CN109876196B - 一种丝素蛋白仿生多孔支架及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种丝素蛋白仿生多孔支架的制备方法，包括如下步骤：将丝素蛋白溶于有机溶剂中，配制丝素蛋白溶液，然后加入丙酮形成凝胶状溶液；将致孔剂加入所得凝胶状溶液中，混合均匀，然后转入超临界干燥设备中进行超临界干燥处理；将所得产物进行酒精浸泡，然后烘干，即得丝素蛋白仿生多孔支架。本发明所得丝素蛋白仿生多孔支架具备共存的大孔和微孔特征、高孔隙率以及容许细胞粘附的粗糙的纳米纤维网状交织结构，可模拟细胞外基质微环境，有助于促进细胞的黏附与增殖；且涉及的制备过程绿色环保，不使用高温，能避免有机溶剂残留等问题；所得丝素蛋白仿生多孔支架可进行广泛应用于人工皮肤支架、人工神经支架、骨组织工程支架等领域。
Description
技术领域
本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种丝素蛋白仿生多孔支架及其制备方法和应用。
背景技术
家蚕丝(Bombyx Mori Silk)具有独特的分级结构，其以反平行折叠链构象(β-sheet)为基础，形成直径为10～15nm的微纤维，直径大约为10μm的细纤维由大约1000根微纤维形成，单纤维(丝素蛋白纤维直径为1～1.8mm)由大约100根细纤维沿纵轴排列构成的。蚕丝纤维的主要组成为丝素(约占全部重量的70％)，其次为丝胶(约占25％)；其中丝胶是一种水溶性的球状蛋白，包裹在丝素的周围，极容易溶于热水，可通过脱胶过程与丝素分离，这两种主要物质构成了蚕丝单根纤维。
近年来，利用丝素蛋白(Silk fibroin,SF)作为组织工程支架的研究越来越受到研究者的关注。丝素蛋白是从蚕丝中提取的一种天然高分子可降解生物材料，具有良好的生物相容性，不会发生凝血、免疫和炎症反应。大量研究表明，丝素蛋白支架能诱导细胞的增殖、迁移和分化。目前制备丝素蛋白支架的方法有很多种，常见的方法包括溶剂浇铸/粒子沥滤法、气体发泡法、快速成型法、相分离/冷冻干燥法和静电纺丝法等。这些传统的支架制备方法难以获得共存的大孔和微孔特征、可控的孔径、高孔隙率以及容许细胞粘附的粗糙的纳米纤维表面等，无法提供与天然组织更加相似的细胞外基质环境，不能为细胞在体外的生长、发育和细胞间通讯提供理想的微环境。
发明内容
本发明的主要目的在于针对现有技术存在的不足，提供一种丝素蛋白仿生多孔支架，它具备共存的大孔和微孔特征、高孔隙率以及容许细胞粘附的粗糙的纳米纤维网状交织结构，可有效模拟细胞外基质微环境，促进细胞的黏附与增殖；且涉及的制备方法简单，能耗低、环境友好，适合推广应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种丝素蛋白仿生多孔支架的制备方法，包括如下步骤：
1)将丝素蛋白溶于有机溶剂中，配制丝素蛋白溶液，然后加入丙酮形成凝胶状溶液；
2)将致孔剂加入所得凝胶状溶液中，混合均匀，然后转入超临界干燥设备中进行超临界干燥处理；
3)将步骤2)所得产物进行酒精浸泡，然后烘干，即得丝素蛋白仿生多孔支架。
上述方案中，所述有机溶剂为六氟异丙醇。
上述方案中，所述丝素蛋白溶液的浓度为0.06-0.1g/ml。
上述方案中，所述丝素蛋白溶液与丙酮的体积比为5:(1.2-1.5)。
上述方案中，所述致孔剂为碳酸氢铵；其粒径为150-250μm。
上述方案中，所述致孔剂与丝素蛋白的质量比为(5-15):1。
上述方案中，所述超临界干燥处理工艺包括：采用的超临界流体为CO2，设定温度为 31.3～40℃，压强为7.3～20MPa，时间为3～8h。
上述方案中，所述浸泡时间为6～12h。
上述方案中，所述干燥温度为40～60℃，时间为0.5～3d。
根据上述方案制备的所丝素蛋白仿生多孔支架，可有效模拟细胞外基质，并备大孔和微孔特征(大孔孔径为150-250μm，微孔孔径为0.1-1μm)、高孔隙率以及容许细胞粘附与增殖的粗糙的纳米纤维网状交织结构，有利于细胞的黏附、增殖和分化，可进行广泛应用于人工皮肤支架、人工神经支架、骨组织工程支架等领域；且涉及的制备过程绿色环保，无需高温反应条件，能避免有机溶剂残留等问题。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)通过丝素蛋白的纤维交织网状结构模拟细胞外基质，支持细胞的黏附、增殖和分化。
2)本发明以丙酮为交联剂，改变丝素蛋白的远程结构，可使丝素蛋白结构稳定，并与超临界流体技术结合，得到具备大孔和微孔特征、高孔隙率以及容许细胞粘附与增殖的粗糙的纳米纤维网状交织结构的丝素蛋白多孔支架，可为组织工程支架及其制备技术提供一条全新思路。
3)本发明首次提出利用超临界流体技术制备丝素蛋白多孔支架，涉及的制备过程绿色环保，无需高温反应条件，能避免有机溶剂残留等问题，适合推广应用。
附图说明
图1为对比例1所得丝素蛋白仿生多孔支架的扫描电镜图；
图2为对比例2所得丝素蛋白仿生多孔支架的扫描电镜图；
图3为实施例1所得丝素蛋白仿生多孔支架的扫描电镜图；
图4为实施例2所得丝素蛋白仿生多孔支架的扫描电镜图；
图5为实施例3所得丝素蛋白仿生多孔支架的扫描电镜图；
图6为实施例4所得丝素蛋白仿生多孔支架的扫描电镜图；
图7为应用例1所得人工神经支架的形貌图；
图8为应用例2所得人工皮肤支架的形貌图；
图9为应用例3所得骨组织工程支架的形貌图；
图10为超临界技术相较于冷冻干燥技术制备的多孔支架的细胞培养的吸光度柱状图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
下述实施过程中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。除非有特殊说明，用液体制备的溶液浓度用体积比表示(v/v)，用固体制备的溶液浓度用质量体积比表示(w/v)。
以下实施例中，采用的致孔剂NH4HCO3的粒径为150-250μm。
对比例1
一种丝素蛋白仿生多孔支架，其制备方法包括如下步骤：
将脱胶丝素蛋白溶解于六氟异丙醇中，配制5ml浓度为0.1g/ml的丝素蛋白溶液，然后向其中加入5g NH4HCO3作为致孔剂，搅拌混匀，将所得溶液铺满直径为4cm的培养皿，放入超临界干燥设备中进行干燥，设定压力为15MPa，温度为35℃，干燥时间为8h；干燥后酒精浸泡一晚，再在60℃烘箱中烘干2天，得到无纤维网状结构的丝素支架材料。
本实施例所得产物的扫描电镜图见图1，结果表明由于未加入丙酮，得到无纤维网状结构的丝素支架材料。
对比例2
一种丝素蛋白仿生多孔支架，其制备方法包括如下步骤：
将脱胶丝素蛋白溶解于六氟异丙醇中，配制5ml浓度为0.1g/ml的丝素蛋白溶液，然后向其中加入0.4ml丙酮，待溶液混匀后，再加入5gNH4HCO3作为致孔剂搅拌混匀；将所得溶液铺满直径为4cm的培养皿，放入超临界干燥设备中进行干燥，设定压力为15MPa，温度为35℃，干燥时间为8h；干燥后酒精浸泡一晚，再在60℃烘箱中烘干2天，得丝素支架。
本对比例所得产物的扫描电镜图见图2，结果表明由于丙酮 添加量较少，得到纤维网状结构不好的丝素支架材料。
实施例1
一种丝素蛋白仿生多孔支架，其制备方法包括如下步骤：
将脱胶丝素蛋白溶解于六氟异丙醇中，配制5ml浓度为0.06g/ml的丝素蛋白溶液，然后向其中加入1ml丙酮，待液体混匀后，再加入0.1ml丙酮，重复上述操作，直至液体完全呈凝胶状态，此时丙酮含量为1.5ml；再加入5g NH4HCO3作为致孔剂搅拌混匀；然后将所得溶液铺满直径为4cm的培养皿，放入超临界干燥设备中进行干燥，设定压力为15MPa，温度为35℃，干燥时间为8h；干燥后酒精浸泡一晚，再在60℃烘箱中烘干2天，得丝素蛋白仿生多孔支架。
本实施例所得产物的扫描电镜图见图3，表明得到具备共存的大孔和微孔特征、高孔隙率以及容许细胞粘附的粗糙的纳米纤维交织表面的丝素蛋白支架。
实施例2
一种丝素蛋白仿生多孔支架，其制备方法包括如下步骤：
将脱胶丝素蛋白溶解于六氟异丙醇中，配制5ml浓度为0.08g/ml丝素蛋白溶液，然后向其中加入1ml丙酮，待液体混匀后，再加入0.1ml丙酮，重复上述操作，直至液体完全呈凝胶状态，此时丙酮含量为1.3ml；再加入5g NH4HCO3作为致孔剂搅拌混匀；然后将所得溶液铺满直径为4cm的培养皿，放入超临界干燥设备中进行干燥，设定压力为15MPa，温度为35℃，干燥时间为8h；干燥后酒精浸泡一晚，再在60℃烘箱中烘干2天，得丝素蛋白仿生多孔支架。
本实施例所得产物的扫描电镜图见图4，表明得到具备共存的大孔和微孔特征(大孔孔径为150-250μm，微孔孔径为0.5-1μm)、高孔隙率以及容许细胞粘附的粗糙的纳米纤维交织表面的丝素蛋白支架。
实施例3
一种丝素蛋白仿生多孔支架，其制备方法包括如下步骤：
将脱胶丝素蛋白溶解于六氟异丙醇中，配制5ml浓度为0.1g/ml丝素蛋白溶液，然后向其中加入1ml丙酮，待液体混匀后，再加入0.1ml丙酮，重复上述操作，直至液体完全呈凝胶状态，此时丙酮含量为1.2ml；再加入5g NH4HCO3作为致孔剂搅拌混匀；然后将所得溶液(混合溶液)铺满直径为4cm的培养皿，放入超临界干燥设备中进行干燥，设定压力为15MPa，温度为35℃，干燥时间为8h；干燥后酒精浸泡一晚，再在60℃烘箱中烘干2天，得丝素蛋白仿生多孔支架。
本实施例所得产物的扫描电镜图见图5，表明得到具备共存的大孔和微孔特征(大孔孔径为150-250μm，微孔孔径为0.1-1μm)、高孔隙率以及容许细胞粘附的粗糙的纳米纤维交织表面的丝素蛋白支架。
实施例4
一种丝素蛋白仿生多孔支架，其制备方法包括如下步骤：
将脱胶丝素蛋白溶解于六氟异丙醇中，配制5ml浓度为0.1g/ml丝素蛋白溶液，然后向其中加入1ml丙酮，待液体混匀后，再加入0.1ml丙酮，重复上述操作，直至液体完全呈凝胶状态，此时丙酮含量为1.2ml；再加入7.5g NH4HCO3作为致孔剂搅拌混匀；然后将所得溶液铺满直径为4cm的培养皿，放入超临界干燥设备中进行干燥，设定压力为15MPa，温度为35℃，干燥时间为8h；干燥后酒精浸泡一晚，再在60℃烘箱中烘干2天，得丝素蛋白仿生多孔支架。
本实施例所得产物的扫描电镜图见图6，表明得到具备共存的大孔和微孔特征、高孔隙率以及容许细胞粘附的粗糙的纳米纤维交织表面的丝素蛋白支架。
应用例1
以实施例3所得混合溶液为原料，将上述溶液铺满直径为4cm的培养皿，溶液厚度为 1mm，放入超临界干燥设备中进行干燥，压力为15MPa，温度为35℃，干燥时间为3h。干燥后酒精浸泡一晚，再在60℃烘箱中烘干12h，如图7，最终制备得到薄膜样品。
应用例2
以实施例3所得混合溶液为原料，将上述溶液铺满直径为4cm的培养皿，溶液厚度为 2-3mm，放入超临界干燥设备中进行干燥，压力为15MPa，温度为35℃，干燥时间为4h。干燥后酒精浸泡一晚，再在60℃烘箱中烘干12h，如图8，最终制备得到薄膜样品。
应用例3
以实施例3所得混合溶液为原料，将上述溶液铺满厚度为1.5cm，模具为
的聚四氟乙烯孔板模具，然后放入超临界干燥设备中进行干燥，压力为15MPa，温度为35℃，干燥时间为8h。干燥后酒精浸泡一晚，再在60℃烘箱中烘干2天，如图9，最终制备得到柱状样品。
将实施例3所得混合溶液为原料，分别利用超临界干燥技术(SC-CO2SF，具体工艺参数见实施例3)和冷冻干燥技术(Ly SF，-50℃干燥24h)制备样品，进行细胞增殖实验：将第三代生长期间的L929成纤维细胞用胰酶消化，用完全培养液调整细胞悬浮液浓度至 5×104cell/mL。按100μL/well的密度接种于两种制备条件不同的多孔支架内，待细胞贴壁4小时后，补充培养基至每孔500μL，每隔2天更换全培养基；每个样品至少3组平行样品；在培养至1,3,5天后，每孔加50μlCCK-8试剂，细胞培养箱中继续培养4小时；细胞培养箱中取出后，用枪头将显色液转移到96孔板中，使用酶标仪测量在450nm波长的OD值。
不同干燥技术所得多孔支架的细胞培养的吸光度柱状图见图10，说明利用超临界干燥技术制备的丝素蛋白仿生多孔支架(图10深色柱)的生物性能优于一般方法(冷冻干燥技术)。
本发明所列举的各原料都能实现本发明，以及各原料的上下限取值、区间值都能实现本发明；在此不一一列举实施例。本发明的工艺参数的上下限取值、区间值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。
Claims (5)
1.一种丝素蛋白仿生多孔支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）将丝素蛋白溶于有机溶剂中，配制丝素蛋白溶液，然后加入丙酮形成凝胶状溶液；
2）将致孔剂加入所得凝胶状溶液中，混合均匀，然后转入超临界干燥设备中进行超临界干燥处理；
3）将步骤2）所得产物进行酒精浸泡，然后烘干，即得丝素蛋白仿生多孔支架；它具有纳米纤维形成的网状交织结构，包括大孔和微孔，大孔孔径为150-250μm，微孔孔径为0.1-1μm；
所述丝素蛋白溶液的浓度为0.06-0.1g/ml；所述丝素蛋白溶液与丙酮的体积比为5:(1.2-1.5)；
所述超临界干燥处理工艺包括：采用的超临界流体为CO2，设定温度为31.3~35℃，压强为7.3~20MPa，时间为3~8h。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为六氟异丙醇。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述致孔剂为碳酸氢铵。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述致孔剂与丝素蛋白的质量比为(5-15):1。
5.权利要求1~4任一项所述制备方法制备的丝素蛋白仿生多孔支架，其特征在于，它具有纳米纤维形成的网状交织结构，包括大孔和微孔，大孔孔径为150-250μm，微孔孔径为0.1-1μm。
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