CN109529126A - 一种人工真皮及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人工真皮及其制备方法，所述人工真皮包括胶原海绵层，所述胶原海绵层由包括胶原、多糖和功能性复合微粒的原料制成，所述功能性复合微粒为无定形多聚磷酸盐与聚乳酸形成的复合微粒，该人工真皮能够加快血管化和促进创面愈合，应用于创面修复时，随着胶原海绵层逐渐降解，功能性复合微粒被释放到创面部位，聚乳酸降解进而暴露出无定形多聚磷酸盐，起到了稳定长效释放无定形多聚磷酸盐的作用，在真皮缺损创面，特别是慢性创面的修复上具有广阔的应用前景。

Description

一种人工真皮及其制备方法
技术领域
本发明涉及医疗器械技术领域，尤其是涉及一种人工真皮及其制备方法。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，具有重要的生理功能，能够保护内部器官受到外界损害，同时具有吸收、保水、分泌、排泄、感觉、体温调节和免疫的功能。皮肤缺损后，机体内环境的相对稳定将会受到影响，体液流失，伤口容易受到外界微生物的感染，严重时会引起休克，危及患者生命。当皮肤缺损无法进行自行修复时，需要通过植皮手术来辅助皮肤修复。创面的快速愈合对提高植皮手术的成功率非常重要。
人工真皮是模仿皮肤真皮层和表皮层结构及功能的一类人工合成创面修复产品。人工真皮植入皮肤缺损部位后，胶原海绵层逐渐降解，同时纤维母细胞和毛细血管从创面基底或周围组织长入具有三维多孔结构的胶原海绵层，形成类真皮组织，血管化完全后，揭除阻水阻菌的硅橡胶层，二期移植自体皮片愈合创面。完全血管化需要的时间若过久，则会极大降低患者的生活质量，加重患者的经济负担，因此需要采取有效的方式加快真皮层重建的速度，缩短二期植皮周期，促进创面愈合，提高皮肤修复成功率。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供人工真皮及其制备方法，制备得到的人工真皮具有加快血管化、促进创面愈合的有益效果。
本发明所采取的技术方案是：
本发明提供一种人工真皮，包括胶原海绵层，所述胶原海绵层由包括胶原、多糖和功能性复合微粒的原料制成，所述功能性复合微粒为无定形多聚磷酸盐与聚乳酸形成的复合微粒。
在一些优选的实施方式中，所述功能性复合微粒为核壳结构，所述核壳结构的内核为无定形多聚磷酸盐，壳层为聚乳酸。
在一些优选的实施方式中，所述功能性复合微粒的粒径为50nm～200μm。
在一些优选的实施方式中，所述无定形多聚磷酸盐为无定形多聚磷酸钙、无定形多聚磷酸镁、无定形多聚磷酸锌中的至少一种。
在进一步优选的实施方式中，所述无定形多聚磷酸盐的重复单元数为10～100。
在一些优选的实施方式中，所述多糖为透明质酸、硫酸软骨素、壳聚糖中的至少一种。
在一些优选的实施方式中，所述胶原为I型胶原、III型胶原中的至少一种。
在一些优选的实施方式中，所述胶原海绵层为三维多孔结构，所述三维多孔结构的孔隙率为80～98％，所述三维多孔结构的孔径为50～250μm。
在一些优选的实施方式中，胶原：多糖：功能性复合微粒的质量比为(9～20)：(1.3～2.6)：(1.2～2.0)。
在一些优选的实施方式中，所述人工真皮还包括硅橡胶层。
在一些优选的实施方式中，所述人工真皮上设置有贯穿孔。在人工真皮上进行线形或圆形的贯穿制孔，有利于细胞的快速生长。
本发明还提供一种上述的人工真皮的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备功能性复合微粒：取无定形多聚磷酸盐和水混合形成内层流动相，取聚乳酸和有机溶剂混合形成中间层流动相，取表面活性剂和水混合形成外层流动相，利用微流控技术将所述内层流动相、中间层流动相和外层流动相混合，制备得到功能性复合微粒；
S2、将含有胶原、多糖和所述功能性复合微粒的原料混合，后成型形成胶原海绵层。
在一些优选的实施方式中，步骤S1中的有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、碳酸二甲酯中的任一种。
在一些优选的实施方式中，步骤S1中表面活性剂为为十二烷基硫酸钠(SDS)、聚乙烯醇中的至少一种。
在一些优选的实施方式中，步骤S1中所述中间层流动相中还添加有亲水改性的聚乳酸。
在进一步优选的实施方式中，所述亲水改性的聚乳酸为在聚乳酸上接枝聚乙二醇、壳聚糖中的至少一种。
在聚乳酸上接枝聚乙二醇的具体步骤为：取聚乙二醇单甲醚、乳酸、辛酸亚锡，搅拌均匀后，在真空条件下120～140℃反应10～12h；所述聚乙二醇单甲醚、乳酸、辛酸亚锡的质量比为(4～12)：(0.02～0.1)：(40～120)。反应完成后，用二氯甲烷溶解反应液，并滴于乙醇中沉淀，抽滤干燥得到固体备用。
在一些优选的实施方式中，所述内层流动相中无定形多聚磷酸盐的质量分数为0.1～0.2％；所述中间层流动相中聚乳酸的质量分数为1～2.5％，亲水改性的聚乳酸的质量分数为0.5～1％；所述外层流动相中表面活性剂的质量分数为2.5～5％。
在一些优选的实施方式中，步骤S1中内层流动相的流速为1.3～3.5mL/h，中间层流动相的流速为1.2～2mL/h，外层流动相的流速为10～100mL/h。
在一些优选的实施方式中，步骤S2具体为：将胶原、多糖分别溶于醋酸中形成溶液，将功能性复合微粒分散于醋酸中形成功能性复合微粒悬液，将多糖溶液、功能性复合微粒悬液缓慢加入到胶原溶液中混合，后成型形成胶原海绵层。
在一些优选的实施例中，步骤S2中成型的方式为冷冻干燥后，利用紫外照射交联。
在一些优选的实施方式中，还包括步骤S3：取硅橡胶层，将硅橡胶层和胶原海绵层通过硅凝胶粘合，浸泡在戊二醛-醋酸溶液中进行化学交联。
其中，戊二醛-醋酸溶液是指戊二醛与醋酸混合形成的溶液，进一步优选所述戊二醛-醋酸中戊二醛的体积分数为0.1～0.3％，醋酸的浓度为0.03～0.05mol/L。
本发明的有益效果是：
本发明提供一种具有加快血管化、促进创面愈合功能的新型人工真皮，该人工真皮应用于创面修复时，随着胶原海绵层逐渐降解，功能性复合微粒被释放到创面部位，聚乳酸降解进而暴露出无定形多聚磷酸盐，起到了稳定长效释放无定形多聚磷酸盐的作用，同时无定形多聚磷酸盐能够为细胞的新陈代谢提供能量，在真皮缺损创面，特别是慢性创面的修复上具备广阔的应用前景。
本发明提供的人工真皮的制备方法，利用微流控双乳液滴技术制备结构均一的功能性复合微粒。在微通道中，多聚磷酸盐的水相(内层流动相)包裹于聚乳酸的油相(中间层流动相)中，然后整体再包裹于水相(外层流动相)中，形成水包油包水型双乳液滴，干燥后形成内核为多聚磷酸盐、壳层为聚乳酸的微粒。与传统的机械搅拌或超声震荡制备方法相比，本发明提供的微流控双乳液滴技术不需要更换溶液，可实现自动化一步法包裹，制得的微粒结构和大小均一可控、粒径分布窄。制备得到的核壳结构的功能性复合微粒利用聚乳酸作为保护层，避免内核多聚磷酸盐的活性在人工真皮制备过程中受到影响，最大程度保持微粒促真皮修复的功能特性；同时聚乳酸具有可降解性，在创面修复时，能够降解并稳定长效释放多聚磷酸盐。
附图说明
图1为实施例1中制备的人工真皮的功能作用示意图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
以下实施例中使用的无定形多聚磷酸盐来源于德国海洋纳米技术有限公司；使用的亲水改性的聚乳酸由实验室制备，在利用微流控技术制备功能性复合微粒的过程中被添加到中间层流动相中作为稳定剂，能够提高功能性复合微粒在外层流动相中的稳定性，使得制备得到粒径和结构均一的复合微粒，同时改善功能性复合微粒在胶原复合液中的分散性，防止复合微粒团聚，使复合微粒均匀分布在胶原海绵层中，此外亲水改性的聚乳酸能够加速聚乳酸降解，促进功能性多聚磷酸盐的释放，该亲水改性的聚乳酸可以通过在聚乳酸上接枝聚乙二醇、壳聚糖等获得。
实施例1
本实施例中使用的亲水改性的聚乳酸采取聚乳酸和聚乙二醇接枝方法获得，具体的制备步骤为：在反应瓶中加入聚乙二醇单甲醚、乳酸、辛酸亚锡，搅拌均匀后，在真空条件下140℃反应12h；所述聚乙二醇单甲醚、乳酸、辛酸亚锡的质量比为8:0.1:80，反应完成后，用8mL二氯甲烷稀溶解反应液，并滴于20mL乙醇中沉淀，抽滤，真空干燥24h得到聚乳酸-聚乙二醇固体备用。
制备功能性复合微粒：称取无定形多聚磷酸盐分散于纯化水中，超声1min，得到质量分数为0.12％的无定形多聚磷酸盐溶液作为内层流动相；称取聚乳酸和亲水改性的聚乳酸溶于乙酸乙酯中，不断搅拌得到中间层流动相，其中聚乳酸的质量分数为1.5％，亲水改性的聚乳酸的质量分数为0.5％；称取SDS溶于纯化水中，不断搅拌，得到2.5％的SDS水溶液作为外层流动相。将内层流动相、中间层流动相和外层流动相分别注入微流控装置的三个通道中，所述微流控装置为基于毛细玻璃管的同轴微通道，调节内层流动相流速为1.5mL/h，中间层流动相流速为1.2mL/h，外层流动相流速为20mL/h，将出口端得到的双乳液滴收集分散于纯化水中，不断搅拌使乙酸乙酯挥发，得到的功能性复合微粒水洗3遍，干燥备用，制备得到的功能性复合微粒的粒径范围在50nm～200μm。
称取1.2g胶原和0.15g硫酸软骨素，分别溶于100mL浓度为0.03mol/L醋酸溶液中；称取0.12g功能性复合微粒，分散于100mL浓度为0.03mol/L醋酸溶液中，超声1min得到功能性复合微粒悬液。将硫酸软骨素溶液和功能性复合微粒悬液以1mL/min的速率分别加入到胶原溶液中，不断搅拌，得到加载功能性复合微粒的胶原复合液。
将加载有功能性复合微粒的胶原复合溶液注入到模具中，流延平整后，先在-70℃冷冻2h，然后放置在冷冻干燥机中冷冻干燥24h成型，取出后，在医用紫外灯辐照下交联24h，得到胶原海绵层。
本实施使用的无定形多聚磷酸盐可以为无定形多聚磷酸钙、无定形多聚磷酸镁、无定形多聚磷酸锌中的至少一种，优选无定形多聚磷酸盐的重复单元数为10～100。
本实施例提供的胶原海绵层可以作为人工真皮应用于创面修复，具有加快血管化、促进创面愈合的效果，在使用时还可以在胶原海绵层上设置硅橡胶层，具体过程为：取医用级硅橡胶，在硅橡胶层的一面均匀涂上硅凝胶，将胶原海绵层放置于硅橡胶层上，粘合后，浸泡在戊二醛-醋酸溶液中48h，所述戊二醛-醋酸溶液中戊二醛的体积分数为0.2％，醋酸的浓度为0.03mol/L。交联完成后取出，用纯化水清洗6次，再用磷酸盐缓冲液清洗2次，得到设置有硅橡胶层的人工真皮。制备得到的人工真皮上还可以进行线形或者圆形的贯穿制孔，有利于细胞的快速长入。本实施例制备的人工真皮的功能作用示意图如图1所示，随着胶原海绵层逐渐降解，功能性复合微粒被释放到创面部位，聚乳酸降解进而暴露出无定形多聚磷酸盐内核，无定形多聚磷酸盐为细胞的新陈代谢提供了能量，起到了加快血管化、促进创面愈合功能。
实施例2
称取无定形多聚磷酸盐分散于纯化水中，超声1min，得到质量分数为0.15％的无定形多聚磷酸盐溶液作为内层流动相；称取聚乳酸和实施例1中亲水改性的聚乳酸溶于乙酸乙酯中，不断搅拌，得到聚乳酸的质量分数为1.5％，亲水改性的聚乳酸的质量分数为1％的中间层流动相；称取SDS溶于纯化水中，不断搅拌，得到2.5％的SDS水溶液作为外层流动相。
将内层流动相、中间层流动相和外层流动相分别注入微流控装置的三个通道中，调节内层流动相流速为2.0mL/h，中间层流动相流速为2.0mL/h，外层流动相流速为80mL/h，将出口端得到的双乳液滴收集分散于纯化水中，不断搅拌使乙酸乙酯挥发，得到的功能性复合微粒水洗3遍，干燥备用。
称取1.5g胶原和0.18g硫酸软骨素，分别溶于100mL浓度为0.05mol/L醋酸溶液中；称取0.15g功能性复合微粒，分散于100mL浓度为0.05mol/L醋酸溶液中，超声1min。将硫酸软骨素溶液和功能性复合微粒悬液以1mL/min的速率分别加入到胶原溶液中，不断搅拌，得到加载功能性复合微粒的胶原复合液。
将加载功能性复合微粒的胶原复合溶液注入到模具中，流延平整后，先在-60℃冷冻3h，然后放置在冷冻干燥机中冷冻干燥24h成型，取出后，在医用紫外灯辐照下交联24h，得到胶原海绵层。
在硅橡胶层的一面均匀涂上硅凝胶，将胶原海绵层放置于硅橡胶层上，粘合后，浸泡在戊二醛-醋酸溶液中48h，所述戊二醛-醋酸溶液中戊二醛的体积分数为0.25％，醋酸的浓度为0.05mol/L。交联完成后取出，用纯化水清洗6次，再用磷酸盐缓冲液清洗2次，得到设置有硅橡胶层的人工真皮。
实施例3
称取无定形多聚磷酸盐分散于纯化水中，超声1min，得到质量分数为0.18％的无定形多聚磷酸盐溶液作为内层流动相；称取聚乳酸和实施例1中亲水改性的聚乳酸溶于乙酸乙酯中，不断搅拌，得到聚乳酸的质量分数为1％，亲水改性聚乳酸的质量分数为1％的中间层流动相；称取SDS溶于纯化水中，不断搅拌，得到5％的SDS水溶液作为外层流动相。
将内层流动相、中间层流动相和外层流动相分别注入微流控装置的三个通道中，调节内层流动相流速为3mL/h，中间层流动相流速为1.8mL/h，外层流动相流速为50mL/h，将出口端得到的双乳液滴收集分散于纯化水中，不断搅拌使乙酸乙酯挥发，得到的功能复合微粒水洗3遍，干燥备用。
称取1.9g胶原和0.25g壳聚糖，分别溶于100mL浓度为0.05mol/L醋酸溶液中；称取0.18g功能性复合微粒，分散于100mL浓度为0.05mol/L醋酸溶液中，超声1min。将壳聚糖溶液和功能性复合微粒悬液以1mL/min的速率分别加入到胶原溶液中，不断搅拌，得到加载功能性复合微粒的胶原复合液。
将加载功能性复合微粒的胶原复合溶液注入到模具中，流延平整后，先在-80℃冷冻2h，然后放置在冷冻干燥机中冷冻干燥24h成型，取出后，在医用紫外灯辐照下交联24h，得到胶原海绵层。
在硅橡胶层的一面均匀涂上硅凝胶，将胶原海绵层放置于硅橡胶层上，粘合后，浸泡在戊二醛-醋酸溶液中48h，所述戊二醛-醋酸溶液中戊二醛的体积分数为0.3％，醋酸的浓度为0.05mol/L。交联完成后取出，用纯化水清洗6次，再用磷酸盐缓冲液清洗2次，得到设置有硅橡胶层的人工真皮。
实施例4
称取无定形多聚磷酸盐分散于纯化水中，超声1min，得到质量分数为0.18％的无定形多聚磷酸盐溶液作为内层流动相；称取聚乳酸和实施例1中亲水改性的聚乳酸溶于碳酸二甲酯中，不断搅拌，得到聚乳酸的质量分数为1％，亲水改性聚乳酸的质量分数为1％的中间层流动相的中间层流动相；称取聚乙烯醇溶于纯化水中，不断搅拌，得到5％的聚乙烯醇水溶液作为外层流动相。
将内层流动相、中间层流动相和外层流动相分别注入微流控装置的三个通道中，调节内层流动相流速为3mL/h，中间层流动相流速为1.8mL/h，外层流动相流速为50mL/h，将出口端得到的双乳液滴收集分散于纯化水中，不断搅拌使聚乙烯醇挥发，得到的功能复合微粒水洗3遍，干燥备用。
称取1.9g胶原和0.25g透明质酸，分别溶于100mL浓度为0.05mol/L醋酸溶液中；称取0.18g功能性复合微粒，分散于100mL浓度为0.05mol/L醋酸溶液中，超声1min。将透明质酸溶液和功能性复合微粒悬液以1mL/min的速率分别加入到胶原溶液中，不断搅拌，得到加载功能性复合微粒的胶原复合液。
将加载功能性复合微粒的胶原复合溶液注入到模具中，流延平整后，先在-60℃冷冻1.5h，然后放置在冷冻干燥机中冷冻干燥24h成型，取出后，在医用紫外灯辐照下交联24h，得到胶原海绵层。
在硅橡胶层的一面均匀涂上硅凝胶，将胶原海绵层放置于硅橡胶层上，粘合后，浸泡在戊二醛-醋酸溶液中48h，所述戊二醛-醋酸溶液中戊二醛的体积分数为0.1％，醋酸的浓度为0.03mol/L。交联完成后取出，用纯化水清洗6次，再用磷酸盐缓冲液清洗2次，得到设置有硅橡胶层的人工真皮。
实施例5
本实施例中使用的亲水改性的聚乳酸采取聚乳酸和壳聚糖接枝方法获得，具体的制备步骤为：在反应瓶中加入壳聚糖和N，N-二甲基甲酰胺，搅拌过夜，然后加入1％醋酸溶液使壳聚糖溶解。将聚乳酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺溶于氯仿，然后加入到含有壳聚糖的反应瓶中，剧烈搅拌反应72h(所述壳聚糖、乳酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:1:2:4)。用氢氧化钠中和反应液，再将反应液滴于乙醇中沉淀，抽滤，真空干燥24h得到聚乳酸-壳聚糖固体备用。
制备功能性复合微粒：称取无定形多聚磷酸盐分散于纯化水中，超声1min，得到质量分数为0.12％的无定形多聚磷酸盐溶液作为内层流动相；称取聚乳酸和壳聚糖亲水改性的聚乳酸溶于乙酸乙酯中，不断搅拌得到中间层流动相，其中聚乳酸的质量分数为2.5％，亲水改性的聚乳酸的质量分数为1％；称取SDS溶于纯化水中，不断搅拌，得到2.5％的SDS水溶液作为外层流动相。将内层流动相、中间层流动相和外层流动相分别注入微流控装置的三个通道中，所述微流控装置为基于毛细玻璃管的同轴微通道，调节内层流动相流速为1.3mL/h，中间层流动相流速为2mL/h，外层流动相流速为100mL/h，将出口端得到的双乳液滴收集分散于纯化水中，不断搅拌使乙酸乙酯挥发，得到的功能性复合微粒水洗3遍，干燥备用。
称取1.2g胶原和0.15g壳聚糖，分别溶于100mL浓度为0.03mol/L醋酸溶液中；称取0.12g功能性复合微粒，分散于100mL浓度为0.03mol/L醋酸溶液中，超声1min得到功能性复合微粒悬液。将硫酸软骨素溶液和功能性复合微粒悬液以1mL/min的速率分别加入到胶原溶液中，不断搅拌，得到加载功能性复合微粒的胶原复合液。
将加载有功能性复合微粒的胶原复合溶液注入到模具中，流延平整后，先在-70℃冷冻2h，然后放置在冷冻干燥机中冷冻干燥24h成型，取出后，在医用紫外灯辐照下交联24h，得到胶原海绵层。

Claims (17)

1.一种人工真皮，其特征在于，包括胶原海绵层，所述胶原海绵层由包括胶原、多糖和功能性复合微粒的原料制成，所述功能性复合微粒为无定形多聚磷酸盐与聚乳酸形成的复合微粒。
2.根据权利要求1所述的人工真皮，其特征在于，所述功能性复合微粒为核壳结构，所述核壳结构的内核为无定形多聚磷酸盐，壳层为聚乳酸。
3.根据权利要求1所述的人工真皮，其特征在于，所述功能性复合微粒的粒径为50nm～200μm。
4.根据权利要求1-3任一项所述的人工真皮，其特征在于，所述无定形多聚磷酸盐为无定形多聚磷酸钙、无定形多聚磷酸镁、无定形多聚磷酸锌中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的人工真皮，其特征在于，所述无定形多聚磷酸盐的重复单元数为10～100。
6.根据权利要求1-3任一项所述的人工真皮，其特征在于，所述多糖为透明质酸、硫酸软骨素、壳聚糖中的至少一种。
7.根据权利要求1-3任一项所述的人工真皮，其特征在于，所述胶原为I型胶原、III型胶原中的至少一种。
8.根据权利要求1-3任一项所述的人工真皮，其特征在于，所述胶原海绵层为三维多孔结构，所述三维多孔结构的孔隙率为80～98％，所述三维多孔结构的孔径为50～250μm。
9.根据权利要求1-3任一项所述的人工真皮，其特征在于，胶原：多糖：功能性复合微粒的质量比为(9～20)：(1.3～2.6)：(1.2～2.0)。
10.根据权利要求1所述的人工真皮，其特征在于，所述人工真皮还包括硅橡胶层。
11.根据权利要求1-3、10任一项所述的人工真皮，其特征在于，所述人工真皮上设置有贯穿孔。
12.权利要求1-11任一项所述的人工真皮的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制备功能性复合微粒：取无定形多聚磷酸盐和水混合形成内层流动相，取聚乳酸和有机溶剂混合形成中间层流动相，取表面活性剂和水混合形成外层流动相，利用微流控技术将所述内层流动相、中间层流动相和外层流动相混合，制备得到功能性复合微粒；
S2、将含有胶原、多糖和所述功能性复合微粒的原料混合，后成型形成胶原海绵层。
13.根据权利要求12所述的人工真皮的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述中间层流动相中还添加有亲水改性的聚乳酸。
14.根据权利要求13所述的人工真皮的制备方法，其特征在于，所述亲水改性的聚乳酸为在聚乳酸上接枝聚乙二醇、壳聚糖中的至少一种。
15.根据权利要求13或14所述的人工真皮的制备方法，其特征在于，所述内层流动相中无定形多聚磷酸盐的质量分数为0.1～0.2％；所述中间层流动相中聚乳酸的质量分数为1～2.5％，亲水改性的聚乳酸的质量分数为0.5～1％；所述外层流动相中表面活性剂的质量分数为2.5～5％。
16.根据权利要求12所述的人工真皮的制备方法，其特征在于，步骤S2具体为：将胶原、多糖分别溶于醋酸中形成溶液，将功能性复合微粒分散于醋酸中形成功能性复合微粒悬液，将多糖溶液、功能性复合微粒悬液缓慢加入到胶原溶液中混合，后成型形成胶原海绵层。
17.根据权利要求12所述的人工真皮的制备方法，其特征在于，还包括步骤S3：取硅橡胶层，将硅橡胶层和胶原海绵层通过硅凝胶粘合，浸泡在戊二醛-醋酸溶液中进行化学交联。
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