CN110464881B - 具有层级结构的丝素多孔支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有层级结构的丝素多孔支架的制备方法，使用酸‑盐二元溶液体系将脱胶后的丝素纤维快速溶解；将作为致孔剂的氯化钠颗粒加入到丝素溶液中；然后，进行泡水处理，丝素蛋白溶解体系中的酸在水中因快速稀释而使体系的pH值改变诱导丝素溶液发生凝胶化，同时因氯化钠在水中缓慢溶解而产生空间形成丝素大孔框架；将纯净丝素溶液加入到丝素大孔框架内，进行静电场作用，静电场对注入丝素大孔框架内的丝素蛋白的排列方向和尺寸进行调控，形成具有微纳层级结构的丝素多孔支架。该制备方法绿色高效，制得的丝素多孔支架模拟了细胞生长的物理微环境，环境友好，生物相容性好，可作为生物医药载体和组织工程修复材料。

Description

具有层级结构的丝素多孔支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，特别是涉及一种具有层级结构的丝素多孔支架及其制备方法。
背景技术
丝素蛋白因其优良的物理性能、生物相容性及可生物降解性，在生物医用材料等领域引起国内外众多学者的广泛关注和研究。伴随组织工程的兴起以及对组织工程支架材料迫切需求，通过丝素蛋白制备的各种类型的支架材料得到广泛报道与研究。目前，一般通过冷冻干燥、盐析、静电纺等方法可制备丝素蛋白支架材料。
申请号为2014100866358的专利申请，公开了一种大孔三维有序取向性丝素蛋白纳米纤维支架及其制备方法，该申请主要运用静电纺丝的方法，通过乙醇浴滚筒收集的方法来实现。其中的乙醇浴滚筒法的特点是导电性滚筒一部分浸没在乙醇中，因为乙醇具有低表面张力，可使所制备的丝素蛋白纳米纤维浸润分散其中从而导致丝与丝之间的间隙扩大，同时滚筒可以旋转运动，使得收集的丝可以朝一个方向有序排布。但是，基于该制备方法制备的丝素蛋白纳米纤维支架机械性能较差，孔径不均一，无法为细胞生长、增殖提供适宜的生长场所，且难以量产，并且该制备方法在制备过程中涉及多种有毒和不易回收的化学试剂，故作为生物材料的使用受到了极大限制。
申请号为2015107590362的专利申请，公开了一种双层血管支架的制备方法，包括静电纺丝溶液的制备、静电纺丝、管状支架的制备、乙醇处理、冷冻干燥步骤，完成双层血管支架的制备。该制备方法制备流程复杂、有机溶剂的添加限制了其在组织工程中的应用。
因此，有必要提供一种具有层级结构的丝素多孔支架及其制备方法，以解决上述问题。
发明内容
为了克服现有的支架的不足，本发明提供了一种具有层级结构的丝素多孔支架及其制备方法，该丝素多孔支架具有合适的微观结构，针对细胞生长最大限度的模拟其体内生长的物理微环境，适宜于哺乳动物复杂组织的结构修复与重建，且其制备方法绿色高效。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种具有层级结构的丝素多孔支架的制备方法，包括以下步骤：
S1，脱胶：将家蚕蚕茧脱胶得到丝素蛋白质纤维；
S2，溶丝：将步骤S1得到的丝素蛋白质纤维溶解于20～100g/L的酸-盐二元溶液中制备质量分数为5～20％的丝素溶液Ⅰ；
S3，框架制备：将固体氯化钠颗粒加入到步骤S2得到的所述丝素溶液Ⅰ中得到混合溶液，并将其泡水去盐处理，经冷冻干燥后获得丝素大孔框架；
S4，溶丝：采用步骤S1得到的丝素蛋白质纤维配置质量百分浓度为0.1％～10％的纯净丝素溶液Ⅱ；
S5，微纳米结构的构建：将所述纯净丝素溶液Ⅱ注入到步骤S3获得的所述丝素大孔框架中，并经静电场作用，得到凝胶-多孔丝素材料复合体；
S6，支架制备：将所述凝胶-多孔丝素材料复合体先进行预冷冻处理、解冻、冷冻处理，最后冷冻干燥制得具有层级结构的丝素多孔支架。
作为本发明的进一步改进，在步骤S5中，所述静电场的电场强度为10～200V/m，电场作用的时间为15～30min。
作为本发明的进一步改进，在步骤S6中，冷冻干燥的温度为-20℃～-80℃，冷冻干燥的时间为1～48h。
作为本发明的进一步改进，在步骤S2中，所述酸-盐二元溶液中的酸为盐酸、甲酸、硫酸中的一种或几种。
作为本发明的进一步改进，所述盐酸的浓度大于等于30％，所述甲酸的纯度大于等于98％，所述硫酸的浓度大于等于99％。
作为本发明的进一步改进，在步骤S2中，所述酸-盐二元溶液中的盐为Ca(NO3)2、CaCl2、LiBr中的一种或几种。
作为本发明的进一步改进，在步骤S3中，所述泡水去盐处理的时间为5h～120h，所述冷冻干燥的时间为24～48h，所述冷冻干燥的温度为-20℃～-80℃。
作为本发明的进一步改进，在步骤S2中，所述丝素蛋白的溶解时间为5～10min，静置时间为0.5～1h。
作为本发明的进一步改进，所述步骤S1包括如下步骤：将蚕丝纤维在0.05～1wt％的脱胶盐水溶液中煮沸20～30min，洗涤，将上述过程重复2～3次后，在60±5℃下烘干20～28h，扯松备用；所述脱胶盐为Na2CO3、NaHCO3、(NH4)2SO4中的一种。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种根据前述技术方案中任一技术方案所述的制备方法制备得到的具有层级结构的丝素多孔支架，所述具有层级结构的丝素多孔支架包括具有多孔结构的丝素大孔基底及形成于所述丝素大孔基底的孔结构内的微纳米结构，所述微纳米结构呈有序取向性排列。
本发明的有益效果是：
本发明使用酸-盐二元溶液体系将脱胶后的丝素蛋白快速溶解，同时，在强酸-盐的体系下使溶解的丝素蛋白溶液处于丝素蛋白凝胶的等电点以下以使丝素蛋白不至于迅速凝胶化，等电点是指一个分子或者表面不带电荷时的pH值；氯化钠不溶于该酸-盐体系，在丝素蛋白溶液中占据一定的空间位置而作为致孔剂制备孔径可控的多孔材料；进行泡水处理时，丝素蛋白溶解体系中的酸在水中因快速稀释而使体系的pH值改变(快速靠近丝素蛋白的等电点)以使丝素蛋白溶液发生凝胶化，同时因氯化钠在水中逐渐溶解而腾出空间形成丝素大孔框架；基于电场具有方向性，在构建丝素大孔框架内的微纳米结构时，静电场对注入丝素大孔框架内的丝素蛋白的方向进行调控，并可以通过改变电场方向以改变微纳米纤维(纯净丝素溶液Ⅱ中的丝素蛋白纤维)的生长排列方向，从而间接调控细胞生长行为。
1、本发明采用溶剂交换-盐滤法制备出具有连通性良好、机械性能可调的丝素大孔框架，在丝素大孔框架内注入的丝素蛋白溶液并在静电场的作用下进行自组装形成微纳米纤维结构，进而形成层级结构的三维丝素多孔支架，多层级结构进一步提高了支架的比表面积，进而为细胞的增殖分化提供更丰富的场所，进一步丰富了不同种类细胞增殖分化的微环境；通过构建层级结构以模拟天然的细胞外基质类似的微纳米结构，通过构建层级结构针对细胞生长最大限度的模拟其生长的物理微环境；
2、本发明制备流程简单高效，直接通过溶剂交换-盐滤法，能够不添加任何交联剂而制备出以β-折叠结构为主的丝素大孔框架；
3、本发明的制备方法，在制备过程中，通过调节氯化钠粒径、丝素溶液浓度、冷冻温度等工艺参数，控制孔结构参数，以满足不同应用需求，从而改善细胞生长微环境；调控具有多样性，可以在多孔材料内制备成微球、微纳米纤维等；
4、本发明不使用任何有毒、交联剂或发泡剂制备具有层级结构的丝素多孔支架，不会引起环境污染等问题，是一种十分友好且效率高的支架制备方案；此方法构建的层级结构绿色高效，可用于生物载药释药，为组织修复提供手术药物双重治疗效果。
附图说明
图1为本发明具有层级结构的丝素多孔支架的制备方法中得到的丝素大孔框架与制得的丝素多孔支架中丝素大孔框架内的微纳米结构的红外光谱(FTIR)图；
图2为本发明具有层级结构的丝素多孔支架的制备方法的实施例1中得到的丝素大孔框架的扫描电镜图，标尺为100μm；
图3为本发明的实施例3得到的具有层级结构的丝素多孔支架的扫描电镜图，标尺为100μm；
图4为本发明的实施例4得到的具有层级结构的丝素多孔支架的扫描电镜图，标尺为50μm。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
本发明提供了一种具有层级结构的丝素多孔支架的制备方法，包括以下步骤：
S1，脱胶：将家蚕蚕茧脱胶得到丝素蛋白质纤维；
S2，溶丝：将步骤S1得到的丝素蛋白质纤维溶解于20～100g/L的酸-盐二元溶液中制备质量分数为5～20％的丝素溶液Ⅰ；
S3，框架制备：将固体氯化钠颗粒加入到步骤S2得到的所述丝素溶液Ⅰ中得到混合溶液，并将其泡水去盐处理，经冷冻干燥后获得丝素大孔框架；
S4，溶丝：采用步骤S1得到的丝素蛋白质纤维配置质量百分浓度为0.1％～10％的纯净丝素溶液Ⅱ；
S5，微纳米结构的构建：将所述纯净丝素溶液Ⅱ注入到步骤S3获得的所述丝素大孔框架中，并经静电场作用，得到凝胶-多孔材料复合体；
S6，支架制备：将所述凝胶-多孔材料复合体先进行预冷冻处理、解冻、冷冻处理，最后冷冻干燥制得具有层级结构的丝素多孔支架。
其中，步骤S1包括如下步骤：将蚕丝纤维在0.05～1wt％的脱胶盐水溶液中煮沸20～30min，洗涤，将上述过程重复2～3次后，在60±5℃下烘干20～28h，扯松备用。所述脱胶盐为Na2CO3、NaHCO3、(NH4)2SO4中的一种。
其中，在步骤S2中，所述酸-盐二元溶液中的酸为盐酸、甲酸、硫酸中的一种或几种。所述盐酸的浓度大于等于30％，所述甲酸的纯度大于等于98％，所述硫酸的浓度大于等于99％。所述酸-盐二元溶液中的盐为Ca(NO3)2、CaCl2、LiBr中的一种或几种。所述丝素蛋白溶解时手动摇动，溶解时间为5～10min，静置时间为0.5～1h。
在步骤S3中，所述泡水去盐处理的时间为5h～120h，所述冷冻干燥的时间为24～48h，所述冷冻干燥的温度为-20℃～-80℃。
在步骤S5中，所述静电场的电场强度为10～200V/m，电场作用的时间为15～30min。
在步骤S6中，先在-120～-60℃下进行预冷冻处理，然后解冻2～8h，再在-20～-5℃下冷冻2～72h；最后冷冻干燥处理，冷冻干燥的温度为-20℃～-80℃，冷冻干燥的时间为1～48h。
本发明还提供了一种根据前述制备方法制备得到的具有层级结构的丝素多孔支架，所述具有层级结构的丝素多孔支架包括具有多孔结构的丝素大孔基底及形成于所述丝素大孔基底的孔结构内的微纳米结构，所述微纳米结构呈有序取向性排列。
下面结合实施例1至实施例16对本发明的具有层级结构的丝素多孔支架的制备方法进行说明：
实施例1：
S1，脱胶：将家蚕蚕茧剪碎置于质量分数为0.05％的Na2CO3水溶液中煮沸30min，经去离子水充分洗涤，重复上述步骤三次，最后置于60±5℃烘箱中烘干24h，得到脱胶后的丝素蛋白，扯松后备用；
S2，溶丝：分别称、量取CaCl2和甲酸配置酸-盐浓度为20g/L CaCl2-甲酸溶液，称取2.7g丝素蛋白纤维加入30mL CaCl2-甲酸溶液中经手动摇晃溶解5～10min，静置30min，得到质量分数为9％的丝素溶液Ⅰ；
S3，框架制备：将固体氯化钠颗粒加入到步骤S2得到的丝素溶液Ⅰ中得到混合溶液，将加入氯化钠后的混合溶液注入模具、静置、泡水去盐处理5h，经冷冻干燥获得丝素大孔框架；
S4，溶丝：将步骤S1得到的丝素蛋白经LiBr溶解后、透析、离心，配置质量百分浓度为0.1％的纯净丝素溶液Ⅱ；
S5，微纳米结构的构建：将所述纯净丝素溶液Ⅱ注入到步骤S3获得的丝素大孔框架中，并经静电场作用15min，得到凝胶-多孔丝素材料复合体；
S6，支架制备：将所述凝胶-多孔材料复合体先进行-80℃预冷冻处理，37℃解冻5h，-10℃冷冻72h，最后在-20～-80℃下冷冻干燥20～48h制得具有层级结构的丝素多孔支架。
请参阅图1至图2所示，图1为本实施例中步骤S5得到的丝素大孔框架与制得的丝素多孔支架中丝素大孔框架内的微纳米结构的FTIR谱图。其中，微纳米结构在1650cm-1、1525cm-1、1235cm-1位置处有特征峰，丝素大孔框架在1701cm-1、1627cm-1、1525cm-1、1235cm-1位置处有特征峰，丝素蛋白特定的构象特征峰β-折叠的位置(cm-1)为1620～1635、1690-1710cm-1(酰胺I)、1530cm-1附近(酰胺II)、1230～1235cm-1(酰胺III)。因此，图1表明，该丝素大孔框架与丝素大孔框架内的微纳米结构存在大量的β-折叠结构，纤维内部分子形成了稳定牢固的结合，机械性能良好。
图2为本实施例制得的丝素大孔框架的扫描电镜图。
实施例2：
S1，脱胶：将家蚕蚕茧剪碎置于质量分数为0.05％的Na2CO3水溶液中煮沸30min，经去离子水充分洗涤，重复上述步骤三次，最后置于60±5℃烘箱中烘干24h，得到脱胶后的丝素蛋白，扯松后备用；
S2，溶丝：分别称、量取CaCl2和甲酸配置酸-盐浓度为20g/L CaCl2-甲酸溶液，称取2.7g丝素蛋白纤维加入30ml CaCl2-甲酸溶液中经手动摇晃溶解5～10min，静置30min，得到质量分数为9％的丝素溶液Ⅰ；
S3，框架制备：将固体氯化钠颗粒加入到步骤S2得到的丝素溶液Ⅰ中得到混合溶液，将加入氯化钠后的混合溶液注入模具、静置、泡水去盐处理5h，经冷冻干燥获得丝素大孔框架；
S4，溶丝：将步骤S1得到的丝素蛋白经LiBr溶解后、透析、离心，配置质量百分浓度为10％的纯净丝素溶液Ⅱ；
S5，微纳米结构的构建：将纯净丝素溶液Ⅱ注入到经步骤S3获得的丝素大孔框架中，并经静电场作用15min，得到凝胶-多孔材料复合体；
S6，支架制备：将所述凝胶-多孔丝素材料复合体先进行-80℃预冷冻处理，37℃解冻5h，-10℃冷冻72h，最后在-20～-80℃下冷冻干燥20～48h制得具有层级结构的丝素多孔支架。
实施例3：
S1，脱胶：将家蚕蚕茧剪碎置于质量分数为0.05％的Na2CO3水溶液中煮沸30min，经去离子水充分洗涤，重复上述步骤三次，最后置于60±5℃烘箱中烘干24h，得到脱胶后的丝素蛋白，扯松后备用；
S2，溶丝：分别称、量取CaCl2和甲酸配置酸-盐浓度为20g/L的CaCl2-甲酸溶液，称取5.4g丝素蛋白纤维加入30ml的CaCl2-甲酸溶液中经手动摇晃溶解5～10min，静置30min，得到质量分数为18％的丝素溶液Ⅰ；
S3，框架制备：将固体氯化钠颗粒加入到步骤S2得到的丝素溶液Ⅰ中得到混合溶液，将加入氯化钠后的混合溶液注入模具、静置、泡水去盐处理5h，经冷冻干燥获得丝素大孔框架；
S4，溶丝：将步骤S1得到的丝素蛋白经LiBr溶解后、透析、离心，配置质量百分浓度为0.1％的纯净丝素溶液Ⅱ；
S5，微纳米结构的构建：将纯净丝素溶液Ⅱ注入到经步骤S3获得的丝素大孔框架中，并经静电场作用30min，得到凝胶-多孔材料复合体；
S6，支架制备：将所述凝胶-多孔丝素材料复合体先进行-80℃预冷冻处理，37℃解冻5h，-10℃冷冻72h，最后在-20～-80℃下冷冻干燥20～48h制得具有层级结构的丝素多孔支架。
图3为本实施例制得的丝素多孔支架的扫描电镜图。
实施例4：
S1，脱胶：将家蚕蚕茧剪碎置于质量分数为0.1％的NaHCO3水溶液中煮沸30min，经去离子水充分洗涤，重复上述步骤三次，最后置于60±5℃烘箱中烘干24h，得到脱胶后的丝素蛋白，扯松后备用；
S2，溶丝：分别称、量取LiBr和甲酸配置酸-盐浓度为20g/L的LiBr-甲酸溶液，称取2.7g丝素蛋白纤维加入30ml的LiBr-甲酸溶液中经手动摇晃溶解5～10min，静置30min，得到质量分数为9％的丝素溶液Ⅰ；
S3，框架制备：将固体氯化钠颗粒加入到步骤S2得到的丝素溶液Ⅰ中得到混合溶液，将加入氯化钠后的混合溶液注入模具、静置、泡水去盐处理5h，经冷冻干燥获得丝素大孔框架；
S4，溶丝：将步骤S1得到的丝素蛋白经LiBr溶解后、透析、离心，配置质量百分浓度为0.1％～10％的纯净丝素溶液Ⅱ；
S5，微纳米结构的构建：将纯净丝素溶液Ⅱ注入到步骤S3获得的丝素大孔框架中，并经静电场作用15min，得到凝胶-多孔材料复合体；
S6，支架制备：将所述凝胶-多孔材料复合体先进行-80℃预冷冻处理，37℃解冻5h，-10℃冷冻72h，最后在-20～-80℃下冷冻干燥20～48h制得具有层级结构的丝素多孔支架。
图4为本实施例制得的丝素多孔支架的扫描电镜图。
实施例5：
S1，脱胶：将家蚕蚕茧剪碎置于质量分数为0.05％的Na2CO3水溶液中煮沸30min，经去离子水充分洗涤，重复上述步骤三次，最后置于60±5℃烘箱中烘干24h，得到脱胶后的丝素蛋白，扯松后备用；
S2，溶丝：分别称、量取CaCl2和甲酸配置酸-盐浓度为20g/L CaCl2-甲酸溶液，称取1.5g丝素蛋白纤维加入30ml CaCl2-甲酸溶液中经手动摇晃溶解5～10min，静置30min，得到质量分数为5％的丝素溶液Ⅰ；
S3，框架制备：将固体氯化钠颗粒加入到步骤S2得到的丝素溶液Ⅰ中得到混合溶液，将加入氯化钠后的混合溶液注入模具、静置、泡水去盐处理5h，经冷冻干燥获得丝素大孔框架；
S4，溶丝：将步骤S1得到的丝素蛋白经LiBr溶解后、透析、离心，配置质量百分浓度为0.1％的纯净丝素溶液Ⅱ；
S5，微纳米结构的构建：将所述纯净丝素溶液Ⅱ注入到步骤S3获得的丝素大孔框架中，并经静电场作用15min，得到凝胶-多孔材料复合体；
S6，支架制备：将所述凝胶-多孔材料复合体先进行-80℃预冷冻处理，37℃解冻5h，-10℃冷冻72h，最后在-20～-80℃下冷冻干燥20～48h制得具有层级结构的丝素多孔支架。
实施例6：
S1，脱胶：将家蚕蚕茧剪碎置于质量分数为0.05％的Na2CO3水溶液中煮沸30min，经去离子水充分洗涤，重复上述步骤三次，最后置于60±5℃烘箱中烘干24h，得到脱胶后的丝素蛋白，扯松后备用；
S2，溶丝：分别称、量取CaCl2和甲酸配置酸-盐浓度为100g/L的CaCl2-甲酸溶液，称取6g丝素蛋白纤维加入30ml的CaCl2-甲酸溶液中经手动摇晃溶解5～10min，静置30min，得到质量分数为20％的丝素溶液Ⅰ；
S3，框架制备：将固体氯化钠颗粒加入到步骤S2所得到的丝素溶液Ⅰ中得到混合溶液，将加入氯化钠后的混合溶液注入模具、静置、泡水去盐处理5h，经冷冻干燥获得丝素大孔框架；
S4，溶丝：将步骤S1得到的丝素蛋白经LiBr溶解后、透析、离心，配置质量百分浓度为10％的纯净丝素溶液Ⅱ；
S5，微纳米结构的构建：将纯净丝素溶液Ⅱ注入到步骤S3获得的丝素大孔框架中，并经静电场作用30min，得到凝胶-多孔材料复合体；
S6，支架制备：将所述凝胶-多孔材料复合体先进行-80℃预冷冻处理，37℃解冻5h，-10℃冷冻72h，最后在-20～-80℃下冷冻干燥20～48h制得具有层级结构的丝素多孔支架。
实施例7：
S1，脱胶：将家蚕蚕茧剪碎置于质量分数为0.1％的Na2CO3水溶液中煮沸30min，经去离子水充分洗涤，重复上述步骤三次，最后置于60±5℃烘箱中烘干24h，得到脱胶后的丝素蛋白，扯松后备用；
S2，溶丝：分别称、量取CaCl2和甲酸配置酸-盐浓度为20g/L的CaCl2-甲酸溶液，称取2.7g丝素蛋白纤维加入30ml的CaCl2-甲酸溶液中经手动摇晃溶解5～10min，静置30min，得到质量分数为9％的丝素溶液Ⅰ；
S3，框架制备：将固体氯化钠颗粒加入到步骤S2得到的丝素溶液Ⅰ中得到混合溶液，将加入氯化钠后的混合溶液注入模具、静置、泡水去盐处理5h，经冷冻干燥获得丝素大孔框架；
S4，溶丝：将步骤S1得到的丝素蛋白经LiBr溶解后、透析、离心，配置质量百分浓度为0.1％的纯净丝素溶液Ⅱ；
S5，微纳米结构的构建：将所述纯净丝素溶液Ⅱ注入到步骤S3获得的丝素大孔框架中，并经静电场作用15min，得到凝胶-多孔材料复合体；
S6，支架制备：将所述凝胶-多孔材料复合体先进行-80℃预冷冻处理，37℃解冻5h，-10℃冷冻72h，最后在-20～-80℃下冷冻干燥20～48h制得具有层级结构的丝素多孔支架。
实施例8：
S1，脱胶：将家蚕蚕茧剪碎置于质量分数为0.25％的NaHCO3水溶液中煮沸30min，经去离子水充分洗涤，重复上述步骤三次，最后置于60±5℃烘箱中烘干24h，得到脱胶后的丝素蛋白，扯松后备用；
S2，溶丝：分别称、量取CaCl2和甲酸配置酸-盐浓度为20g/L的CaCl2-甲酸溶液，称取2.7g丝素蛋白纤维加入30ml CaCl2-甲酸溶液中经手动摇晃溶解5～10min，静置30min，得到质量分数为9％的丝素溶液Ⅰ；
S3，框架制备：将固体氯化钠颗粒加入到步骤S2所得到的丝素溶液Ⅰ中得到混合溶液，将加入氯化钠后的混合溶液注入模具、静置、泡水去盐处理5h，经冷冻干燥获得丝素大孔框架；
S4，溶丝：将步骤S1得到的丝素蛋白经LiBr溶解后、透析、离心，配置质量百分浓度为0.1％的纯净丝素溶液Ⅱ；
S5，微纳米结构的构建：将纯净丝素溶液Ⅱ注入到步骤S3获得的丝素大孔框架中，并经静电场作用30min，得到凝胶-多孔材料复合体；
S6，支架制备：将所述凝胶-多孔材料复合体先进行-80℃预冷冻处理，37℃解冻5h，-10℃冷冻72h，最后在-20～-80℃下冷冻干燥20～48h制得具有层级结构的丝素多孔支架。
实施例9-16：
实施例9-16与实施例1-8的区别仅在于对应将酸-盐二元溶液中的盐替换为Ca(NO3)2，除上述区别外，其他操作均相同，在此不再赘述。
综上所述，本发明具有层级结构的丝素多孔支架的制备方法，使用酸-盐二元溶液体系将脱胶后的丝素蛋白快速溶解，同时，在强酸-盐的体系下使溶解的丝素蛋白溶液处于丝素蛋白凝胶的等电点以下以使丝素蛋白不至于迅速凝胶化；利用氯化钠不溶于该酸-盐体系，在丝素蛋白溶液中占据一定的空间位置而作为致孔剂制备孔径可控的多孔材料；然后，进行泡水处理时，丝素蛋白溶解体系中的酸在水中因快速稀释而使体系的pH值改变(逐渐靠近丝素蛋白的等电点)，以诱导丝素蛋白溶液发生凝胶化，同时因氯化钠在水中逐渐溶解而腾出空间形成丝素大孔框架；基于电场具有方向性，在构建丝素大孔框架内的微纳米结构时，静电场对注入丝素大孔框架内的丝素蛋白的排列方向和尺寸进行调控，并可以通过改变电场方向以改变微纳米纤维(丝素蛋白纤维)的生长排列方向，从而间接调控细胞生长行为。该制备方法绿色高效、环境友好，制得的具有层级结构的丝素多孔支架绿色温和、生物相容性良好，通过构建层级结构以模拟天然的细胞外基质类似的微纳米结构，对细胞生长最大限度的模拟其生长的物理微环境，适宜于复杂组织的结构，可作为生物医药载体和组织工程修复材料。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种具有层级结构的丝素多孔支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，脱胶：将家蚕蚕茧脱胶得到丝素蛋白质纤维；
S2，溶丝：将步骤S1得到的丝素蛋白质纤维溶解于20～100g/L的酸-盐二元溶液中制备质量分数为5～20％的丝素溶液Ⅰ；
S3，框架制备：将固体氯化钠颗粒加入到步骤S2得到的所述丝素溶液Ⅰ中得到混合溶液，并将其泡水去盐处理，经冷冻干燥后获得丝素大孔框架；
S4，溶丝：采用步骤S1得到的丝素蛋白质纤维配置质量百分浓度为0.1％～10％的纯净丝素溶液Ⅱ；
S5，微纳米结构的构建：将所述纯净丝素溶液Ⅱ注入到步骤S3获得的所述丝素大孔框架中，并经静电场作用，得到凝胶-多孔丝素材料复合体；
S6，支架制备：将所述凝胶-多孔材料复合体先进行预冷冻处理、解冻、冷冻处理，最后冷冻干燥制得具有层级结构的丝素多孔支架。
2.根据权利要求1所述的具有层级结构的丝素多孔支架的制备方法，其特征在于：在步骤S5中，所述静电场的电场强度为10～200V/m，电场作用的时间为15～30min。
3.根据权利要求1所述的具有层级结构的丝素多孔支架的制备方法，其特征在于：在步骤S6中，冷冻干燥的温度为-20℃～-80℃，冷冻干燥的时间为1～48h。
4.根据权利要求1所述的具有层级结构的丝素多孔支架的制备方法，其特征在于：在步骤S2中，所述酸-盐二元溶液中的酸为盐酸、甲酸、硫酸中的一种或几种。
5.根据权利要求4所述的具有层级结构的丝素多孔支架的制备方法，其特征在于：所述盐酸的浓度大于等于30％，所述甲酸的纯度大于等于98％，所述硫酸的浓度大于等于99％。
6.根据权利要求1所述的具有层级结构的丝素多孔支架的制备方法，其特征在于：在步骤S2中，所述酸-盐二元溶液中的盐为Ca(NO3)2、CaCl2、LiBr中的一种或几种。
7.根据权利要求1所述的具有层级结构的丝素多孔支架的制备方法，其特征在于：在步骤S3中，所述泡水去盐处理的时间为5h～120h，所述冷冻干燥的时间为24～48h，所述冷冻干燥的温度为-20℃～-80℃。
8.根据权利要求1所述的具有层级结构的丝素多孔支架的制备方法，其特征在于：在步骤S2中，所述丝素蛋白的溶解时间为5～10min，静置时间为0.5～1h。
9.根据权利要求1所述的具有层级结构的丝素多孔支架的制备方法，其特征在于，所述步骤S1包括如下步骤：将蚕丝纤维在0.05～1wt％的脱胶盐水溶液中煮沸20～30min，洗涤，将上述过程重复2～3次后，在60±5℃下烘干20～28h，扯松备用；所述脱胶盐为Na2CO3、NaHCO3、(NH4)2SO4中的一种。
10.一种具有层级结构的丝素多孔支架，其特征在于：其根据权利要求1-9中任一权利要求所述的制备方法制备得到，所述具有层级结构的丝素多孔支架包括具有多孔结构的丝素大孔基底及形成于所述丝素大孔基底的孔结构内的微纳米纤维结构，所述微纳米纤维结构呈有序取向性排列。
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