CN107519535A - 可降解海藻酸钠/丝素双层皮肤组织工程支架材料及其制备方法 - Google Patents

可降解海藻酸钠/丝素双层皮肤组织工程支架材料及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种可降解海藻酸钠/丝素双层皮肤组织工程支架材料及其制备方法，该支架材料结构仿生正常皮肤组织，包括与空气接触、由海藻酸钠薄膜组成的仿表皮层，以及与机体创面接触由丝素/海藻酸钠共混多孔支架材料组成的仿真皮层，通过冷冻干燥一步法将两层有效复合起来。该材料采用天然再生的丝素和海藻酸钠作为基材，可生物降解且具有良好的生物相容性，其仿真皮层可诱导细胞长入和增殖，适用于深度皮肤缺损的修复，具有良好的临床应用前景。

Description

可降解海藻酸钠/丝素双层皮肤组织工程支架材料及其制备 方法
技术领域
本发明涉及皮肤组织工程材料技术领域，具体涉及一种可降解海藻酸钠/丝素双层皮肤组织工程支架材料及其制备方法。
背景技术
当患者皮肤遭受到车祸、大面积烧伤、糖尿病慢性溃疡等严重创伤时(III度)，不能够依靠自身修复能力愈合，传统自体单层皮肤移植手术仍然是目前修复重度全层皮肤损伤的重要临床治疗方法。但该方法存在来源短缺、二次伤害等问题，同时严重的外伤创面在愈合过程中容易出现组织感染、坏死等不良现象，愈合后形成的瘢痕组织容易出现挛缩，继而引起局部功能障碍。利用组织工程的方法构建具有类似正常皮肤组织结构的人工皮肤是目前解决这类严重创面再生修复问题的有效手段。目前，商品化人工皮肤在临床上已经使用了接近30年，如以及等，这些产品有效提高了患者的治愈率，为严重皮肤损伤康复带来了诸多好处，具有良好的发展前景。
目前，在皮肤组织工程学中，通常选择多孔材料作为人工皮肤，这是由于多孔材料具备微孔结构和模板支撑作用，更加利于皮肤修复，但是单层多孔材料存在力学性能差，孔结构容易坍塌等缺点。而海藻酸钠/丝素双层皮肤组织工程支架材料是采用生物相容性良好的丝素和透气吸水的海藻酸钠，用冷冻干燥复合技术制备的一种具备不对称双层结构的、稳定的多孔支架材料，仿生正常皮肤组织结构，克服单层支架材料力学性能差的缺点。
丝素蛋白来源丰富、成本低廉、无刺激性、具备良好的透氧性，可控的生物降解性，在体外可支持各种细胞黏附、生长和分化；在体内，同样具备良好组织相容性。海藻酸钠作为一种传统的医用生物材料，广泛适用于传统生物材料领域，比如用作伤口敷料、齿科印模以及骨移植替代物，某些产品也已通过FDA批准上市。随着再生医学和组织工程新技术的不断发展，海藻酸钠逐渐在细胞固定、载药缓释、组织工程以及可注射凝胶等领域也有广泛应用。作为具有研究潜力的两种天然高分子，各自单独使用时，都有自身的缺陷，限制了其作为生物材料在组织工程领域的应用。一直以来，人工皮肤同样经历了从单一组分到多组分模拟皮肤组成，从薄膜到多孔结构再到仿生双层结构模拟皮肤的结构，故在组成上仿生ECM，将丝素和海藻酸钠复合，仿生正常皮肤组织结构，开发新型双层支架材料并应用于皮肤组织工程领域，具有广阔的市场前景和意义重大。
发明内容
本发明的目的在于克服现有皮肤损伤修复材料存在的上述缺点，提供一种可降解海藻酸钠/丝素双层皮肤组织工程支架材料及其制备方法。该材料以来源广泛、天然可降解的丝素和海藻酸钠为原料，结构上模拟真皮和表皮组织，组成上模拟了细胞外基质，具有较好的力学性能，在皮肤组织工程材料领域有较好的应用前景。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种可降解海藻酸钠/丝素双层皮肤组织工程支架材料，包括与空气接触由海藻酸钠薄膜组成的上层，以及与机体创面接触由丝素/海藻酸钠共混多孔支架材料组成的下层，所述上层与下层通过冷冻干燥处理在两层之间形成牢固的结合点进行复合。
按照上述方案，上层薄膜的厚度为0.05mm，下层丝素/海藻酸钠共混多孔支架材料的孔隙率不低于90％，孔径100-200μm。
上述可降解海藻酸钠/丝素双层皮肤组织工程支架材料的制备方法，包括以下步骤：(a)依次向海藻酸钠水溶液中加入N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、吗啉-乙磺酸(MES)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，充分搅拌后真空脱泡，接着将混合溶液注入模具中成型，得到海藻酸钠薄膜；(b)制备丝素水溶液，向其中滴加海藻酸钠水溶液并搅拌，依次加入NHS、MES和EDC，充分搅拌后真空脱泡得到交联后的丝素/海藻酸钠共混溶液；(c)将裁剪好的海藻酸钠薄膜固定，将丝素/海藻酸钠共混溶液快速倾倒在薄膜上直至其完全被溶液覆盖，接着冷冻即得。
按照上述方案，所述海藻酸钠水溶液的质量分数为2-3％。
按照上述方案，步骤(a)和步骤(b)中加入的NHS、MES、EDC质量比为1:2:2，以EDC与溶质质量比不高于20％为限，混合溶液中EDC的体积浓度范围为0.3％-0.5％。
按照上述方案，步骤(a)中室温充分搅拌均匀后真空脱泡，混合溶液注入模具中成型后还需在60℃环境干燥得到海藻酸钠薄膜。
按照上述方案，步骤(b)中丝素水溶液的制备方法具体为：将脱胶后的丝素纤维置于CaCl2-乙醇-水三元溶液中，加热使溶液的温度控制在72℃保温1h，溶解后经透析、过滤、风干浓缩得到丝素水溶液，所述CaCl2-乙醇-水三元溶液中CaCl2、乙醇、水三者的物质量之比为1:2:8。
按照上述方案，步骤(b)中按照丝素与海藻酸钠x：(1-x)的质量比将等质量分数的海藻酸钠水溶液缓慢滴加到丝素水溶液中，其中x的取值范围为0.3-0.8。
按照上述方案，步骤(c)中所述冷冻包括首先置于-10～-80℃的环境中预冷冻6小时以上，接着转入-50℃的环境中真空干燥48小时得到干燥的双层支架材料，用去离子水洗涤后在同样条件下再次冷冻干燥即得。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：(1)以天然可再生的高分子材料丝素和海藻酸钠为原料，材料来源广泛且均为天然可降解高分子，降解产物具有良好的生物相容性；(2)采用EDC交联、用冷冻干燥物理复合技术制备了稳固的丝素/海藻酸钠双层多孔支架材料，结构上模拟了真皮和表皮组织，组成上模拟了细胞外基质，构建了仿生正常皮肤组织的双层多孔支架材料，与同类单层多孔材料相比，其力学性能显著提高；(3)本发明提供的双层支架材料制备工艺简单，条件易于控制，具有较好的应用前景。
附图说明
图1为本发明可降解海藻酸钠/丝素双层皮肤组织工程支架材料的结构示意图；
图2为本发明实施例一制备的1#皮肤组织工程支架材料的SEM图，其中图2-a(左)和图2-b(右)分别为支架材料的竖切面和横切面；
图3为本发明实施例三制备的3#皮肤组织工程支架材料的SEM图，其中图3-a(左)和图3-b(右)分别为支架材料的竖切面和横切面；
图4为本发明实施例一制备的1#皮肤组织工程支架材料的三维立体图；
图5为本发明实施例三制备的3#皮肤组织工程支架材料的三维立体图。
具体实施方式
为使本领域普通技术人员充分理解本发明的技术方案和有益效果，以下结合具体实施例进行进一步说明。
本发明所用试剂和原料均为普通市售。质量分数为2％的丝素水溶液的制备方法如下：将脱胶后的丝素纤维置于CaCl2-乙醇-水三元溶液中(其中CaCl2:乙醇:水物质的量之比为1:2:8)，加热控制溶液的温度为72℃，保温1h，待其完全溶解后经过透析、过滤、风干浓缩至相应浓度后即得丝素水溶液。EDC纯度≥97％，直接购于Sigma-Aldrich试剂公司。
实施例一
(1)取40ml质量分数为3％的海藻酸钠溶液，向其中依次加入NHS0.12g，MES0.24g，EDC0.24g，室温下在磁力搅拌器上搅拌0.5h后真空脱泡，将混合溶液倒入10×20cm聚四氟乙烯模具中，在60℃烘箱中干燥2.5h，干燥成膜。
(2)将质量分数为2％的海藻酸钠水溶液缓慢滴入质量分数同为2％的丝素水溶液中，使得丝素与海藻酸钠的质量比为75:25，混合溶液总体积为20ml。在磁力搅拌器上缓慢搅拌均匀混合溶液，依次加入NHS0.04g，MES0.08g，EDC0.08g，在室温下充分搅拌均匀(0.5h)后真空脱泡，得到交联后的丝素/海藻酸钠水溶液20ml。
(3)将步骤(1)中的海藻酸钠薄膜剪成10×10cm大小，置于10×10cm不锈钢模具底部，将步骤(2)中的20ml丝素/海藻酸钠水溶液快速倾倒在已固定好海藻酸钠薄膜的模具中，直至溶液完全覆盖薄膜，将模具快速放入-40℃低温冰箱中冷冻6小时以上。
(4)将预冻好的材料快速放入冷冻干燥机中，在低温-50℃下真空干燥48小时，得到干燥的双层支架材料。用去离子水洗净材料，再次冷冻干燥，即得1#海藻酸钠/丝素双层皮肤组织工程支架材料。
本实施例制得的1#海藻酸钠/丝素双层皮肤组织工程支架材料结构如图1和4所示，具有与空气接触由海藻酸钠薄膜组成的上层，以及与机体创面接触由丝素/海藻酸钠共混多孔支架材料组成的下层双层结构，其横竖切面的SEM图如图2所示。从竖切面来看，其薄膜层厚度约为0.03mm，多孔材料层厚度约为2.5mm；在垂直方向上，形成了定向排列的狭长大孔，图4a同样说明了双层材料的结构特点。经分析测试，该1#支架材料的拉伸强度为294KPa，横截面平均孔径为112μm，孔隙率为92％。
实施例二
(1)取40ml质量分数为3％的海藻酸钠溶液，依次加入NHS0.12g，MES0.24g，EDC0.24g，常温下在磁力搅拌器上搅拌0.5h后真空脱泡，将混合溶液倒入10×20cm聚四氟乙烯模具中，在60℃烘箱中干燥2.5h，干燥成膜。
(2)将质量分数为2％的海藻酸钠水溶液缓慢滴入质量分数同为2％的丝素水溶液中，使得丝素与海藻酸钠的质量比为75:25，混合溶液总体积为25ml。在磁力搅拌器上缓慢搅拌均匀混合溶液，依次加入NHS0.05g，MES0.10g，EDC0.10g，在室温下充分搅拌均匀(0.5h)后真空脱泡，得到交联后的丝素/海藻酸钠水溶液25ml。
(3)将步骤(1)中的海藻酸钠薄膜剪成10×10cm大小，置于10×10cm不锈钢模具底部，将步骤(2)中的25ml丝素/海藻酸钠水溶液快速倾倒在已固定好薄膜的模具中，直至溶液完全覆盖薄膜，将模具快速放入-40℃低温冰箱中冷冻6小时以上。
(4)将预冻好的材料快速放入冷冻干燥机中，在低温-50℃下真空干燥48小时，得到干燥的双层支架材料。用去离子水洗净材料，再次冷冻干燥，即得2#海藻酸钠/丝素双层皮肤组织工程支架材料。
经分析测试，该2#支架材料的拉伸强度为305KPa，横截面平均孔径为110μm，孔隙率为91％
实施例三
(1)取40ml质量分数为3％的海藻酸钠溶液，依次加入NHS0.12g，MES0.24g，EDC0.24g，常温下在磁力搅拌器上搅拌0.5h后真空脱泡，将混合溶液倒入10×20cm聚四氟乙烯模具中，在60℃烘箱中干燥2.5h，干燥成膜。
(2)将质量分数为2％的海藻酸钠水溶液缓慢滴入质量分数同为2％的丝素水溶液中，使得丝素与海藻酸钠的质量比为50:50，混合溶液总体积为20ml，在磁力搅拌器上缓慢搅拌均匀，依次加入NHS0.04g，MES0.08g，EDC0.08g，在室温下充分搅拌均匀(0.5h)后真空脱泡，得到交联后的丝素/海藻酸钠水溶液20ml。
(3)将步骤(1)中的海藻酸钠薄膜剪成10×10cm大小，置于10×10cm不锈钢模具底部，将步骤(2)中的20ml丝素/海藻酸钠水溶液快速倾倒在已固定好薄膜的模具中，直至溶液完全覆盖薄膜，将模具快速放入-40℃低温冰箱中冷冻6小时以上。
(4)将预冻好的材料快速放入冷冻干燥机中，在低温-50℃下真空干燥48小时，得到干燥的双层支架材料。用去离子水洗净材料，再次冷冻干燥，即得3#海藻酸钠/丝素双层皮肤组织工程支架材料。
本实施例制得的3#海藻酸钠/丝素双层皮肤组织工程支架材料的横竖切面SEM图和三维立体图如图3和图5所示。该双层材料同样具有薄膜层和多孔层结构，其薄膜层厚度略厚，约为0.05mm，多孔材料层厚度约为2.5mm；在垂直方向上，形成了定向排列的狭长大孔，双层结构更加明显，薄膜层和多孔材料层结合紧密，图5a同样说明了双层材料的结构特点。经分析测试，该3#支架材料的拉伸强度为598KPa，横截面平均孔径为106μm，孔隙率为91％。
实施例四
(1)取40ml质量分数为3％的海藻酸钠溶液，依次加入NHS0.12g，MES0.24g，EDC0.24g，常温下在磁力搅拌器上搅拌0.5h，将混合溶液倒入10×20cm聚四氟乙烯模具中，在60℃烘箱中干燥2.5h，干燥成膜。
(2)将质量分数为2％的海藻酸钠水溶液缓慢滴入质量分数同为2％的丝素水溶液中，使得丝素与海藻酸钠的质量比为50:50，混合溶液总体积为25ml。在磁力搅拌器上缓慢搅拌均匀混合溶液，依次加入NHS0.04g，MES0.08g，EDC0.08g，在室温下充分搅拌均匀(0.5h)后真空脱泡，得到交联后的丝素/海藻酸钠水溶液25ml。
(3)将步骤(1)中的海藻酸钠薄膜剪成10×10cm大小，置于10×10cm不锈钢模具底部，将步骤(2)中的20ml丝素/海藻酸钠水溶液快速倾倒在已固定薄膜的模具中，直至溶液完全覆盖薄膜，将模具快速放入-40℃低温冰箱中冷冻6小时以上。
(4)将预冻好的材料快速放入冷冻干燥机中，在低温-50℃下真空干燥48小时，得到干燥的双层支架材料。用去离子水洗净材料，再次冷冻干燥，即得4#海藻酸钠/丝素双层皮肤组织工程支架材料。
经分析测试，该4#支架材料的拉伸强度为610KPa，横截面平均孔径为105μm，孔隙率为90％。
上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式的改变，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (9)

1.一种可降解海藻酸钠/丝素双层皮肤组织工程支架材料，其特征在于：所述支架材料包括与空气接触由海藻酸钠薄膜组成的上层，以及与机体创面接触由丝素/海藻酸钠共混多孔支架材料组成的下层，所述上层与下层经冷冻干燥处理在两层之间形成牢固的结合点进行复合。
2.如权利要求1所述的一种可降解海藻酸钠/丝素双层皮肤组织工程支架材料，其特征在于：上层薄膜的厚度为0.05mm，下层丝素/海藻酸钠共混多孔支架材料的孔隙率不低于90％，孔径100-200μm。
3.权利要求1所述可降解海藻酸钠/丝素双层皮肤组织工程支架材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)依次向海藻酸钠水溶液中加入N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、吗啉-乙磺酸(MES)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)充分搅拌后真空脱泡，接着将混合溶液注入模具中成型，得到海藻酸钠薄膜；(b)制备丝素水溶液，向其中滴加海藻酸钠水溶液并搅拌，依次加入NHS、MES和EDC，充分搅拌后真空脱泡，得到交联后的丝素/海藻酸钠共混溶液；(c)将裁剪好的海藻酸钠薄膜固定，将丝素/海藻酸钠共混溶液快速倾倒在薄膜上直至其完全被溶液覆盖，接着冷冻即得。
4.如权利要求3所述的可降解海藻酸钠/丝素双层皮肤组织工程支架材料的制备方法，其特征在于：所述海藻酸钠水溶液的质量分数为2-3％。
5.如权利要求3所述的可降解海藻酸钠/丝素双层皮肤组织工程支架材料的制备方法，其特征在于：步骤(a)和步骤(b)中加入的NHS、MES和EDC质量比为1:2:2，以EDC与溶质质量比不高于20％为限，混合溶液中EDC的体积浓度范围为0.3％-0.5％。
6.如权利要求3所述的可降解海藻酸钠/丝素双层皮肤组织工程支架材料的制备方法，其特征在于：步骤(a)中室温充分搅拌均匀后真空脱泡，混合溶液注入模具中成型后还需在60℃环境干燥得到海藻酸钠薄膜。
7.如权利要求3所述的可降解海藻酸钠/丝素双层皮肤组织工程支架材料的制备方法，其特征在于：步骤(b)中丝素水溶液的制备方法具体为：将脱胶后的丝素纤维置于CaCl2-乙醇-水三元溶液中，加热使溶液的温度控制在72℃保温1h，溶解后经透析、过滤、风干浓缩得到丝素水溶液，所述CaCl2-乙醇-水三元溶液中CaCl2、乙醇、水三者的物质量之比为1:2:8。
8.如权利要求3所述的可降解海藻酸钠/丝素双层皮肤组织工程支架材料的制备方法，其特征在于：步骤(b)中按照丝素与海藻酸钠x：(1-x)的质量比将海藻酸钠水溶液缓慢滴加到丝素水溶液中，其中x的取值范围为0.3-0.8，海藻酸钠水溶液与丝素水溶液的质量分数相等。
9.如权利要求3所述的可降解海藻酸钠/丝素双层皮肤组织工程支架材料的制备方法，其特征在于：步骤(c)中所述冷冻包括首先置于-10～-80℃的环境中预冷冻6小时以上，接着转入-50℃的环境中真空干燥48小时得到干燥的双层支架材料，用去离子水洗涤后在同样条件下再次冷冻干燥即得。
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