CN106243376B

CN106243376B - 一种丝素蛋白纳米纤维多孔支架及其制备方法

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Publication number: CN106243376B
Application number: CN201610692150.2A
Authority: CN
Inventors: 张锋; 黄继伟; 葛自力; 左保齐
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2016-08-19
Filing date: 2016-08-19
Publication date: 2019-05-28
Anticipated expiration: 2036-08-19
Also published as: CN106243376A

Abstract

本发明涉及一种丝素蛋白基纳米纤维多孔支架及其制备方法，包括如下步骤：（1）蚕丝脱胶后溶于盐‑甲酸混合溶剂获得丝素蛋白溶液；（2）将致孔剂氯化钠分散在丝素蛋白溶液中；（3）水浸泡去除丝素溶液中的氯化钠和甲酸，冷冻干燥后得到多孔丝素蛋白支架。本发明所述制备方法简单、方便操作、易于产业化。本发明所制备的丝素蛋白纳米纤维多孔支架具有天然的仿生纳米原纤结构，生物相容性良好，且具有可调的力学性能，可满足不同组织修复对支架材料的力学性能要求，特别是高强度（湿态压缩模量大于10MPa）丝蛋白纳米纤维多孔支架非常适合于骨组织修复。

Description

一种丝素蛋白纳米纤维多孔支架及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种丝素蛋白纳米纤维多孔支架及其制备方法，所制备的材料可应用于组织工程、药物缓释等再生医学领域。

背景技术

我国是蚕丝的主要生产国，蚕丝产量占世界产量的70%以上。近年来，蚕丝的研究与应用从传统的纺织领域延伸到高新技术领域，如光电子与生物医用材料，特别是作为生物医用材料已经取得了重要进展。丝素蛋白是由蚕茧缫丝脱胶得到，是一种无生理活性的天然结构性蛋白，主要由三种简单的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸组成，它们占蛋白总量的85％左右。脱胶后的蚕丝具有良好的生物相容性与力学性质，作为医用缝合线在临床上的应用已有数十年的历史。

天然蚕丝为纤维状，而生物医用材料要求支架形状具有多样性与可塑性。因此，对天然丝素纤维的再生加工是拓宽其应用范围的必要前提。通过高浓度的中性盐对脱胶蚕丝的溶解，可以将蚕丝蛋白加工成再生长丝、纳米纤维膜、丝素膜、多孔支架、水凝胶等。其中，丝素蛋白多孔支架具有三维多孔结构，可以为细胞的粘附增殖、及组织的再生提供三维空间，并且有利于营养物质的传输，因此受到了广泛研究。目前，制备丝素蛋白多孔支架的方法有很多，包括冷冻干燥、盐析法、气体发泡法、三维打印等，然而这些方法都依然存在一些难以克服的不足。例如，冷冻干燥法易形成片层结构，现有技术反复进行膜溶解控制丝素蛋白自组装形成纳米纤维结构，进而形成多孔支架，但该方法的效率低，重复性差，此外，冷冻干燥丝素蛋白支架的孔径孔隙结构与溶液浓度负相关，而力学性能与溶液浓度正相关，这使得大孔径高力学性能支架的制备难以实现。盐析法可以制备出不同孔径和压缩模量的丝素蛋白多孔支架，但支架孔径一般在400微米以上，且丝蛋白水溶液浓度一般在10 wt%以下，因此支架的模量较低。尽管有文献报道使用六氟异丙醇二次溶解可以提高溶液浓度，但该工艺较为复杂、流程长、溶剂毒性大而昂贵，且六氟异丙醇溶解蚕丝的浓度也难以达到30%，因此所得的多孔支架力学性能依然很低。此外，作为一种生物医用支架，仿生构建具有细胞外基质纳米纤维结构（直径在100nm以下）仍然是一个需要解决的问题。

为此，克服现有技术中的上述问题，开发一种简单、易操作的制备方法，并构建出结构仿生、力学性能可控的丝素蛋白纳米纤维多孔支架对丝素蛋白在生物医用材料领域的应用具有非常重大的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种简单、易操作的丝素蛋白纳米纤维多孔支架制备方法，及由该方法制备的孔径可控、结构仿生、力学性能优异的丝素蛋白多孔材料。

为达到上述目的，本发明的制备方法如下：

（1）混合甲酸与水，然后再加入无机盐制得蚕丝溶解液；将脱胶蚕丝纤维放入蚕丝溶解液中，于10～100℃下搅拌0.5～6h后获得丝素蛋白溶液；

（2）将添加剂加入步骤（1）的丝素蛋白溶液中，分散均匀后得到丝素蛋白-添加剂-甲酸混合体；所述添加剂为氯化钠或者蔗糖；

（3）将步骤（2）的丝素蛋白-添加剂-甲酸混合体去除甲酸得到丝素蛋白-添加剂固体；

（4）将步骤（2）的丝素蛋白-添加剂-甲酸混合体或步骤（3）的丝素蛋白-添加剂固体置于流动水中直到添加剂完全溶解，得到湿态丝素蛋白多孔材料；

（5）将步骤（4）的湿态丝素蛋白多孔材料于-10～-80℃条件下冷冻12～24小时，得到丝素蛋白纳米纤维多孔支架。

上述技术方案中，所述添加剂的粒径在1μm～2mm之间，本发明可以制备大孔径高力学性能的支架材料，也可以得到小孔径分散均匀的支架材料，解决了现有技术支架材料孔径只能偏大的问题。

上述技术方案中，所述蚕丝为桑蚕丝、柞蚕丝、蓖麻蚕丝中的一种或几种。上述技术方案中，所述酸为甲酸。甲酸不仅可以保证蚕丝的溶解，保护蚕丝的原纤结构，同时避免过度降解蚕丝，使得再生蚕丝蛋白材料具有良好的结构与性能；避免了其他酸如磷酸、盐酸会严重降解蚕丝，从而丧失使用价值的问题；也避免了其他酸如乙酸不能溶解蚕丝，不能实现蚕丝蛋白的再生制备的缺陷。从而本发明的甲酸有利于丝素蛋白溶液均匀、保证溶解度，为形成丝素蛋白纳米纤维多孔支架提供良好的基础，特别是孔隙率大于50%，孔径范围为50μm~1mm，孔壁由10~100nm纤维组成，湿态压缩模量为10kPa~50MPa。上述技术方案中，所述无机盐为溴化锂、氯化钙、氯化锌、氯化镁、硫氰酸锂、硫氰酸钠、硫氰酸镁、硝酸钙、硝酸铜、碳酸钙、磷酸钙中的一种或几种。上述技术方案中，所述蚕丝溶解液中甲酸浓度为50～98wt%；无机盐浓度为2～10w/v%。上述技术方案中，丝素蛋白溶液中丝素蛋白的浓度为4～50 w/v %。

上述技术方案中，所述丝素蛋白与添加剂的重量比在1:1～1:100之间。

上述技术方案中，进一步可以采取超声波、物理搅拌促进添加剂在溶液中的均匀分散。

上述技术方案中，去除甲酸的方式为挥发去除甲酸。

上述技术方案中，所述添加剂为氯化钠或者蔗糖。

上述技术方案中，去除添加剂的方法为直接去离子水浸泡，水浸泡不仅可以彻底去除添加剂，同时诱导丝蛋白结构向稳定的β-折叠结晶结构转变，从而避免有机溶剂后处理引起的溶剂残留带来的生物毒性问题。

本发明还公开了按照上述的制备方法制成的丝素蛋白纳米纤维多孔支架，其孔隙率大于50%，孔径范围为50μm~1mm，孔壁由10~100nm纤维组成，湿态压缩模量为10kPa~50MPa；可应用在制备软组织损伤修复材料中。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

（1）本发明制备方法简单、可操控性强，蚕丝在盐-酸中溶解后，直接添加致孔剂氯化钠或者蔗糖，然后在水中溶解后即得到丝蛋白多孔材料，其孔隙率大于50%，孔径范围为50μm~1mm, 孔壁由10~100nm纤维组成，湿态压缩模量为10kPa~50MPa，解决了现有技术支架材料孔径偏大，孔壁非纤维的缺陷。

（2）本发明应用盐-甲酸可在很广的浓度范围内溶解蚕丝，溶解范围广，丝素蛋白溶液中丝素蛋白的浓度为4～50 w/v %，从而可以得到不同力学性能的丝蛋白多孔支架，适用于不同的组织材料，解决了现有技术中丝蛋白在有机溶剂，如甲酸、六福异丙醇中的溶解浓度均小于30 w/v%，为获得高力学性能丝蛋白支架，需要各种添加物的缺陷。

（3）本发明制备方法无需有机溶剂后处理工序，降低了支架毒性问题；所制备的丝素蛋白多孔材料孔径可在50微米和2毫米之间，孔壁及断面可见直径在100纳米以下的纤维结构；所制备支架的压缩模量在10kPa~50MPa之间，不仅可用于软组织损伤修复如皮肤，而且可用于硬组织损伤修复，如骨。

附图说明

图1为实施例一制得的丝素蛋纳米纤维多孔支架的扫描电镜图；

图2为实施例二制得的丝素蛋纳米纤维多孔支架的扫描电镜图；

图3为实施例三制得的丝素蛋纳米纤维多孔支架与对照样的扫描电镜图；

图4为实施例四蚕丝溶解中及溶解后的相机照片图；

图5为实施例四制得的丝素蛋纳米纤维多孔支架的扫描电镜图；

图6为实施例四制得的丝素蛋纳米纤维多孔支架的红外与X-射线衍射谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述：

实施例一

（1）天然桑蚕丝用质量分数0.5wt%的碳酸氢钠溶液煮沸30min脱胶，重复3次后获得脱胶桑蚕丝；

（2）将脱胶蚕丝溶解于2w/v%氯化钙-98wt%甲酸溶液中获得20 w/v %丝蛋白溶液；

（3）通过金属筛分别筛选出粒径小于100μm、200～300μm、500～600μm之间的氯化钠颗粒；

（4）将步骤（3）获得的不同粒径的氯化钠颗粒分别加入到步骤（2）的丝素蛋白溶液中，丝素蛋白与氯化钠重量比为1:20，物理搅拌混合均匀后分别注入模具中，甲酸挥发后置于流动水中除氯化钠。

（5）将去除氯化钠后的丝素蛋白支架置于冻干机中于-80℃条件下冷冻12小时冷冻干燥成丝素蛋白纳米纤维多孔支架。

附图1为上述制得的丝素蛋纳米纤维多孔支架的扫描电镜图片；其中（a）致孔剂氯化钠粒径小于100μm，（b）致孔剂氯化钠粒径为 200～300μm，（c）致孔剂氯化钠粒径为500～600μm；由图可见本发明的纳米纤维多孔支架孔径均匀、大孔间由小孔贯通。经力学压缩测试，该支架的湿态压缩模量为998.3KPa。

实施例二

（1）天然桑蚕丝用质量分数0.05wt%的碳酸氢钠溶液煮沸30min脱胶，重复3次后获得脱胶桑蚕丝；

（2）将脱胶蚕丝溶解于4w/v%氯化钙-98wt%甲酸溶液中获得浓度为4、8、12 w/v%的丝蛋白溶液；

（3）将粒径在200～300μm之间的氯化钠加入到步骤（2）的溶液中，每1ml溶液中加入2g氯化钠，并超声波搅拌均匀；

（4）将步骤（3）获得的丝素蛋白-氯化钠-甲酸混合物置于通风厨中挥发去除甲酸，然后置于流动水中完全溶解去除氯化钠；

（6）将除盐后的丝素蛋白支架于-10℃条件下冷冻24小时冷冻干燥制成丝素蛋白纳米纤维多孔支架。

附图2为上述制得的丝素蛋纳米纤维多孔支架的扫描电镜图片；其中（a）丝素蛋白溶液浓度为4w/v %（b）丝素蛋白溶液浓度为8w/v%（c）丝素蛋白溶液浓度为12 w/v%；表1为不同浓度丝蛋白溶液制成纳米纤维多孔支架的压缩模量，该模量随溶液浓度增大而增大，同时所有支架均表现为低湿态模量，适合于软组织损伤修复。

表1 丝素蛋纳米纤维多孔支架湿态的压缩模量

样品	4% w/v%丝素溶液	8% w/v%丝素溶液	12% w/v%丝素溶液
				湿态压缩模量（kPa）	75 ± 0.8	168 ± 1.2	560 ± 2.3

实施例三

（2）将脱胶蚕丝溶解于4w/v%氯化钙-98wt%甲酸溶液中获得浓度为17 w/v%的丝蛋白溶液；

（3）将粒径在200～300μm之间的氯化钠加入到步骤（2）的溶液中，每1ml溶液中加入2g氯化钠，并搅拌均匀；

（6）将除盐后的丝素蛋白支架于-60℃条件下冷冻15小时冷冻干燥制成丝素蛋白纳米纤维多孔支架。

对照样为按现有方法六氟异丙醇（HFIP）来源的同样参数条件下制得的丝蛋白纳米纤维多孔支架。

附图3为上述制得的丝素蛋白纳米纤维多孔支架与对照样的扫描电镜图片；其中（a）本发明制得的丝蛋白纳米纤维多孔支架；（b）对照样；由图可见本发明制得的丝蛋白多孔材料具有更为完整的三维孔结构；且由于孔之间的支撑作用，其压缩模量（约800kPa）明显大于传统HIFP来源的多孔支架（约200kPa）。

实施例四

（2）将脱胶蚕丝溶解于10w/v%溴化锂-98wt%甲酸溶液中获得浓度为50 w/v%的丝蛋白溶液；

（3）将粒径在500～600μm之间的氯化钠加入到步骤（2）的溶液中，每1ml溶液中加入2g氯化钠，并搅拌均匀；

（5）将除盐后的丝素蛋白支架于-50℃条件下冷冻18小时冷冻干燥制成丝素蛋白纳米纤维多孔支架。

附图4为蚕丝、溶解中及溶解后的相机照片图（左至右），由图看见大量蚕丝纤维成功溶解在少量溶剂中获得高粘性的丝蛋白溶液；图5为纳米纤维多孔支架的扫描电镜图片，由图可见纳米纤维多孔支架孔径在600μm左右，高倍数下可见10-100nm纤维结构；图6为丝蛋白纳米纤维多孔支架的红外与X-射线衍射谱图，由图可知丝蛋白二级结构主要为β-折叠结晶结构；本发明制得的纳米纤维多孔支架的湿态压缩模量为42MPa，与松质骨的压缩模量相近，高压缩模量的丝蛋白纳米纤维多孔支架适合于骨组织修复。

Claims

1.一种丝素蛋白纳米纤维多孔支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（5）将步骤（4）的湿态丝素蛋白多孔材料于-10～-80℃条件下冷冻12～24小时，得到丝素蛋白纳米纤维多孔支架；

所述蚕丝溶解液中甲酸浓度为50～98wt%；

无机盐浓度为2～10w/v%；所述丝素蛋白溶液中丝素蛋白的浓度为4～50 w/v %。

2.根据权利要求1所述丝素蛋白纳米纤维多孔支架的制备方法，其特征在于：所述蚕丝为桑蚕丝、柞蚕丝、蓖麻蚕丝中的一种或几种；所述无机盐为溴化锂、氯化钙、氯化锌、氯化镁、硫氰酸锂、硫氰酸钠、硫氰酸镁、硝酸钙、硝酸铜、碳酸钙、磷酸钙中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述丝素蛋白纳米纤维多孔支架的制备方法，其特征在于：所述添加剂粒径为1μm～2mm。

4.根据权利要求1所述丝素蛋白纳米纤维多孔支架的制备方法，其特征在于：所述丝素蛋白与添加剂的重量比为1∶（1～100）。

5.根据权利要求1所述丝素蛋白纳米纤维多孔支架的制备方法，其特征在于：所述去除甲酸的方式为挥发去除甲酸。

6.根据权利要求1所述丝素蛋白纳米纤维多孔支架的制备方法制备的丝素蛋白纳米纤维多孔支架。

7.根据权利要求6所述丝素蛋白纳米纤维多孔支架，其特征在于：所述丝素蛋白纳米纤维多孔支架的孔隙率大于50%，孔径范围为50μm~1mm，孔壁由直径为10~100nm的纤维组成。

8.权利要求6所述丝素蛋白纳米纤维多孔支架在制备软组织损伤修复材料中的应用。