CN110055174A - 一种用于细胞三维培养的接种装置及其使用方法 - Google Patents

一种用于细胞三维培养的接种装置及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于细胞三维培养的接种装置及其使用方法。该装置包括主体、填料、筛网、筛板及橡胶塞；主体上端为中空圆柱状结构，下端为中空倒喇叭状结构，主体中空结构用于填料充填，主体两侧设计有固定挂钩，用于筛网的固定；填料为细胞三维培养的载体；筛网通过橡皮筋固定在主体中部的固定挂钩上，筛网在防止填料从主体底部脱落的同时允许细胞自由通过；筛板在填料填充后从主体上端置入，用于填料固定和细胞悬液的分散；橡胶塞固定于主体上端以防止装置使用前异物落入。本发明小巧轻便，使用简单，易于操作，且成本低廉适合批量化生产，在三维细胞培养及再生医学领域具有潜在的应用前景。

Description

一种用于细胞三维培养的接种装置及其使用方法
技术领域
本发明属于细胞培养和再生医学领域，特别是涉及一种用于细胞三维培养的接种装置及其使用方法。
背景技术
在体外细胞培养技术中，传统的二维细胞培养具有培养简单、易操作、廉价等优点，目前仍占据主流地位，但体外培养的细胞系由于受到体外生存选择压力，其增殖、分化以及基因表达等性状与原代细胞及体内组织间存在很大差异。而三维细胞培养技术是指将细胞与具有三维结构的支架材料共同培养，使细胞能够在三维立体空间生长、增殖和迁移，形成细胞-细胞或者细胞-载体复合物，从而更好的模拟细胞在体内的生长环境。【赵典典,侯玲玲,张婧思.三维细胞培养技术的发展及其在干细胞和肿瘤细胞中的应用.中国细胞生物学学报,2015(8):1140-1150.】。
目前细胞三维培养技术及方法主要包括细胞自发性聚集、基质覆盖培养、悬滴法、微阵列结构培养法、生物反应器、水凝胶、微载体等。微载体培养技术是将微载体与细胞悬液共混并持续搅动使其保持悬浮，搅动过程中细胞与微载体相互作用形成细胞-微载体复合物【张启英.PLGA微球的制备及其在卵巢癌细胞三维培养中的应用研究.2013.】，该技术最早由Van Wezel在1967年提出。微载体是广泛应用于细胞培养领域的一种微小珠状细胞支撑物，依赖于各种材料的多孔或非多孔结构微球。微载体培养技术的优点在于比表面积和质量比较高，在培养过程中易于放大，且能更好的维持细胞形态、行为和功能，从而模拟自然器官和组织的体内结构。
多孔微球由于其具有较高的孔隙率和优良的机械性能，常常被用作细胞三维培养的载体【Choi S W,Zhang Y,Yeh Y C,et al.Biodegradable porous beads and theirpotential applications in regenerative medicine.Journal of MaterialsChemistry,2012,22(23):11442-11451.】。与非多孔微球相比，多孔微球具有高度的多孔结构和相互连接的内部结构，有利于氧气及营养物质的运输和代谢物的排出。近年来，干细胞治疗逐渐成为一种有吸引力的修复方法。为了避免干细胞在注射过程中丢失，干细胞被包裹在天然或合成聚合物形成的水凝胶内进行注射，但是由于水凝胶孔隙较小，而且在大体积的水凝胶内部细胞由于缺乏足够的氧气和营养物质，导致大量细胞死亡和细胞的不均匀分布。为解决这一问题，Huang等利用聚乳酸-羟基乙酸共聚物制备得到多孔微球作为人羊水干细胞微载体，研究心肌细胞的形成【Huang C C,Wei H J,Yeh Y C,et al.InjectablePLGA porous beads cellularized by hAFSCs for cellularcardiomyoplasty.Biomaterials,2012,33(16):4069-4077.】。
然而，对于大多数微载体来说，传统的细胞接种方法是将细胞与微载体进行共混，细胞仅能在微载体外表面进行黏附生长，即使是多孔微球，细胞也仅仅黏附在其外孔表面。如Huang等将多孔微球与人羊水干细胞置于旋转瓶中孵育12h，转入96孔板培养3h，细胞仅黏附在多孔微球的外表面，并未进入多孔微球内部，这在本质上非常类似于平板中单层细胞的培养，缺乏细胞与细胞间的相互作用，严格意义上不能被认为是细胞三维培养。真正的微载体细胞三维培养应是细胞均匀分布在微载体内部及表面，使得细胞与细胞之间存在充分的相互作用，从而更好的模拟细胞在自然器官和组织中所经历的体内环境【Huang L,Xiao L,Jung Poudel A,et al.Porous chitosan microspheres as microcarriers for3D cell culture.Carbohydrate Polymers,2018,202:611-620.】。对于多孔微球应用凝胶色谱的原理进行细胞接种，未见文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于细胞三维培养的接种装置及其使用方法。
本发明提供的用于细胞三维培养的接种装置，包括管状中空主体、橡胶塞、筛板、筛网和填料；
所述管状中空主体的上下两端开口，且下端开口小于上端开口；
所述橡胶塞塞于所述管状中空主体的上端开口；
所述筛板位于所述橡胶塞下方，且水平固定于所述管状中空主体内；
所述筛网位于所述管状中空主体的下端开口处；
所述填料填充于所述筛板和筛网之间。
上述装置中，所述管状中空主体由主体上部和主体下部组成；
所述橡胶塞、筛板均位于所述主体上部；
所述主体上部的形状为中空圆柱状；
所述主体下部的形状为中空倒喇叭状。
所述筛网的孔径小于所述填料的粒径且能够使细胞和细胞培养基通过；从而起到在防止填料从主体底部脱落的同时允许细胞自由通过；
所述筛网的孔径具体为50-100μm；更具体为75μm；
所述筛板的孔径为0.5-1mm。所述筛板在填料填充后从主体上端置入，用于填料固定和细胞悬液的分散；
所述填料为多孔微球；所述填料为细胞三维培养的载体；
所述多孔微球的粒径具体为100-400μm；具体为100-300μm；孔径具体为30-70μm。；更具体为20-50μm。
具体的，所述填料为左旋聚乳酸(PLLA)多孔微球或聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)多孔微球。
上述填料还可按照各种常规方法进行修饰改性；由于表面所修饰材料不同方法有所不同，以多孔微球表面修饰丝素蛋白为例：取30mg多孔微球与10mL浓度为3mg/mL的丝素蛋白溶液共混30min，去除5mL上清，转移至烧杯中，磁力搅拌600rpm转速下将30mL无水乙醇以1mL/min的速度滴入丝素蛋白与多孔微球的混悬液中，水洗，收集多孔微球。
所述装置还包括副筛网；
所述副筛网嵌于所述筛板下方；
所述副筛网的孔径具体为50-100μm；更具体为75μm。
所述装置还包括挂钩和橡皮筋；
所述挂钩位于所述管状中空主体外部的中端，用于固定所述筛网；
所述橡皮筋用于连接所述筛网和挂钩。
另外，上述装置在细胞接种中的应用，也属于本发明的保护范围。
本发明提供的细胞接种的方法，包括：
1)去除所述装置的橡胶塞，将细胞悬液由所述装置的管状中空主体的上端开口处加入，用培养皿或离心管收集所述装置下端流出的流出液；
2)重复步骤1)若干次；
3)将所述装置中的填料转移至培养装置中进行细胞培养。
此外，按照上述装置对细胞接种后所得填料在体外细胞三维模型构建、注射型修复材料或3D打印增强材料中的应用，也属于本发明保护的范围。
更具体的，上述细胞接种的方法包括：
(1)简易装置消毒置于超净台，去除顶部橡胶塞，从主体上端加入PBS或者培养基，首次加入PBS或者培养基需浸润5-10min，重复润洗3-5次，保证填料出于湿润状态。
(2)细胞消化，离心，培养基洗涤2-3次，重悬细胞制备细胞悬液。
(3)取一个培养皿或离心管置于装置底端，用于收集装置流出液；去除所述装置的橡胶塞，将(2)中细胞悬液由所述装置的管状中空主体的上端开口处加入，静置，使培养基在重力作用从装置底端流入培养皿或者离心管中。
(4)将(3)中收集得到的流出液从装置顶端再次加入装置中，在重力作用使培养基从装置内自然流出。
(5)重复操作步骤(4)3-5次，取下装置底端筛网，用培养基将填料轻轻冲入培养皿或者培养瓶中培养。
本发明的有益效果是：
本发明提供的用于细胞三维培养的接种装置，运用凝胶色谱的原理，可将细胞接种于多孔微球内部，真正实现细胞的三维培养；且该装置轻便、小巧，使用简单、方便、安全，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是细胞三维培养装置的剖面图；
1、装置主体；2、填料；3、筛板；4、橡胶塞；5、筛网；6、橡皮筋；
图2是细胞三维培养装置主体的剖视图和俯视图；
图3是细胞三维培养装置筛网的主视图和俯视图；
图4是细胞三维培养装置筛板的主视图；
图5是细胞三维培养装置橡胶塞的主视图；
图6是实施例所用PLLA多孔微球填料；
图7是按照实施例2制备的细胞-PLGA多孔微球填料复合物体外培养24h的共聚焦图片；
图8是按照实施例3制备的细胞-PLGA多孔微球填料复合物体外培养24h的共聚焦图片。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
下述实施例所用PLLA左旋聚乳酸多孔微球按照如下方法制得：
将200mg左旋聚乳酸充分溶解在8mL的二氯甲烷中制备成油相；在搅拌条件下滴加1％的NH4HCO3溶液形成初乳；将初乳转移至0.1％的PVA水溶液中，形成复乳，搅拌3h；收集聚乳酸多孔微球，去离子水洗涤3次，0.1M的NaOH洗涤20min后去离子水洗涤3次，然后分装，通过冷冻干燥得到多孔微球固体粉末，定量。
实施例1
如图1所示，一种用于细胞三维培养的接种装置，包括管状中空主体、橡胶塞、筛板、筛网和填料；
所述管状中空主体的上下两端开口，且下端开口小于上端开口；
所述橡胶塞塞于所述管状中空主体的上端开口；如图5所示；
所述筛板位于所述橡胶塞下方，且水平固定于所述管状中空主体内；如图4所示；筛板孔径为100μm，在填料填充后从主体上端置入并固定，用于填料固定和细胞悬液的分散；
所述筛网位于所述管状中空主体的下端开口处；如图3所示，筛网孔径为75μm，通过橡皮筋固定在主体中部的固定挂钩上，筛网在防止填料从主体底部脱落的同时允许细胞自由通过。
所述填料填充于所述筛板和筛网之间。如图6所示。此填料为PLLA左旋聚乳酸多孔微球填料，其粒径为100-300μm，孔径为20-50μm。
上述装置中，所述管状中空主体由主体上部和主体下部组成；
所述橡胶塞、筛板均位于所述主体上部；
如图2所示，所述主体上部的形状为中空圆柱状；
所述主体下部的形状为中空倒喇叭状。
使用该装置时，使用者手持装置主体部分，去除橡胶塞，加入培养基或PBS润洗3-5次，首次润洗时浸润5-10min；细胞消化，离心，洗涤，重悬，计数；装置底部预置培养皿或者离心管，将细胞悬液加入装置内，在重力作用下，使细胞悬液自然流出，至培养皿或者离心管中收集；将上述收集液再次加入装置中，使其自然流出，重复操作3-5次；取下装置底端筛网，转移填料至培养皿或培养瓶中进行培养。
实施例2、
取20mg的PLGA多孔微球，用培养基浸润10min，使多孔微球润湿，弃去培养基；将牙周膜干细胞消化、离心、重悬计数，细胞浓度稀释至1×106个/mL；将100μL上述细胞悬液加入润湿的多孔微球中共混，转移至培养皿中培养，作为对照。
实施例3、
取20mg的PLGA多孔微球，用培养基浸润10min，使多孔微球润湿，转移至本发明实施例1提供的接种简易装置内；将牙周膜干细胞消化、离心、重悬计数，细胞浓度稀释至1×106个/mL；在该接种简易装置下端预置培养皿，将100μL上述细胞悬液加入该接种简易装置内，重力作用下，细胞悬液流经多孔微球填料，并回收流出的细胞悬液；将回收的细胞悬液再次加入该接种简易装置内，重复此操作三次，转移该接种简易装置内多孔微球填料至培养皿中培养。
图7是按照实施例2制备的细胞-PLGA多孔微球填料复合物体外培养24h的共聚焦图片；由图可知，按照传统接种方式，培养24h后有少量细胞贴附在PLGA多孔微球上。
图8是按照实施例3制备的细胞-PLGA多孔微球填料复合物体外培养24h的共聚焦图片。由图可知，利用本发明提供的接种简易装置进行接种，培养24h后观察到有大量细胞贴附在PLGA多孔微球上。
由图7和图8可知，利用本发明提供的接种装置可明显提高细胞在多孔微球上的接种量，也即提高了细胞在多孔微球上的接种效率。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于细胞三维培养的接种装置，包括管状中空主体、橡胶塞、筛板、筛网和填料；
所述管状中空主体的上下两端开口，且下端开口小于上端开口；
所述橡胶塞塞于所述管状中空主体的上端开口；
所述筛板位于所述橡胶塞下方，且水平固定于所述管状中空主体内；
所述筛网位于所述管状中空主体的下端开口处；
所述填料填充于所述筛板和筛网之间。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于：所述管状中空主体由主体上部和主体下部组成；
所述橡胶塞和筛板均位于所述主体上部；
所述主体上部的形状为中空圆柱状；
所述主体下部的形状为中空倒喇叭状。
3.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于：所述筛网的孔径小于所述填料的粒径且能够使细胞和细胞培养基通过；
所述筛网的孔径具体为50-100μm；更具体为75μm；
所述筛板的孔径为0.5-1mm。
4.根据权利要求1-3中任一所述的装置，其特征在于：所述填料为多孔微球；
所述多孔微球的粒径具体为100-400μm；孔径具体为30-70μm。
5.根据权利要求1-4中任一所述的装置，其特征在于：所述填料为左旋聚乳酸多孔微球或聚乳酸-羟基乙酸共聚物多孔微球。
6.根据权利要求1-5中任一所述的装置，其特征在于：所述装置还包括副筛网；
所述副筛网嵌于所述筛板下方；
所述副筛网的孔径具体为50-100μm；更具体为75μm。
7.根据权利要求1-6中任一所述的装置，其特征在于：所述装置还包括挂钩和橡皮筋；
所述挂钩位于所述管状中空主体外部的中端，用于固定所述筛网；
所述橡皮筋用于连接所述筛网和挂钩。
8.权利要求1-7中任一所述装置在细胞接种中的应用。
9.一种细胞接种的方法，包括：
1)去除权利要求1-7中任一所述装置的橡胶塞，将细胞悬液由权利要求1-7中任一所述装置的管状中空主体的上端开口处加入，用培养皿或离心管收集所述装置下端流出的流出液；
2)重复步骤1)若干次；
3)将所述装置中的填料转移至培养装置中进行细胞培养。
10.权利要求9细胞接种后所得填料在体外细胞三维模型构建、注射型修复材料或3D打印增强材料中的应用。
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