可以保持营养物质交换。因此，成骨支架中包含的胰岛素及细胞外基质对细胞增殖分化及代谢的调节作用，可以在支架培养中得以充分发挥。

聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球附着于成骨支架上，胰岛素包裹于所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球中，基于所三维细胞培养平台的总质量，胰岛素的质量分数为0.5‰～5‰，优选为0.5‰～3‰，更优选为0.5‰～1‰。此质量分数范围内的胰岛素可以充分激活附着于三维细胞培养平台上的骨髓间充质干细胞胰岛素受体，最有效的促进BMSCs增殖和成骨分化，质量分数过少，则不能达到最佳的促增殖和成骨分化的作用，过多时促进作用并没有明显增强，造成浪费。

基于所三维细胞培养平台的总质量，聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球的质量分数为0.5％～5％，聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球的粒径1～5μm，当聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球的粒径在上述范围内时，一方面可以更好的附着于成骨支架的孔隙中，另一方面，在上述范围内，其内部所包裹的胰岛素可以持续释放至大约三个月左右，能够保证BMSCs完成骨痂的改建达到临床愈合的标准。

本发明还提供了一种制备上述的三维细胞培养平台的方法，可以包括以下步骤：

(1)制备含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球：

将胰岛素和琥珀酰明胶溶解于pH值为1.5～3的乙酸水溶液中作为第一水相W1，将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于二氯甲烷溶剂中作为油相O，将聚乙烯醇和氯化钠溶解于水中第二水相W2；其中，琥珀酰明胶和胰岛素的质量比为1：(3～8)；胰岛素与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为1：(5～15)；

将第一水相W1和油相O进行初乳化，制成W1/O型初乳液；将W1/O型初乳液与第二水相W2进行复乳化，制成W1/O/W2型乳液；

将制得的W1/O/W2型乳液稀释于水中，通过离心得到含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球；

(2)制备成骨支架

将质量比为1：(1.5～3)的牛腱胶原和羟基磷灰石分别溶解于乙酸水溶液中，优选为pH值为2～5的乙酸水溶液，得到牛腱胶原乙酸水溶液和羟基磷灰石乙酸水溶液；在0～5℃的条件下，将羟基磷灰石乙酸水溶液加入到牛腱胶原乙酸水溶液中，得到混合溶液，并调节混合溶液的pH值为7.2±0.2；以0.25％(体积分数)的戊二醛交联30分钟，搅拌均匀后真空脱气，然后在-20～-30℃的条件下静止15～30小时以形成成骨支架，最后将成骨支架真空干燥。搅拌后倒入10ml离心管中，真空脱气后置于低温冰箱-30°24小时，以形成多孔支架，支架保存于真空干燥箱备用。

(3)制备三维细胞培养平台：

将含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球分散于中性磷酸盐缓冲溶液中，然后向其中加入成骨支架，所述含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球与成骨支架的质量比为1：(10～20)，采用负压抽吸法将含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球吸入成骨支架的网状结构，干燥，得到三维细胞培养平台。

所说的磷酸盐缓冲溶液也就是PBS缓冲溶液，每升PBS包含：(7.9g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na₂HPO₄)和1.8g K₂HPO₄，pH值至7.4，溶剂为蒸馏水)

所说的负压抽吸法，是指首先用循环水式真空泵在-0.1MPa下抽吸10分钟，将成骨支架内的空气吸出，利于携带缓释微球的磷酸盐溶液充分进入孔隙。之后使用旋转混匀仪混匀10分钟，进一步促进微球进入支架中孔隙。重复三次以使聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球充分吸附于成骨支架的网孔内侧壁。

所说的聚乳酸-羟基乙酸共聚物可以使用本领域常用的聚乳酸-羟基乙酸共聚物，本发明对其并无特殊的要求，例如，可以采用n(LA):n(GA)＝75:25，分子量为70KD的聚乳酸-羟基乙酸共聚物。

在本发明所提供的制备三维细胞培养平台的方法的一些具体实施方式中，第一水相W1中，胰岛素的浓度为1：(10～20)mg/mL；第二水相W2中聚乙烯醇和氯化钠的浓度分别为(0.5～2)mg/mL和(0.5～2)mg/mL，在这些参数下，更容易进行乳化得到含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球。需要说明的是，所说的“W1/O型初乳液”是指油包水型初乳液，“W1/O/W2型乳液”指的是三相复合乳液，即最内层是第一水相W1，中间是油相O，最外层是第二水相W2。

在本发明所提供的制备三维细胞培养平台的方法的一些具体实施方式中，初乳化时，乳化线速度为20～40m/s，乳化时间为30～100s；复乳化的乳化的线速度为0.6～1.5m/s，乳化时间为30～100s，上述的乳化条件下，可以控制聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球的粒径在1～5μm，且生成的微球的粒径更均匀。前期实验证明使用粒径大于10μm的微球将大幅降低单位质量细胞培养平台胰岛素的载药量，而粒径降低至500nm时释放速度加快，不足以达到缓释效果。同时相对均一的粒径的可保证单位质量细胞培养平台吸入的微球数量接近，提高使用的精确性和可重复性。

在本发明所提供的制备三维细胞培养平台的方法的一些具体实施方式中，含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球质量与磷酸盐缓冲溶液的体积比为：(2～8)：1mg/mL，在此条件下，更有利于聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球吸入成骨支架的网状结构中，微球质量与磷酸盐缓冲溶液的体积比过低，则吸附于成骨支架的网状结构中的微球量太少，如果微球质量与磷酸盐缓冲溶液的体积比过高，不仅造成药物的浪费，同时过高浓度的微球相互粘连堵塞在成骨支架浅层的网状结构中，使得微球无法进入更深层的网状结构。为了给三维平台上培养的骨髓间充质干细胞提供适宜，稳定的细胞外基质环境，在微球吸入支架时应尽可能充分，保证三维平台内每部分的载药量均一，避免制作差异影响细胞增殖代谢，影响实验的重复性。

在得到本发明提供的三维细胞培养平台后，可以将其按要求大小或骨缺损形状进行切割，经过钴60辐照灭菌后，得到无菌的三维细胞培养平台。

本发明还提供了一种将上述三维细胞培养平台应用于骨组织工程修复的使用方法，可以包括：

将骨髓间充质干细胞重悬以10⁷/cm³接种于三维细胞培养平台将接种了BMSCs的三维细胞培养平台整体放入培养瓶中，加入L-DMEM培养基+5％胎牛血清，37°，5％CO₂。骨髓间充质细胞1～4小时后完成贴壁；体外培养1～3天后细胞即可长至70％。

在无菌操作条件下，将包含骨髓间充质干细胞的三维培养平台直接置入骨缺损区，无张力缝合。术后常规运用抗生素预防感染，无需加入免疫抑制剂。

需要说明的是，本发明在制备三维细胞培养平台中，所用到的原料均市体售可得，本发明在此不作具体限定。

下面将结合具体的实施例，对本发明的技术方案进行更加详细的描述。

首先，对实施例所用到的主要原料进行说明：

胰岛素：日本wako公司人重组胰岛素，50mg，货号093-06471；

琥珀酰明胶：上海谷研实业有限公司，型号140700，纯度>98％；

聚乳酸-羟基乙酸共聚物：济南岱罡生物科技有限公司，n(LA):n(GA)＝75:25，分子量为70KD；

聚乙烯醇：日本可乐丽株式会社，型号PVA-217；

戊二醛：Aladdin-阿拉丁试剂(上海)有限公司，50％浓度；

牛腱胶原：自制，制备方法参考文献：赵苍碧,黄玉东,李艳辉.从牛腱中提取胶原蛋白的研究[J].哈尔滨工业大学学报,2004,04:515-519。

羟基磷灰石：上海麦恪林生化科技有限公司，纯度>97％,货号H811001。

实施例1

制备三维细胞培养平台

(1)制备含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球：

将20mg胰岛素和4mg琥珀酰明胶溶解于300mL pH值为2.2的乙酸水溶液中作为第一水相W1，将200mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于10mL二氯甲烷溶剂中作为油相O，将0.5g聚乙烯醇和0.5g氯化钠溶解于50mL水中第二水相W2；将第一水相W1和油相O混合后，采用精密增力电动搅拌器以25m/s的速度进行初乳化，时间为50秒，制成W1/O型初乳液；然后将W1/O型初乳液与第二水相W2混合后，以0.9m/s的速度进行复乳化，时间为60秒，制成W1/O/W2型乳液；

将制得的W1/O/W2型乳液稀释于70mL水中，通过离心(5000转/分钟，10分钟)收集含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球，并洗涤6次；

(2)制备成骨支架

将3g牛腱胶原和6g羟基磷灰石分别溶解于300mL pH值为2.2的乙酸水溶液中，得到牛腱胶原乙酸水溶液和羟基磷灰石乙酸水溶液；在3℃条件下，以40m/s的线速度搅拌牛腱胶原乙酸水溶液，在搅拌过程中，将羟基磷灰石乙酸水溶液缓慢加入到牛腱胶原乙酸水溶液中，得到混合溶液，并用氢氧化钠调节混合溶液的pH值为7.2±0.2；加入60mg的戊二醛(体积分数0.25％)交联30分钟，搅拌后倒入10ml离心管中，真空脱气后置于低温冰箱-20°24小时，以形成多孔支架；最后将成骨支架真空干燥。

(3)制备三维细胞培养平台：

将8mg含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球分散于2mL中性磷酸盐缓冲溶液中，然后向其中加入100mg成骨支架，采用负压抽吸法将含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球吸入成骨支架的网状结构，室温干燥过夜，得到三维细胞培养平台。

结构表征

采用液体位移法检测得到成骨支架的孔隙率为83％，扫描电镜测得孔径大小为100～200μm。该液体位移法参考文献：杨波,胡蕴玉,毕龙,等.胶原/羟基磷灰石骨软骨一体化支架的生物学特性研究[J].中国矫形外科杂志,2010,04:304-307；

扫描电镜测得孔径大小为100～200μm，该方法参考文献：杨波,胡蕴玉,毕龙,等.胶原/羟基磷灰石骨软骨一体化支架的生物学特性研究[J].中国矫形外科杂志,2010,04:304-307。

采用Mercodia insulin ELISA试剂盒检测胰岛素在平台内的质量分数为1‰。该方法参考文献：李俭,甘慧,吴卓娜,等水凝胶作为载体的口服胰岛素制剂的药代动力学及药效学研究[J].国际药学研究杂志,2011,05:385-389。

采用测得的胰岛素质量分数/微球实际载药率得到聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球在平台内的质量分数为2％；该方法参考文献：陶安进,张立强,石凯,等.胰岛素肠溶PLGA纳米粒的制备及体内外性质的评价[J].沈阳药科大学学报,2007,01:9-12+64。

采用Mastersizer 2000激光衍射仪(Malvern,UK).检测聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球的粒径2～4μm；该方法参考文献：舒霞,吴玉程,陶庆秀,等.Mastersizer 2000分析报告解析[J].实验技术与管理,2011,02:37-41。

实施例2

(1)制备含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球：

将20mg胰岛素和6mg琥珀酰明胶溶解于200mL pH值为1.5的乙酸水溶液中作为第一水相W1，将110mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于10mL二氯甲烷溶剂中作为油相O，将0.25g聚乙烯醇和0.3g氯化钠溶解于50mL水中第二水相W2；将第一水相W1和油相O混合后，以20m/s的速度进行初乳化，时间为100秒，制成W1/O型初乳液；然后将W1/O型初乳液与第二水相W2混合后，以0.6m/s的速度进行复乳化，时间为100秒，制成W1/O/W2型乳液；

将制得的W1/O/W2型乳液稀释于70mL水中，通过离心(5000转/分钟，10分钟)收集含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球，并洗涤6次；

(2)制备成骨支架

将3g牛腱胶原和4.5g羟基磷灰石分别溶解于300mL pH值为3.5的乙酸水溶液中，得到牛腱胶原乙酸水溶液和羟基磷灰石乙酸水溶液；在5℃条件下，以40m/s的线速度搅拌牛腱胶原乙酸水溶液，在搅拌过程中，将羟基磷灰石乙酸水溶液缓慢加入到牛腱胶原乙酸水溶液中，得到混合溶液，并调节混合溶液的pH值为7.2±0.2；加入150mg的戊二醛(体积分数0.25％)交联30分钟，搅拌后倒入10ml离心管中，真空脱气后置于低温冰箱-25°24小时，以形成多孔支架；最后将成骨支架真空干燥。

(3)制备三维细胞培养平台：

将8mg含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球分散于4mL中性磷酸盐缓冲溶液中，然后向其中加入80mg成骨支架，采用负压抽吸法将含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球吸入成骨支架的网状结构，室温干燥过夜，得到三维细胞培养平台。

结构表征

采用与实施例1相同的表征方法，得到三维细胞培养平台的各项参数如下：成骨支架的孔隙率为80％，孔径大小为100～200μm，胰岛素的质量分数为4‰，聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球的质量分数为0.7％，聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球的粒径3～5μm。

实施例3

(1)制备含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球：

将20mg胰岛素和2.5mg琥珀酰明胶溶解于200mL pH值为2.6的乙酸水溶液中作为第一水相W1，将300mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于15mL二氯甲烷溶剂中作为油相O，将0.75g聚乙烯醇和0.72g氯化钠溶解于50mL水中第二水相W2；将第一水相W1和油相O混合后，以40m/s的速度进行初乳化，时间为20秒，制成W1/O型初乳液；然后将W1/O型初乳液与第二水相W2混合后，以1.5m/s的速度进行复乳化，时间为30秒，制成W1/O/W2型乳液；

将制得的W1/O/W2型乳液稀释于70mL水中，通过离心(5000转/分钟，10分钟)收集含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球，并洗涤6次；

(2)制备成骨支架

将3g牛腱胶原和9g羟基磷灰石分别溶解于300mL pH值为4.5的乙酸水溶液中，得到牛腱胶原乙酸水溶液和羟基磷灰石乙酸水溶液；在5℃条件下，以40m/s的线速度搅拌牛腱胶原乙酸水溶液，在搅拌过程中，将羟基磷灰石乙酸水溶液缓慢加入到牛腱胶原乙酸水溶液中，得到混合溶液，并调节混合溶液的pH值为7.2±0.2；加入250mg的戊二醛(体积分数0.25％)交联30分钟，搅拌后倒入10ml离心管中，真空脱气后置于低温冰箱-30°15小时，以形成多孔支架；最后将成骨支架真空干燥。

(3)制备三维细胞培养平台：

将8mg含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球分散于1mL中性磷酸盐缓冲溶液中，然后向其中加入160mg成骨支架，采用负压抽吸法将含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球吸入成骨支架的网状结构，室温干燥过夜，得到三维细胞培养平台。

结构表征

采用与实施例1相同的表征方法，得到三维细胞培养平台的各项参数如下：成骨支架的孔隙率为83％，孔径大小为100～200μm，胰岛素的质量分数为0.5‰，聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球的质量分数为5％，聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球的粒径1～3μm。

测试与评价

1.体外释药实验

取市售的纳米羟基磷灰石成骨支架材料(石家庄科兴新技术产品有限公司，BP/φ16)和实施例1制备的三维细胞培养平台各1cm³，将100μg胰岛素溶于1mL的pH＝1的盐酸中，加入NaOH调至中性。称取100mg的羟基磷灰石置入该胰岛素溶液，真空负压抽吸促进胰岛素吸入羟基磷灰石。将载药后的羟基磷灰石和实施例1的三维培养平台分别置于10000Da的透析袋，两头扎紧,分别投入10mL释放介质(pH7.4的磷酸盐缓冲液)的小瓶中,置入恒温摇床振荡进行药物释放研究(控制水浴37℃、振荡速度60转/分钟)。在预设时间点取样1mL,同时补充1mL的释放介质。释放介质中胰岛素含量采用Mercodia insulin ELISA测试，计算各时间点的累积释放百分率,绘制释放曲线，分别如图1A和图1B所示。

从图1A和图1B中可以看出：市售羟基磷灰石在第三天已经将80％的胰岛素释放，而实施例1制备的三维细胞培养平台可缓慢持续释放胰岛素，释放80％药物的时间点约在24天左右，药物可测到持续期长达30天。由此可证实实施例1制备的三维细胞培养平台相比于普通成骨羟基磷灰石释放胰岛素的持续时间大大延长。

2扫描电镜观察

将来自大鼠骨髓腔的BMSCs(培养方法见李晓峰,赵劲民,苏伟,等.大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定[J].中国组织工程研究与临床康复,2011,10:1721-1725.)接种于市售的羟基磷灰石和本细胞培养平台，接种密度10⁴个/cm³，放置于24孔板中加入L-DMEM培养基+5％胎牛血清共3ml。培养七天后3％戊二醛固定，逐级脱水，干燥，扫描电镜(Hitachi,S-3400N)在6–25kV下观察细胞与培养平台的生物相容性和诱导分化的情况。

结果证实：与市售的羟基磷灰石(图2A)相比，实施例1制备的三维细胞培养平台的网孔间隙率(孔隙率)为80％，孔径大小100-200μm，可以提供的最适于间充质干细胞培养的三维空间(图2B)。放大3000倍观察，相比于市售的羟基磷灰石(图2C)，实施例1制备的三维细胞培养平台网孔侧壁上挂满缓释药物的微球(图2D箭头所示为吸附的微球)。接种骨髓间充质干细胞后，发现在市售羟基磷灰石上BMSCs在材料内保留了长梭形形态，细胞变得更长(图2E)。而在实施例1制备的三维细胞培养平台中，BMSCs的形态有向成骨细胞分化特征，更多的分叉细胞变得短而多形，暗示细胞增殖、分化活动明显增强。(图2F)。

3.BMSCs增殖实验

将同源同代骨髓间充质干细胞接种于市售的羟基磷灰石(对照组)和实施例1制备的三维细胞培养平台(胰岛素组)，接种密度10⁴个/cm³，放置于96孔板中加入细胞培养基及血清培养。在培养的特定时间点(第1,3,6,9,12,15,18,21,24,27,30天),将20μL MTS加入孔板并在37℃孵育2小时。在酶标仪490nm处测定OD值，结果如图3所示。

从图3中可以看出：自培养的第三天起，骨髓间充质干细胞在实施例1制备的三维细胞培养平台上的增殖显著高于在市售羟基磷灰石材料(p<0.05)。

4.实时定量PCR检测成骨基因的表达

将同源同代骨髓间充质干细胞接种于市售的羟基磷灰石和施例1制备的三维细胞培养平台，接种密度10⁴个/cm³，放置于24孔板中加入标准细胞培养基及血清培养。培养七天后，使用Trizol提取细胞的总RNA，用cDNA synthesis kit合成cDNA.测试成骨的经典指标：骨钙素(OCN),转录因子RUNX2和Osterix(OSX)。RUNX2and Osterix是骨髓间充质干细胞成骨分化和骨骼形成的重要转录因子，骨钙素是一种成骨晚期表达的最重要的特异性非胶原蛋白，结果如图4所示。

从图4中可以看出：同源的BMSCs分别在市售羟基磷灰石和实施例1制备的三维细胞培养平台上培养7天后，骨髓间充质干细胞的成骨基因表达显著增强(p<0.05)，说明本胰岛素缓释平台可以有效促进BMSCs向成骨分化。

5.电化学发光法测试成骨蛋白的含量

将同源同代骨髓间充质干细胞接种于市售的羟基磷灰石(正常组)和实施例1制备的三维细胞培养平台(胰岛素组)，接种密度10⁴个/cm³，放置于24孔板中加入标准细胞培养基及血清培养BMSCs。在培养的第7,14,21，28天分别提取细胞上清液。使用罗氏诊断试剂盒用电化学发光法测试碱性粒酸梅(ALP)和骨钙素(OCN)的含量，分别如图5及图6所示。

从图5及图6中可以看出：在缓释胰岛素的三维平台上培养的BMSCs比在羟基磷灰石上的BMSCs，成骨相关的蛋白表达显著增强(p<0.05)，证明实施例1制备的三维细胞培养平台可以有效促进BMSCs向成骨分化。

从上述测试与评价可以得出，实施例1制备的三维细胞培养平台相比于常规羟基磷灰石，细胞在其上的增殖，成骨有效增加。既可以提高体外三维培养骨髓间充质干细胞的效率，同时可应用骨组织工程技术修复骨缺损。

以上通过实施例1制备的三维细胞培养平台为例进行了相关的测试与评价，可以理解的是，由于实施例2和实施例3所制备的三维细胞培养平台与实施例1制备的三维细胞培养平台结构基本一致，因此可以毫无疑义的确定它们在培养BMSCs向成骨分化时的性能与实施例1所制备的三维细胞培养平台是相同的。因此，本发明在此不作赘述。

以上对本发明所提供的一种三维细胞培养平台、其制备方法及其使用方法进行了详细介绍。本文中应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其中心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种三维细胞培养平台，其特征在于，包括：成骨支架，聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球，胰岛素；所述成骨支架为网状结构，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球附着于所述成骨支架上，所述胰岛素包裹于所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球中，基于所三维细胞培养平台的总质量，所述胰岛素的质量分数为0.5‰～5‰，优选为0.5‰～3‰，更优选为0.5‰～1‰。

2.如权利要求1所述的三维细胞培养平台，其特征在于，所述成骨支架的孔隙率为80％～85％，孔径大小为100～200μm。

3.如权利要求1所述的三维细胞培养平台，其特征在于，基于所述三维细胞培养平台的总质量，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球的质量分数为0.5％～5％，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球的粒径1～5μm。

4.一种制备如权利要求1所述的三维细胞培养平台的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球

将胰岛素和琥珀酰明胶溶解于pH值为1.5～3的乙酸水溶液中作为第一水相W1，将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于二氯甲烷溶剂中作为油相O，将聚乙烯醇和氯化钠溶解于水中第二水相W2；其中，琥珀酰明胶和胰岛素的质量比为1：(3～8)；胰岛素与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为1：(5～15)；

将第一水相W1和油相O进行初乳化，制成W1/O型初乳液；将W1/O型初乳液与第二水相W2进行复乳化，制成W1/O/W2型乳液；

将制得的W1/O/W2型乳液稀释于水中，通过离心得到含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球；

(2)制备成骨支架

将质量比为1：(1.5～3)的牛腱胶原和羟基磷灰石分别溶解于乙酸中，制成牛腱胶原乙酸溶液和羟基磷灰石乙酸溶液；在0～5℃的条件下，将羟基磷灰石乙酸水溶液加入到牛腱胶原乙酸水溶液中，得到混合溶液，并调节混合溶液的pH值为7.2±0.2；加入戊二醛水溶液，搅拌均匀后真空脱气，然后在-20～-30℃的条件下静置15～30小时以形成成骨支架，最后将成骨支架真空干燥；

(3)制备三维细胞培养平台

将含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球分散于中性磷酸盐缓冲溶液中，然后向其中加入成骨支架，所述含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球与成骨支架的质量比为1：(10～20)，采用负压抽吸法将含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球吸入成骨支架的网状结构，干燥，得到三维细胞培养平台。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，用于溶解牛腱胶原和羟基磷灰石的乙酸水溶液的pH值为2～5。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一水相W1中，胰岛素的浓度为1：(10～20)mg/mL；所述第二水相W2中聚乙烯醇和氯化钠的浓度分别为(5～15)mg/mL和(5～15)mg/mL。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，初乳化时，乳化线速度为20～40m/s，乳化时间为30～100s；复乳化的乳化的线速度为0.6～1.5m/s，乳化时间为30～100s。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球质量与磷酸盐缓冲溶液的体积比为：(2～8)：1mg/mL。

9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，得到三维细胞培养平台后，将其按要求大小或骨缺损形状进行切割，经过钴60辐照灭菌后，得到无菌的三维细胞培养平台。

10.如权利要求1所述的三维细胞培养平台的使用方法，其特征在于，包括：

将骨髓间充质干细胞重悬以10⁷/cm³接种于三维细胞培养平台；

将接种了骨髓间充质干细胞的三维细胞培养平台整体放入培养瓶中，加入L-DMEM培养基+5％胎牛血清，37°，5％CO₂；骨髓间充质细胞1～4小时后完成贴壁；体外培养1～3天后细胞即可长至70％；在无菌操作条件下，将包含骨髓间充质干细胞的三维细胞培养平台直接置入骨缺损区，无张力缝合。