CN109395162A - 一种天然蛋白基仿生结构骨支架的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种天然蛋白基仿生结构骨支架的制备方法,以丝素蛋白和羊毛蛋白为主要原料,将丝素蛋白溶液与甘油按照质量比60~120:20~60均匀混合,注入骨支架模具中,再将羊毛角蛋白溶液缓慢注入上述混合溶液中,然后通过‑40~‑20ºC冻存和1.0×105~1.0Pa、‑72~5ºC真空冷冻干燥的方法得到丝素蛋白/羊毛角蛋白仿生骨支架材料。所制得的支架材料类似于自体骨结构,孔隙率达到70‑95%,且孔径分布均匀,外层致密,且孔径较小,直径范围为30‑150μm,能为支架材料提供一定的机械支撑性能,内部孔径较大,直径范围为150‑600μm,适宜于细胞的迁移、依附与增殖。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域,具体涉及一种天然蛋白基仿生结构骨支架的制备方法。
背景技术
由于先天性缺陷或感染、外伤以及肿瘤切除等因素造成的骨缺损疾病一直困扰着世界上数以千万的患者。传统的外科手术治疗方法和放、化疗方法通常很难有效地达到治疗目的,而器官移植不但费用昂贵且供体资源少,而且存在疾病传染和交叉感染的风险,无法作为常规治疗手段。近年来,组织工程材料的发展为治疗该类疾病提供了新的有效途径。其中,骨缺损修复支架材料成为临床上需求量最大的生物医用材料之一。所以,研制和开发出理想的人工骨支架一直是科学工作者们的热点研究课题。
目前临床上使用的人工骨修复材料主要分为人工合成高分子材料和天然高分子材料,它们在生物活性、生物相容性、生物可降解性、力学性能和使用寿命等方面具有各自的优缺点。但是这些材料普遍存在的问题是新骨生长受局部微环境的限制,爬行替代缓慢,在治疗大范围骨缺损时,难以实现支架与骨的整合以及缺损区的完整修复和重建。骨缺损修复和再生需要适宜的外界微环境,如果材料的内部框架结构不能模拟自体骨细胞外基质形成的网络结构,不利于细胞相互之间的联系及信息传递,参与骨修复的细胞生长和迁移受限,难以实现骨整合。要从根本上解决植入体与宿主骨组织的整合问题,需通过调控支架材料的构成组分和微观仿生结构来优化其性能。人体自体骨外部密集内部疏松,外部密集,孔径较小,却具有优异的力学性能,能起到很好的支撑与抗压性能;内部孔径较大,给细胞的吸附、增殖和迁移提供了很好的空间。
丝素蛋白是蚕丝的主要组成部分,是一种天然高分子纤维蛋白,含有18种氨基酸,其中以甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸为主,它具有良好的生物相容性,适宜的机械性能及可降解性等优异性能,目前它广泛应用于生物医学材料领域。丝素蛋白多孔材料制备方面,有采用冷冻干燥工艺,对丝素蛋白以及有机溶剂的混合溶液进行冻干制得丝素蛋白微孔支架;也有在丝素蛋白溶液中加入适量的变性剂(醇类),冷冻融解后获得多孔材料,然后经醇类溶液浸洗,冷冻干燥获得多孔材料。这两种人工骨材料的制备过程中,添加的有机溶剂不能挥发完全,不利于改善材料的生物相容性,另外,材料结构与人体自体骨结构也不同。最新的研究结果显示,以丝素蛋白和羊毛蛋白为材料,可以用来制备力学性能优异、降解性能优良及生物相容性好的生物膜材料。羊毛蛋白是作为一种天然纤维状的蛋白质,其氨基酸序列中存在促进骨细胞吸附的RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)三肽序列,对具有良好的生物相容性,对细胞的贴附和生长有积极促进作用,因此羊毛蛋白在生物医用材料应用方面有着天然的优势。
本发明人在前期研究中,利用丝素蛋白和羊毛蛋白制备具有孔隙及其尺寸均匀分布的复合多孔结构材料。然而,人体自体骨外部密集内部疏松,外部密集,孔径较小,却具有优异的力学性能,能起到很好的支撑与抗压性能;内部孔径较大,给细胞的吸附、增殖和迁移提供了很好的空间。
针对上述问题,本发明提出了一种以丝素蛋白和羊毛蛋白为原料,采用梯度法的冷冻干燥工艺,制备类似人体自体骨的骨支架材料。
发明内容
本发明目的是:提供一种天然蛋白基仿生结构骨支架制备方法,针对传统方法的不足,发明一种仿生人工骨结构,具有优良生物相容性,制作工艺简单的丝素蛋白/羊毛蛋白仿生骨支架。
本发明的一种技术方案是:
一种天然蛋白基仿生结构骨支架的制备方法,该方法包括如下步骤:
(1)离子沉淀法制备羊毛角蛋白:将羊毛纤维浸入至NaOH溶液中,待所述羊毛纤维完全溶解后,将水解溶液在室温下保持稳定,调节pH值,分离收集沉淀物,得到羊毛角蛋白粉末,将所述羊毛角蛋白粉末溶于去离子水中,得到羊毛角蛋白溶液;
(2)高压水煮法制备丝素蛋白:将纯水加热至沸腾,加入无水Na2CO3,充分溶解获得碳酸钠溶液,将蚕丝加入所述碳酸钠溶液中,搅拌、干燥,获得脱胶蚕丝,将所述脱胶蚕丝浸于三元混合液中,得到混合液,将所述混合液密封加热后透析、离心、浓缩,得到丝素蛋白溶液;
(3)两种天然蛋白溶液混合搅拌法制备天然基蛋白仿生结构骨支架:将所述丝素蛋白溶液和甘油均匀混合后倒入骨支架模具中静置,采用注液器量取所述羊毛角蛋白溶液,在所述骨支架模具的混合液中心注入羊毛角蛋白溶液,得到自然梯度分层的丝素蛋白/羊毛角蛋白溶液,利用真空静置法对所述丝素蛋白/羊毛角蛋白溶液进行脱泡,然后将所述丝素蛋白/羊毛角蛋白溶液经过冻存和真空冷冻干燥,获得天然蛋白基仿生结构骨支架。
进一步的,步骤(1)中所述NaOH溶液的浓度为2%,所述保持稳定的时间为48小时,所述pH值=5.55。
进一步的,步骤(1)中所述分离收集沉淀物,得到羊毛角蛋白粉末的过程为将所述沉淀物通过转速为5000 r/min的离心机进行分离收集,然后沉淀物再分散在去离子水,并通过离心再次收集,随后将沉淀物分散于无水乙醇中并再次离心,此过程重复4次,所得沉淀物即为羊毛角蛋白粉末。
进一步的,步骤(1)中所述羊毛角蛋白溶液的质量分数为6%-10%。
进一步的,步骤(2)中所述搅拌、干燥为每隔10min搅拌一次,煮30min,取出后用纯水反复搓洗3次后,置于通风处过夜干燥。
进一步的,步骤(2)中所述三元混合液中CaCl2:乙醇:H2O=1:2:8。
进一步的,步骤(2)中将所述混合液密封加热后透析、离心、浓缩,得到丝素蛋白溶液具体为:将所述混合液密封置于80℃烘箱中1小时后取出,然后将所述混合液装入透析袋,在去离子水中透析36h,每9h换一次透析液,将透析完成后的溶液以9000 r/min的速度离心两次,最后置于60℃烘箱中进行浓缩。
进一步的,步骤(2)中所述丝素蛋白溶液的质量分数为6%-10%。
进一步的,步骤(3)中所述丝素蛋白溶液和甘油的质量比为60~120:20~60,所述均匀混合的时间为20-30min,所述静置时间为5-10min,所述羊毛角蛋白溶液与所述丝素蛋白溶液的质量比为5:5~7:3,所述注入速度为1~5 mL/min,所述冻存的温度为-40~-20℃,冷冻时间为12h,所述真空冷冻干燥的压力为1.0×105~1.0Pa,温度为-72~5℃,时间为48h。
进一步的,步骤(3)中所述利用真空静置法对所述丝素蛋白/羊毛角蛋白溶液进行脱泡的具体方法为:将混合溶液置入密闭真空箱中,对密闭真空箱抽真空,静止15-30 min时间后,混合溶液中的气泡自动膨胀溢出表面。
本发明提供了一种天然蛋白基仿生结构骨支架及其制备方法,其优点是:
(1)本发明制备的仿生骨支架材料,与人体自体骨结构类似,外层致密,为支架提供了良好的力学性能,内层孔径较大,为细胞的依附、增殖和迁移提供了适宜的空间;
(2)本发明所述材料为天然材料,安全无毒、生物相容性好,适合广泛应用于生物医用材料等领域,且原材料来源广泛,工艺过程简单,价格低廉;
(3)本发明所述的复合多孔材料孔隙率和孔径大小,可通过工艺参数调控,制得满足生物医用要求的仿生骨支架材料;
(4)本发明所用材料可以直接被人体吸收,无需二次手术取出;
(5)符合国家生物医药产业的发展和学科交叉规划,是具有巨大发展潜力和广阔市场前景的新兴行业领域。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其它的附图。其中,
图1为本发明所述的一种天然蛋白基仿生结构骨支架的制备方法在实施例3中所制备的三种不同浓度的丝素蛋白/羊毛蛋白多孔材料的截面电镜图,其中A-C分别为S/W-10/10wt%、S/W-10/6wt%、S/W-6/6 wt%;分别表示外层为10%、10%和6%的丝素溶液与内部为10%、6%和6%的羊毛蛋白形成的多孔材料;
图2为本发明所述的一种天然蛋白基仿生结构骨支架的制备方法在实施例3中所制备的三种不同浓度的丝素蛋白/羊毛蛋白多孔材料的红外图,其中1616~ 1637cm-1峰位置显示β折叠;
图3为本发明所述的一种天然蛋白基仿生结构骨支架的制备方法在实施例3中所制备的三种不同浓度的丝素蛋白/羊毛蛋白多孔材料的XRD图,其中20.7°为silk II结构;
图4为本发明所述的一种天然蛋白基仿生结构骨支架的制备方法在实施例3中所制备的三种不同浓度的丝素蛋白/羊毛蛋白多孔材料的压缩强度柱状图;
图5为本发明所述的一种天然蛋白基仿生结构骨支架的制备方法在实施例3中所制备的三种不同浓度的丝素蛋白/羊毛蛋白多孔材料的孔隙率柱状图。
具体实施方式
本发明提供一种天然蛋白基仿生结构骨支架以丝素蛋白和羊毛角蛋白为主要原料,将丝素蛋白溶液与甘油均匀混合,注入骨支架模具中,再将羊毛角蛋白溶液缓慢注入上述混合溶液中,然后通过冷冻和真空干燥的方法得到丝素蛋白/羊毛角蛋白仿生骨支架材料。所制得的支架材料类似于自体骨结构,孔径分布均匀,外层致密,能为支架材料提供一定的机械支撑性能,内部孔径较大,适宜于细胞的迁移、依附与增殖。
上述复合多孔材料的制备方法,步骤如下:
(1)离子沉淀法制备羊毛角蛋白;
(2)高压水煮法制备丝素蛋白;
(3)两种天然蛋白溶液混合搅拌法制备天然蛋白基仿生结构骨支架。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂,下面结合具体实施方式和附图对本发明作进一步详细的说明。
一种天然蛋白基仿生结构骨支架的制备方法,包括:
步骤一、离子沉淀法制备羊毛角蛋白:
将原毛浸入恒温水浴中的2%的NaOH溶液。羊毛纤维完全溶解后,将水解的溶液在室温下保持稳定48个小时。然后用HCl(0.1M)将溶液调节至pH=5.55。沉淀物可在水解溶液的底部观察到,然后将沉淀物通过转速为5000 r/min的离心机进行分离收集,然后沉淀物再分散在去离子水,并通过离心再次收集,随后将沉淀物分散于无水乙醇中并再次离心,此过程重复4次,沉淀物即为羊毛角蛋白粉末。将羊毛角蛋白粉末溶于去离子水中得到质量分数为6%-10%的羊毛角蛋白溶液。
步骤二、高压水煮法制备丝素蛋白:
量取12 L纯水于脱胶锅加热,称取25g无水Na2CO3,待水即将沸腾时加入,使其充分溶解,然后称取30g蚕丝,待水沸腾后加入,每隔10 min搅拌一次,煮30 min,取出后用纯水反复搓洗3次后,置于通风厨中过夜干燥;称取10g脱胶蚕丝,放于300 mL烧杯中,量取100 mL三元混合液(CaCl2:乙醇:H2O=1:2:8),加入300 mL烧杯中,使蚕丝充分浸入,用塑胶手套封口,置于80 ℃烘箱中1小时后取出;然后将溶液装于透析袋于去离子水中透析36h,每9h换一次液;透析完成后的溶液以9000 r/min离心两次;最后至于60℃烘箱进行浓缩,根据要求得到6%-10%的丝素蛋白溶液。
步骤三、两种天然蛋白溶液混合搅拌法制备天然蛋白基仿生结构骨支架:
量取一定量的丝素蛋白溶液和适量的甘油按质量比100:40比例均匀混合20-30 min,采用量筒量取一定体积的混合溶液倒入指定的骨支架模具中,静置5-10 min后,按照与骨支架模具中含有的丝素蛋白溶液质量比为5:5~7:3的比例,采用注液器量取相应质量的羊毛角蛋白溶液,由骨支架模具混合溶液中心以1~5 mL/min注入羊毛角蛋白溶液,得到自然梯度分层的丝素蛋白/羊毛角蛋白溶液,利用真空静置法对混合溶液进行脱泡,即将混合溶液置入密闭真空箱中,对密闭真空箱抽真空,静止15-30 min时间后,混合溶液中的气泡就会自动膨胀溢出表面,将混合溶液经过-40~-20℃冰箱冷冻12h以后,置于压力为1.0×105~1.0Pa,温度为-72~5℃的真空干燥机48h后,形成复合支架。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂,下面结合附图和实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例,还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。
首先,此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例,也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
其次,本发明利用结构示意图等进行详细描述,在详述本发明实施例时,为便于说明,示意图会不依一般比例作局部放大,而且所述示意图只是实例,其在此不应限制本发明保护的范围。此外,在实际制作中应包含长度、宽度及深度的三维空间。
实施例1
本实施案例展示一种天然蛋白基仿生结构骨支架的制备方法,包括:
(1)碱性法制备出羊毛蛋白:使用1%~5%的NaOH溶液对一定量的羊毛纤维进行溶解后过滤,再用截留分子量为2000Da~20000Da的透析袋进行透析,透析1~5天,经过分子量为20000的浓度为15%聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)溶液浓缩12-24h,得到质量分数为3-10%的羊毛蛋白溶液。
(2)高压水煮法制备出丝素蛋白:对天然蚕丝进行脱胶、溶解,按照步骤(1)中方法透析和离心后,经过分子量为20000的浓度为15% PEG溶液浓缩6-12h,得到质量分数为10-20%的丝素蛋白溶液。
(3)两种天然蛋白溶液混合搅拌法:量取一定量的丝素蛋白溶液和适量的甘油按质量比100:40比例均匀混合20-30 min,采用量筒量取一定体积的混合溶液倒入指定的骨支架模具中,静置5-10 min后,按照与骨支架模具中含有的丝素蛋白溶液质量比为5:5~7:3的比例,采用注液器量取相应质量的羊毛角蛋白溶液,由骨支架模具混合溶液中心以1~5mL/min注入羊毛角蛋白溶液,得到自然梯度分层的丝素蛋白/羊毛角蛋白溶液,利用真空静置法对混合溶液进行脱泡,即将混合溶液置入密闭真空箱中,对密闭真空箱抽真空,静止15-30min时间后,混合溶液中的气泡就会自动膨胀溢出表面。
(4)将步骤(3)得到的混合溶液经过-20℃冰箱冷冻12h以后,置于真空干燥机48h后,形成复合支架。
实施例2
本实施案例展示一种天然蛋白基仿生结构骨支架的制备方法,包括:
(1)还原法制备出羊毛蛋白:以7M尿素、0.08M Na2S和0.8g十二烷基硫酸钠(SDS)配置100 mL溶液,再加入5g的羊毛纤维,水浴温度50℃进行8h的水浴处理,接着过滤,然后用截留分子量为2000Da~20000Da的透析袋进行透析,透析1~5天,经过分子量为20000的浓度为15%聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)溶液浓缩12-24h,得到质量分数为3-10%的羊毛蛋白溶液。
(2)高压水煮法制备出丝素蛋白:对天然蚕丝进行脱胶、溶解,按照步骤(1)中方法透析和离心后,经过分子量为20000的浓度为15% PEG溶液浓缩,得到质量分数为10-20%的丝素蛋白溶液。
(3)两种天然蛋白溶液混合搅拌法:量取一定量的丝素蛋白溶液和适量的甘油按质量比100:40比例均匀混合20-30 min,采用量筒量取一定体积的混合溶液倒入指定的骨支架模具中,静置5-10 min后,按照与骨支架模具中的丝素蛋白溶液质量比为5:5~7:3的比例,采用注液器量取相应质量的羊毛角蛋白溶液,由骨支架模具混合溶液中心以1~5 mL/min注入羊毛角蛋白溶液,得到自然梯度分层的丝素蛋白/羊毛角蛋白溶液,利用真空静置法对混合溶液进行脱泡,即将混合溶液置入密闭真空箱中,对密闭真空箱抽真空,静止15-30 min时间后,混合溶液中的气泡就会自动膨胀溢出表面。
(4)将步骤(3)得到的混合溶液经过-20℃冰箱冷冻12h以后,置于真空干燥机48h后,形成复合支架。
实施例3
本实施案例展示一种天然蛋白基仿生结构骨支架的制备方法,包括:
(1)离子沉淀法制备出羊毛蛋白:将原毛浸入恒温水浴中的2%的NaOH溶液。羊毛纤维完全溶解后,将水解的溶液在室温下保持稳定48个小时。然后用HCl(0.1M)将溶液调节至pH=5.55。沉淀物可在水解溶液的底部观察到,然后将沉淀物通过转速为5000 r/min的离心机进行分离收集,然后沉淀物再分散在去离子水,并通过离心再次收集,随后将沉淀物分散于无水乙醇中并再次离心,此过程重复4次,沉淀物即为羊毛角蛋白粉末。将羊毛角蛋白粉末溶于去离子水中得到质量分数为6%-10%的羊毛角蛋白溶液。
(2)高压水煮法制备出丝素蛋白:量取12 L纯水于脱胶锅加热,称取25 g无水Na2CO3,待水即将沸腾时加入,使其充分溶解,然后称取30g蚕丝,待水沸腾后加入,每隔10min搅拌一次,煮30 min,取出后用纯水反复搓洗3次后,置于通风厨中过夜干燥;称取10g脱胶蚕丝,放于300mL烧杯中,量取100 mL三元混合液(CaCl2:乙醇:H2O=1:2:8),加入300mL烧杯中,使蚕丝充分浸入,用塑胶手套封口,置于80℃烘箱中1小时后取出;然后将溶液装于透析袋于去离子水中透析36h,每9h换一次液;透析完成后的溶液以9000 r/min离心两次;最后至于60℃烘箱进行浓缩,根据要求得到6%-10%的丝素蛋白溶液。
(3)两种天然蛋白溶液混合搅拌法:混合液体搅拌法:量取一定量的丝素蛋白溶液和适量的甘油按质量比100:40比例均匀混合20-30 min,采用量筒量取一定体积的混合溶液倒入指定的骨支架模具中,静置5-10 min后,按照与骨支架模具中含有的丝素蛋白溶液质量比为5:5~7:3的比例,采用注液器量取相应质量的羊毛角蛋白溶液,由骨支架模具混合溶液中心以1~5 mL/min注入羊毛角蛋白溶液,得到自然梯度分层的丝素蛋白/羊毛角蛋白溶液,利用真空静置法对混合溶液进行脱泡,即将混合溶液置入密闭真空箱中,对密闭真空箱抽真空,静止15-30 min时间后,混合溶液中的气泡就会自动膨胀溢出表面。
(4)将步骤(3)得到的混合溶液经过-20℃冰箱冷冻12h以后,置于真空干燥机48h后,形成复合支架。
由上述实施例所制成的天然蛋白基仿生结构骨支架可参阅图1-图5,在图1中A、B和C分别为S/W-10/10 wt%、S/W-10/6wt%、S/W-6/6 wt%;分别表示外层为10%、10%和6%的丝素溶液与内部为10%、6%和6%的羊毛蛋白形成的多孔材料,从图1中可以看出;天然蛋白支架出现分层,内部孔径大且疏松,外部孔径小且密,复合自然骨支架形态。
如图2所示,1616~ 1637cm-1峰位置显示β折叠,复合多孔材料在1627 cm-1处有明显的峰,表明复合多孔材料以β折叠为主,呈水不溶性。
如图3所示,20.7°为silk II结构,与图2红外结论一致。
如图4所示,此支架力学强度由外层丝素蛋白决定,由图可知丝素蛋白为10%的压缩强度明显要大于丝素蛋白为6%的复合多孔材料,且同等浓度下丝素蛋白与角蛋白比例为7:3的压缩强度要大于比例为5:5的复合多孔材料。
如图5所示,复合多孔材料的孔隙率大部分都在80%以上,表明复合多孔材料具有良好的孔隙率,蛋白浓度为10%的孔隙率明显要小于蛋白浓度为6%的复合多孔材料。
综上所述,本发明公开了一种天然蛋白基仿生结构骨支架的制备方法,所制得的支架材料类似于自体骨结构,孔隙率达到70-95%,且孔径分布均匀,外层致密,且孔径较小,直径范围为30-150 μm,能为支架材料提供一定的机械支撑性能,内部孔径较大,直径范围为150-600 μm,适宜于细胞的迁移、依附与增殖。
应说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种天然蛋白基仿生结构骨支架的制备方法,其特征在于,该方法包括如下步骤:
(1)离子沉淀法制备羊毛角蛋白:将羊毛纤维浸入至NaOH溶液中,待所述羊毛纤维完全溶解后,将水解溶液在室温下保持稳定,调节pH值,分离收集沉淀物,得到羊毛角蛋白粉末,将所述羊毛角蛋白粉末溶于去离子水中,得到羊毛角蛋白溶液;
(2)高压水煮法制备丝素蛋白:将纯水加热至沸腾,加入无水Na2CO3,充分溶解获得碳酸钠溶液,将蚕丝加入所述碳酸钠溶液中,搅拌、干燥,获得脱胶蚕丝,将所述脱胶蚕丝浸于三元混合液中,得到混合液,将所述混合液密封加热后透析、离心、浓缩,得到丝素蛋白溶液;
(3)两种天然蛋白溶液混合搅拌法制备天然蛋白基仿生结构骨支架:将所述丝素蛋白溶液与甘油均匀混合后倒入骨支架模具中静置,采用注液器量取所述羊毛角蛋白溶液,在所述骨支架模具的混合液中心注入羊毛角蛋白溶液,得到自然梯度分层的丝素蛋白/羊毛角蛋白溶液,利用真空静置法对所述丝素蛋白/羊毛角蛋白溶液进行脱泡,然后将所述丝素蛋白/羊毛角蛋白溶液经过冻存和真空冷冻干燥,获得天然蛋白基仿生结构骨支架。
2.根据权利要求1所述的天然蛋白基仿生结构骨支架的制备方法,其特征在于:步骤(1)中所述NaOH溶液的浓度为2%,所述保持稳定的时间为48小时,所述pH值=5.55。
3.根据权利要求1所述的天然蛋白基仿生结构骨支架的制备方法,其特征在于:步骤(1)中所述分离收集沉淀物,得到羊毛角蛋白粉末的过程为将所述沉淀物通过转速为5000r/min的离心机进行分离收集,然后沉淀物再分散在去离子水,并通过离心再次收集,随后将沉淀物分散于无水乙醇中并再次离心,此过程重复4次,所得沉淀物即为羊毛角蛋白粉末。
4.根据权利要求1所述的天然蛋白基仿生结构骨支架的制备方法,其特征在于:步骤(1)中所述羊毛角蛋白溶液的质量分数为6%-10%。
5.根据权利要求1所述的天然蛋白基仿生结构骨支架的制备方法,其特征在于:步骤(2)中所述搅拌、干燥为每隔10min搅拌一次,煮30min,取出后用纯水反复搓洗3次后,置于通风处过夜干燥。
6.根据权利要求1所述的天然蛋白基仿生结构骨支架的制备方法,其特征在于:步骤(2)中所述三元混合液中CaCl2:乙醇:H2O=1:2:8。
7.根据权利要求1所述的天然蛋白基仿生结构骨支架的制备方法,其特征在于,步骤(2)中将所述混合液密封加热后透析、离心、浓缩,得到丝素蛋白溶液具体为:将所述混合液密封置于80℃烘箱中1小时后取出,然后将所述混合液装入透析袋,在去离子水中透析36h,每9h换一次透析液,将透析完成后的溶液以9000r/min的速度离心两次,最后置于60℃烘箱中进行浓缩。
8.根据权利要求1所述的天然蛋白基仿生结构骨支架的制备方法,其特征在于:步骤(2)中所述丝素蛋白溶液的质量分数为6%-10%。
9.根据权利要求1所述的天然蛋白基仿生结构骨支架的制备方法,其特征在于:步骤(3)中所述丝素蛋白溶液和甘油的质量比为60~120:20~60,所述均匀混合的时间为20-30min,所述静置时间为5-10min,所述羊毛角蛋白溶液与所述丝素蛋白溶液的质量比为5:5~7:3,所述注入速度为1~5 mL/min,所述冻存的温度为-40~-20℃,冷冻时间为12h,所述真空冷冻干燥的压力为1.0×105~1.0Pa,温度为-72~5℃,时间为48h。
10.根据权利要求1所述的天然蛋白基仿生结构骨支架的制备方法,其特征在于:步骤(3)中所述利用真空静置法对所述丝素蛋白/羊毛角蛋白溶液进行脱泡的具体方法为:将混合溶液置入密闭真空箱中,对密闭真空箱抽真空,静止15-30 min时间后,混合溶液中的气泡自动膨胀溢出表面。
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