CN110559104A - 一种人工真皮及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人工真皮及其制备方法，所述人工真皮的制备方法，包括以下步骤：(1)配制人工真皮原料的溶液，所述人工真皮原料包含胶原；(2)在所述人工真皮原料的溶液中加入交联剂，混合得到复合液；(3)在所述复合液表面喷洒盐溶液，后进行冻融处理，所述冻融处理包括冷冻和第一解冻；在所述冻融处理过程中，所述盐溶液经冷冻形成表面结晶，然后经第一解冻至所述盐溶液形成的表面结晶处于未融化状态；(4)冷冻并进行第二解冻，经所述第二解冻至所有冷冻物完全融化，清洗。利用本发明的制备方法得到的人工真皮内部和表面具有贯通的孔结构，利于皮肤的修复。

Description

一种人工真皮及其制备方法

技术领域

本发明涉及仿生材料技术领域，尤其是涉及一种人工真皮及其制备方法。

背景技术

皮肤，尤其是真皮一旦发生缺损，会使皮肤功能受损，严重时可能威胁到人体健康。传统的治疗方式是自体皮片移植或者皮瓣移植，然而，这些治疗方法属于拆东墙补西墙的做法，对人体会造成二次创伤，对于大面积创伤的患者，皮源往往不足，人工真皮的设计则能够解决这个问题。人工真皮是指经过人工处理得到的真皮替代物，包括天然人工真皮和人工合成人工真皮。其中，人工合成真皮以胶原、壳聚糖、透明质酸为主要原材料制成。人工合成真皮替代物原材料来源广泛，性能可控，生物相容性好等特点成为当今真皮修复产品的主流，目前有诸多研究报道。现有的人工合成真皮替代物的主要制备方法是冷冻干燥-交联处理的方法，如US20160143726公开了一种人工真皮的制备方法，经过溶液制备、冷冻干燥、高温处理、溶液交联、末道清洗等过程得到胶原-硫酸软骨素-原弹性蛋白真皮基质，然而，存在着冻干容易开裂、溶液交联时结构容易塌陷的缺陷。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种人工真皮的制备方法。

本发明所采取的技术方案是：

本发明提供一种人工真皮的制备方法，包括以下步骤：

(1)配制人工真皮原料的溶液，所述人工真皮原料包含胶原；

(2)在所述人工真皮原料的溶液中加入交联剂，混合得到复合液；(3)在所述复合液表面喷洒盐溶液，后进行冻融处理，所述冻融处理包括冷冻和第一解冻；在所述冻融处理过程中，所述盐溶液经冷冻形成表面结晶，然后经第一解冻至所述盐溶液形成的表面结晶处于未融化状态；即步骤(3)中盐溶液在冷冻条件下形成表面结晶，经第一解冻后盐溶液形成的表面结晶处于未融化状态。

(4)冷冻并进行第二解冻，经所述第二解冻至所有冷冻物完全融化，清洗。

优选地，所述盐溶液包括氯化钠溶液、氯化钾溶液、磷酸钠溶液、磷酸钾溶液、硝酸钠溶液、硝酸钾溶液中的至少一种。

优选地，所述盐溶液的浓度不小于0.2mol/L。当盐溶液的浓度过低时，形成的晶粒少，容易影响人工真皮支架表面孔贯通的效果。

进一步优选地，所述盐溶液的浓度为0.2～1.0mol/L。当盐溶液浓度过高时，容易导致含有胶原的复合液发生盐析，不利于形成均匀的多孔支架。

优选地，步骤(3)中所述冻融处理至少进行两次，并且前两次冻融处理中冷冻时间大于1h，即在复合液表面喷洒盐溶液后，先第一次冷冻大于1h，然后经第一解冻至盐溶液形成的表面结晶处于未融化状态，再第二次冷冻大于1h，再经第一解冻至表面盐溶液形成的表面结晶处于未融化状态。多次冻融是溶解-重结晶的过程，会破坏原有孔壁结构，使孔壁间更加贯通，有利于细胞迁移和长入，通过反复冻融处理，可以增强胶原之间的物理交联强度，使其可以不用通过冻干方式形成多孔支架。

优选地，在室温下步骤(3)中第一解冻的时间为5～20min。

在一些优选的实施例中，在步骤(3)和步骤(4)之间还包括冷冻和第三解冻的步骤，经所述第三解冻达到的状态包括所有冷冻物从未融化状态到完全融化状态中的任意状态。即在步骤(3)进行冻融处理后，可以根据实际需要选择进行或不进行冷冻和第三解冻，当选择进行冷冻和第三解冻的步骤时，此时冷冻和第三解冻的时间不限，经第三解冻达到的状态可以为任意状态。

进一步地，冷冻的总次数为3～5次。即在一些优选的实施例中，人工真皮的整个制备步骤中涉及到冷冻操作的总次数优选为3～5次。

优选地，冷冻的温度在-40℃～-80℃。

优选地，所述人工真皮原料还包括壳聚糖、海藻酸钠、肝素钠、硫酸软骨素、透明质酸中的至少一种。即步骤(1)中该人工真皮原料的溶液可以是胶原溶液，也可以是胶原复合液如胶原-壳聚糖溶液、胶原-硫酸软骨素溶液等。

优选地，人工真皮原料的质量分数为0.35wt％～0.7wt％。

优选地，步骤(1)和/或步骤(2)中还加入有药物。

使用的交联剂包括常规的用于胶原交联的交联剂，优选地，步骤(2)中所述交联剂为戊二醛溶液。更进一步地，戊二醛溶液的浓度为0.01wt％～0.2wt％。戊二醛溶液和含胶原的溶液在溶液中进行交联，反应更加均匀和充分，能够以更低浓度的戊二醛溶液实现同样的抗降解性能，具有更低残留。

优选地，步骤(2)中混合的时间为1～5h。

本发明还提供一种人工真皮，由上述的人工真皮的制备方法制得。

本发明的有益效果是：

本发明采用冻融处理方式，而冻融处理是溶解和重结晶的过程，会破坏原有孔壁结构，使孔壁间更加贯通，有利于细胞迁入和长入，本发明在含有胶原的复合液表面喷洒盐溶液，在低温下形成晶核，在表面起到一个“占位”作用，能够解决反复冷冻过程中胶原凝胶因不断冷冻变形导致传质不均最终在表面堆积一层致密的胶原壳而致使人工真皮表面呈闭孔结构的问题，此外盐溶液位于表面，能够使得冻结的表面不融化，保证了人工真皮表面的开孔结构，而含有胶原的人工真皮原料通过冷冻结晶的方式获得人工真皮的主体胶原支架，具有径向结构和贯通性，最终使得制备得到的人工真皮具有更佳的贯通孔结构，利于皮肤的修复。常规的冷冻干燥-交联处理过程容易造成人工真皮支架坍塌和收缩，利用本发明的方法制得的人工真皮支架不会塌陷和收缩，有利于保持结构的完整，可以不经过裁切，直接制定成需求的尺寸。本发明的方法能够避免冷冻干燥方法造成的开裂问题，制得的人工真皮具有更稳定的成品率，成品率可达95％以上，同时缩短了工艺时间，不需要过多的设备，降低了生产成本。

附图说明

图1为对比例1和实施例1中制备的人工真皮的SEM图；

图2为对比例2和实施例2中制备的人工真皮的SEM图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例提供一种人工真皮，通过以下步骤制得：

(1)配制人工真皮原料的溶液：取0.6g胶原和0.06g硫酸软骨素分散于100g 0.05M醋酸溶液中，高速分散，形成0.66wt％胶原-硫酸软骨素溶液；

(2)在所述人工真皮原料的溶液中加入0.05％戊二醛溶液，搅拌1h，然后脱泡处理得到复合液；

(3)将所述复合液灌注到模具中，往灌注好复合液的模具上喷洒一层0.2mol/L氯化钠溶液，后进行两次冻融处理，具体过程为：将模具转移到-60℃超低温冰箱中，第一次冷冻2h后，取出在室温下进行第一解冻，第一解冻的时间为10min，此时氯化钠溶液形成的表面结晶尚未融化，再放回超低温冰箱中继续第二次冷冻2h，取出在室温下再进行第一解冻，第一解冻的时间为10min，此时氯化钠溶液形成的表面结晶尚未融化；

经上述两次冻融处理后，再放回超低温冰箱中继续第三次冷冻24h，取出在室温下进行第三解冻，第三解冻的时间为2h；

(4)然后再放回超低温冰箱中第四次冷冻4h，然后取出在室温下静置进行第二解冻，第二解冻的时间为2h，经第二解冻后所有冷冻物融化，将样品进行清洗3次，除去多余的盐和戊二醛溶液，然后浸泡在PBS溶液，灭菌保存。

实施例2

对比例1：对比例1提供一种人工真皮，其制备过程与实施例1相同，不同之处在于步骤(3)中未喷洒氯化钠溶液。

取对比例1和实施例1中制备的人工真皮进行表征对比，其SEM图如图1所示，其中a表示对比例1中的人工真皮，b表示实施例1中的人工真皮。从图中可以看出未喷洒氯化钠溶液制备得到的人工真皮的支架表面呈闭孔结构，而本发明中喷洒氯化钠溶液制备得到的人工真皮的支架表面呈开孔结构，有利于细胞的迁入和长入，可见通过加入盐溶液能够解决反复冷冻过程中，因为胶原凝胶不断冻结变形导致传质不均最终表面堆积一层致密的胶原壳的问题，此外盐溶液位于复合液的表面，不会对人工支架的内部结构产生影响。

实施例3

对比例2：对比例2提供一种人工真皮，其制备过程与实施例1相同，不同之处在于步骤(3)中两次经第一解冻处理后盐溶液形成的表面结晶融化。

取对比例2和实施例2中制备的人工真皮进行表征对比，其SEM图如图2所示，其中a表示对比例2中的人工真皮，b表示实施例1中的人工真皮。从图中可以看出对比例2中的人工真皮的支架表面呈闭孔结构，实施例1中的人工真皮的支架表面呈开孔结构，这是因为超低温冷冻对于胶原来说也是一个物理交联的过程，然而，这种交联只是轻度的交联，在经过前面2次的冻融处理过程中，交联凝胶未成型，如果冻融处理过程中经第一解冻至盐溶液形成的表面结晶完全融化，再次冷冻时，胶原凝胶可能会发生传质不均，在表面堆积形成密闭结构，而在2次反复冷冻之后，胶原支架基本成型，不会随着再次冷冻而发生传质分离，因此，通过控制冻融处理过程中经第一解冻至所述盐溶液形成的表面结晶处于未融化状态，能够确保制备得到的人工真皮具有较好贯通性的孔结构，避免了进行冷冻干燥-交联处理方式容易开裂的问题，利用本发明的方法制备出的人工真皮支架不会塌陷和收缩，有利于保持结构的完整，可以不经过裁切，直接制定成需求的尺寸。

实施例4

本实施例提供一种人工真皮，通过以下步骤制得：

(1)配制人工真皮原料的溶液：取0.6g胶原和0.1g壳聚糖分散于100mL 0.05M醋酸溶液中，形成0.7wt％胶原-壳聚糖溶液；

(2)在所述人工真皮原料的溶液中加入0.01％戊二醛溶液，搅拌2h，然后脱泡处理得到复合液；

(3)将所述复合液灌注到模具中，往灌注好复合液的模具上喷洒一层0.8mol/L氯化钠溶液，后进行冻融处理，具体过程为：将模具转移到-60℃超低温冰箱中，冷冻1h后，取出在室温下进行第一解冻，第一解冻的时间为10min，此时氯化钠溶液形成的表面结晶尚未融化；

经上述冻融处理后，再放回超低温冰箱中继续冷冻8h，取出在室温下进行第三解冻，第三解冻的时间为2h；

(4)然后再放回超低温冰箱中冷冻18h，然后取出在室温下静置进行第二解冻，第二解冻的时间为2h，经第二解冻后所有冷冻物融化，将样品进行清洗3次，除去多余的盐和戊二醛溶液，然后浸泡在PBS溶液，灭菌保存。

实施例5

本实施例提供一种人工真皮，通过以下步骤制得：

(1)配制人工真皮原料的溶液：取胶原分散于水中形成0.35wt％胶原溶液；

(2)在所述人工真皮原料的溶液中加入0.10％戊二醛溶液，搅拌2h，然后脱泡处理得到复合液；

(3)将所述复合液灌注到模具中，往灌注好复合液的模具上喷洒一层0.4mol/L氯化钾溶液，后进行冻融处理，具体过程为：将模具转移到-60℃超低温冰箱中，冷冻1h后，取出在室温下进行第一解冻，第一解冻时间为10min，此时氯化钠溶液形成的表面结晶尚未融化；

再放回超低温冰箱中继续冷冻8h，取出在室温下进行第三解冻，第三解冻的时间为2h；

(4)然后再放回超低温冰箱中冷冻18h，然后取出在室温下静置进行第二解冻，第二解冻的时间为2h，经第二解冻后所有冷冻物融化，将样品进行清洗3次，除去多余的盐和戊二醛溶液，然后浸泡在PBS溶液，灭菌保存。

Claims (10)

1.一种人工真皮的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)配制人工真皮原料的溶液，所述人工真皮原料包含胶原；

(2)在所述人工真皮原料的溶液中加入交联剂，混合得到复合液；

(3)在所述复合液表面喷洒盐溶液，后进行冻融处理，所述冻融处理包括冷冻和第一解冻；在所述冻融处理过程中，所述盐溶液经冷冻形成表面结晶，然后经第一解冻至所述盐溶液形成的表面结晶处于未融化状态；

(4)冷冻并进行第二解冻，经所述第二解冻至所有冷冻物完全融化，清洗。

2.根据权利要求1所述的人工真皮的制备方法，其特征在于，所述盐溶液包括氯化钠溶液、氯化钾溶液、磷酸钠溶液、磷酸钾溶液、硝酸钠溶液、硝酸钾溶液中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的人工真皮的制备方法，其特征在于，所述盐溶液的浓度不小于0.2mol/L。

4.根据权利要求1-3任一项所述的人工真皮的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述冻融处理至少进行两次，并且前两次冻融处理中冷冻时间大于1h。

5.根据权利要求1-3任一项所述的人工真皮的制备方法，其特征在于，在步骤(3)和步骤(4)之间还包括冷冻和第三解冻的步骤，经所述第三解冻达到的状态包括所有冷冻物从未融化状态至完全融化状态中的任意状态。

6.根据权利要求5所述的人工真皮的制备方法，其特征在于，冷冻的总次数为3～5次。

7.根据权利要求1-3、6任一项所述的人工真皮的制备方法，其特征在于，所述人工真皮原料还包括壳聚糖、海藻酸钠、肝素钠、硫酸软骨素、透明质酸的至少一种。

8.根据权利要求1-3、6任一项所述的人工真皮的制备方法，其特征在于，人工真皮原料的质量分数为0.35wt％～0.7wt％。

9.根据权利要求1-3、6任一项所述的人工真皮的制备方法，其特征在于，步骤(1)和/或步骤(2)中还加入有药物。

10.一种人工真皮，其特征在于，由权利要求要求1-9任一项所述的人工真皮的制备方法制得。