KR101260208B1

KR101260208B1 - 상분리법을 이용한 나노섬유 구조 생체고분자의 제조방법

Info

Publication number: KR101260208B1
Application number: KR1020120111534A
Authority: KR
Inventors: 김해원; 방소희; 신원상
Original assignee: 단국대학교 산학협력단
Priority date: 2012-10-08
Filing date: 2012-10-08
Publication date: 2013-05-06
Also published as: KR20120127372A

Abstract

본 발명은 캠핀을 이용한 나노섬유 구조의 생체의료 고분자의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 반대 상으로서 캠핀을 이용하여 나노섬유상 구조의 생체 고분자를 제조하는 방법과, 반대 상으로서 캠핀을 이용하고 일반적인 스캐폴딩 방법을 적용함으로써 나노섬유상 구조를 가지는 3D 스캐폴드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

상분리법을 이용한 나노섬유 구조 생체고분자의 제조방법{A method of preparing nanofibrous-structured biopolymer using phase separaton}

본 발명은 상분리법을 이용한 나노섬유 구조 생체고분자의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 반대 상으로서 캠핀을 사용하는 상분리법을 이용하여 나노섬유상 구조의 생체 고분자를 제조하는 방법과, 반대 상으로서 캠핀을 사용하는 상분리법을 이용하고 일반적인 스캐폴딩 방법을 적용함으로써 나노섬유상 구조를 가지는 3D 스캐폴드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

최근 조직 재생 분야는 생체 재료 및 조직 공학의 발달로 인해 두드러지게 증가하고 있다. 손상되고 병든 조직을 재건하기 위한 스캐폴딩 접근법은 재생 의료에 있어 촉망받아 왔다. 스캐폴드의 표면 화학 및 형태학적 효과는 세포의 초기 가입(recruitment) 뿐만 아니라 이들의 이동, 및 이후의 분화 및 조직 형성에 있어 중요한 역할을 한다. 사실상, 몇몇의 생분해성 고분자가 조직 복구에 사용하기에 적합한 것으로 이미 밝혀졌다.

스캐폴드를 건조하는데 사용되는 생체 고분자들 중에서, 미생물 생체 고분자 종인, 폴리하이드록시알카노에이트(PHAs)는 많은 관심을 받아 왔다. 지금까지, 폴리하이드록시부티레이트(PHB), 폴리하이드록시발레르에이트(PHV) 및 이들의 공중합체(PHBV)를 포함하는 몇몇의 PHAs가 시험관 내 및/또는 생체 내에서 우수한 생체 적합성을 보여왔다. 따라서, 이들 화합물들은 봉합사, 상처 드레싱, 심혈관 이식편, 반월상 연골판(meniscus repair devices), 신경 도관(nerve guides), 유도 조직 재생 및 골 대체 물질과 같은 많은 의료 용도로 사용되어 왔다.

조직 재생 및 공학용 재료의 개발에 있어서 최근의 진보적인 연구들은 나노섬유 구조의 효과를 강조해왔다. 고분자 재료는 주로 나노섬유 망상 구조의 단백질로 이루어지고 기본적으로 세포외기질(ECMs)의 구조를 모방하는 것으로 여겨진다. 많은 연구들이 고분자 재료로 구성된 나노섬유 구조를 만들어내기 위해 시도되었다. 전기방사는 나노섬유 고분자를 생성시키기 위한 대개의 보편적인 방법이었다. 대안으로서, Ma 등은 몇몇 종류의 용매 이후 일련의 동결건조 공정을 이용하여 나노섬유의 폴리(락틱산)(PLA)를 얻을 수 있는 상 분리 방법을 사용하였다(Ma et al., J. Biomed . Nanotechnol ., 2005, 54; Ma et al., Biomaterials, 2007, 335). 시험관 내 테스트에서 나노섬유의 PLA가 치밀한 표면을 가진 PLA보다 골 세포 기능을 더욱 잘 자극시킴을 확인하였다. 이러한 나노섬유 구조상의 향상된 세포 부착과 이동은 전기방사된 고분자를 이용한 몇몇의 다른 연구에서도 확인되었다. 이러함에도 불구하고, 나노섬유 구조의 생체 고분자를 제조하기 위한 대체 기술을 개발하기 위한 연구들은 거의 수행되지 않았다. 실제로, 전기방사 공정은 공정 변수를 조절하기 위해 많은 노력이 필요하고 대량 생산 가능성이 매우 적다. 또한, 전기방사의 중요한 도전 과제 중의 하나는 조직 공학을 위한 복잡한 외형 및 3D 스캐폴딩의 제작과 관련한 어려움을 극복하는 것이다.

따라서, 나노섬유 웹의 생체 고분자 제조를 위한 단순한 기법의 제조방법이 요구된다.

이에 본 발명자는 상기와 같은 점을 감안하여 연구하던 중 반대 상으로서 캠핀을 사용하는 상분리법을 이용함으로써 단순한 방법을 사용하여 나노섬유상 구조의 생체 고분자를 제조할 수 있고 더 나아가 반대 상으로서 캠핀을 사용하는 상분리법을 이용하고 일반적인 스캐폴딩 방법을 적용함으로써 상기 나노섬유상 구조를 3D 스캐폴드 표면 상에 구현시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 반대 상으로서 캠핀을 사용하는 상분리법을 이용하여 쉽고 단순하게 다공성의 나노섬유상 멤브레인을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적은 반대 상으로서 캠핀을 사용하는 상분리법을 이용하고 일반적인 스캐폴딩 방법을 적용함으로써 쉽고 단순하게 3D 스캐폴드를 제조하는 방법을 제공한다.

하나의 양태로서, 본 발명은 고분자 용액을 준비하는 단계; 캠핀 용액을 준비하는 단계; 상기 고분자 용액과 캠핀 용액을 혼합하여 혼합 용액을 얻는 단계; 상기 혼합 용액을 주형에 부어 넣는 단계; 상기 주형에 넣은 혼합 용액을 실온에서 방치하여 다공성의 성형체를 얻는 단계를 포함하는 다공성의 나노섬유상 멤브레인을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에서, 상기 고분자로는 생체 고분자를 사용할 수 있다.

본 발명에서, 구체적으로 상기 고분자로는 폴리하이드록시부티레이트(PHB), 폴리하이드록시발레르에이트(PHV), 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 폴리카프로락톤, 폴리프로필렌퓨머레이트, 폴리다이옥세논, 및 이들의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 고분자로는 폴리하이드록시부티레이트와 폴리하이드록시발레르에이트의 공중합체(PHBV)를 사용하였다.

본 발명에서, 상기 캠핀:고분자의 혼합 비율은 중량 기준으로 바람직하기로는 1:1 내지 12:1, 더욱 바람직하기로는 7:1 내지 12:1, 가장 바람직하기로는 12:1로 하는 것이 바람직하다.

본 발명에서, 상기 고분자 용액과 캠핀 용액의 준비에 사용하는 용매로는 클로로포름, 1,4-디옥산, 디클로로메텐, 아세톤, 트리플루오로에탄올, 헥사플루오로프로판올 또는 이들의 조합을 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 고분자 용액과 캠핀 용액의 준비에 사용하는 용매로는 클로로포름을 사용하였다.

본 발명에서, 상기 방치 시간은 고분자 용액과 캠핀 용액의 혼합 용액이 고화되기에 충분한 시간이면 족하며, 혼합 용액의 조성에 따라 수분 내지 수시간으로 변화될 수 있다. 일반적으로는 10 분 내지 1 시간일 수 있다.

본 발명의 상기 방법은 상기 다공성의 성형체를 건조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서, 상기 성형체의 건조 시간은 수일, 바람직하게는 1~5일, 더욱 바람직하게는 2~3일 정도이다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 고분자 용액을 준비하는 단계; 캠핀 용액을 준비하는 단계; 상기 고분자 용액과 캠핀 용액을 혼합하여 혼합 용액을 얻는 단계; 상기 혼합 용액을 NaCl 입자가 포함되어 있는 주형에 부어 넣는 단계; 상기 주형에 넣은 혼합 용액을 동결시키는 단계; 상기 동결된 혼합물을 동결 건조시키는 단계; 상기 동결 건조된 혼합물을 물에 넣어 남아 있는 NaCl 입자를 용해시켜 거대 기공을 가지는 성형체를 얻는 단계를 포함하는 3D 스캐폴드를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에서, 상기 고분자로는 폴리하이드록시부티레이트(PHB), 폴리하이드록시발레르에이트(PHV), 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 폴리카프로락톤, 폴리프로필렌퓨머레이트, 폴리다이옥세논, 및 이들의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 고분자 용액과 캠핀 용액의 준비에 사용하는 용매로는 클로로포름과 1,4-디옥산의 공용매(1:4 부피비)를 사용하였다.

본 발명에서, 상기 NaCl 입자의 크기는 200 내지 500 mm일 수 있다.

본 발명에서, 상기 혼합 용액의 동결은 -10 내지 -30 ℃에서 수행할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 혼합 용액의 동결은 -20 ℃에서 수행하였다.

본 발명에서, 상기 동결된 혼합물의 동결건조는 -50 내지 -70 ℃에서 수행할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 동결된 혼합물의 동결건조는 -60 ℃에서 수행하였다.

본 발명에서, 상기 동결건조 단계를 거치면 거대 기공의 고분자 성형체 즉, 3D 스캐폴드가 제조되어진다.

본 발명에서는 반대 상(counter phase)으로서 캠핀을 이용한 단순한 방법을 사용하여 나노섬유상 구조의 고분자 멤브레인을 제조하였다. 첨가된 캠핀은 쉽게 고화되어 고분자와 혼합된 상을 형성하고, 이의 이후 승화를 통해 기공이 생성되고 결국 나노섬유상 망상조직을 형성하게 된다.

구체적인 일 실시예로서, 본 발명에서는 PHBV 용액을 다양한 농도로 캠핀(C₁₀H₁₆)과 혼합하여 혼합 용액을 얻고 상기 혼합 용액을 실온에서 방치시켜 상호 침투하는 망상조직의 고분자 멤브레인을 제조하였다. 상기 캠핀:PHBV의 혼합 비율은 1:1 내지 12:1로 하였다. 상기 방치하는 과정에서, 용매가 증발하게 되고 용매가 증발하는 도중 캠핀이 이것의 낮은 어는 점(~40 ℃)으로 인하여 쉽게 고화되게 된다. 이러한 캠핀의 승화는 PHBV로 이루어진 높은 다공도의 구조물을 생성시키게 되는 것이다. 상기 망상조직은 상대적으로 높은 캠핀의 농도에서(캠핀:PHBV ≥ 7:1) 나노섬유상 구조가 잘 형성된다.

본 발명의 실험예에서는 상기 본 발명의 방법에 따라 제조된 멤브레인의 표면 형태를 주사전자현미경으로 관찰함으로써 상기 고분자 성형체의 표면에 나노섬유상의 망상조직이 형성되었음을 확인하였다.

이러한 본 발명의 제조방법을 통해, 지금까지 주로 전기방사 공정을 이용하여 수행되었던, 나노섬유상 망상조직의 제조를 단순하고 새로운 대량 생산 방법으로 용이하게 수행할 수 있다.

한편, 조직 공학에서 전기방사 공정을 사용할 때 주요 단점은 3D 구조를 얻는데 어려움이 있다는 것이다. 그러나, 본원에 개시된 접근법은 이러한 문제점을 극복할 수 있다. 즉, 일반적인 스캐폴딩 방법을 적용함으로써 상기 나노섬유상 구조를 3D 스캐폴드 표면 상에 구현시킬 수 있다. 이를 위해, 본 발명의 실시예에서는 상기 나노섬유상 구조를 3D 다공성 스캐폴드의 표면 상에 부가할 수 있는 가능성에 대해 확인하였다. 이를 달성하기 위하여, 본 발명에서는 전형적인 스캐폴딩 공정 중 하나인 소금-침출법을 사용하였다.

본 발명의 실험예에서는 상기 본 발명의 방법에 따라 제조된 3D 다공성 스캐폴드의 표면 형태를 주사전자현미경으로 관찰함으로써 상기 3D 다공성 스캐폴드의 표면에 나노섬유상의 망상조직이 형성되었음을 확인하였다.

더 나아가, 본 발명의 실험예에서는 상기 멤브레인과 3D 다공성 스캐폴드의 초기 세포 부착 정도를 관찰하였다. 그 결과, 치밀한 표면에 비해 나노섬유상 구조를 가지는 본 발명의 멤브레인과 3D 다공성 스캐폴드에서 초기 세포 부착 정도가 크게 증진되었다.

본 발명의 방법은 멤브레인 또는 복잡한 3D 형태를 가진 나노섬유상 형태를 제조하기 위해 다른 종류의 고분자에 적용할 수 있으며, 쉽게 3D 스캐폴드를 제조할 수 없는 전기방사 기술에 대한 대안으로서 제공될 수 있다.

본 발명은 반대 상으로서 캠핀을 이용함으로써 단순한 방법을 사용하여 나노섬유상 구조의 생체 고분자를 제조할 수 있고 더 나아가 반대 상으로서 캠핀을 이용하고 일반적인 스캐폴딩 방법을 적용함으로써 상기 나노섬유상 구조를 3D 스캐폴드 표면 상에 구현시킬 수 있는 효과를 가진다.

도 1은 캠핀:PHBV의 비율을 0:1 내지 12:1 (비율 R은 각 이미지 내부에 도시됨)로 변화시킴에 따라, 각각 캠핀 승화에 의해 제조되는 다공성 구조의 PHBV의 형태를 보여주는 SEM 이미지이다. (×2k). 12:1에서의 나노섬유상 형태는 더 높은 확대배율로 더 나타내었다(×5k).
도 2는 비율 (R)을 각각 4 또는 8로 고정하였을 때, 멤브레인의 형태에 미치는 클로로포름 중 PHBV 농도의 영향을 나타내는 SEM 이미지이다. PHBV 농도는 각 이미지 내에 나타내었다(1.5 또는 3.5%). (×2k).
도 3은 R = 10에서 5% PHBV(w/v)를 사용하여 제조한 PHBV 멤브레인의 횡단면을 보여주는 SEM 이미지이다. 2 개의 다른 확대배율을 가진 이미지가 제공되었다 (좌: ×200; 우: ×3k). 시료는 액체 질소 내에서 퀀칭되고 파단시켜 제조되었다.
도 4는 종래 소금-침출법을 이용하여 2D 나노섬유상 구조를 3D 스캐폴드 상으로 구현한 모습을 나타내는 SEM 이미지이다. 2 개의 다른 확대배율을 가진 이미지가 제공되었다 (좌: ×50; 우: ×1.5k).
도 5는 본 발명의 나노섬유상 PHBV 멤브레인 (R = 10)과 종래의 치밀한 멤브레인의 초기 세포 부착 정도를 비교한 결과를 보여주는 것이다. 초기 세포 부착 정도는 다른 배양 조건 (배양 시간 및 세포 접종 밀도)에서 미토콘드리아 디하이드로게나제 활성에 기초하여 측정되었다. 통계학적 유의성은 p<0.05으로 관찰하였다.

이하, 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 효과를 보다 더 구체적으로 설명하고자 하나, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 나노구조의 PHBV 제조

클로로포름 내에 용해시킨 PHBV (Aldrich)를 멤브레인의 제조를 위한 출발 물질로서 사용하였다. 1, 2.5, 3.5 또는 5 중량%의 PHBV를 클로로포름에 용해시키고, 이후 캠핀 (C₁₀H₁₆, Aldrich)을, PHBV에 대한 캠핀의 중량비가 0, 2, 4, 6, 8, 10 및 12 중량부가 되도록 다양한 농도로 첨가하였다. 그 다음, 상기 혼합 용액을 실온에서 6 시간 동안 교반한 다음, 플라스틱 용기에 부은 후, 실온의 흄 후드 하에서 방치하여 용매가 건조되도록 하여 캠핀의 승화를 유도하였다. (혼합 조성에 따라) 수분 또는 수시간 후에, 상기 용액이 고화되었다. 그 다음 상기 용액을 고화된 후 추가 2일 동안 건조되도록 더 방치하고, 잔존하는 생성물을 24 시간 동안 진공 건조하였다. 마지막으로, 상기 시료를 용기로부터 벗겨내어, 특성을 조사하고 이후 세포 테스트로 평가하였다.

실시예 2: 3D 스캐폴드 제조

3D 스캐폴드를 제조하기 위하여, 1,4-디옥산 및 클로로포름의 공용매(1:4 부피비)를 용매로서 사용하여 캠핀과 PHBV의 혼합 용액을 제조하였다. 이때 1,4-디옥산을 사용하는 이유는 상기 혼합 용액이 -20 ℃ 부근에서 얼게 하기 때문이다. 거대 기공을 생성시키기 위하여, 200 내지 500 mm 범위의 크기를 가지는 NaCl 입자들을 선별한 다음, 원통형의 플라스틱 몰드 내에 넣었다. 그 다음 캠핀-PHBV 용액을 몰드 안으로 부어 넣고 -20 ℃에서 동결시킨 후, 상기 혼합물을 추가로 -60 ℃에서 동결 건조시켰다. 그 다음, 수조에 상기 시료를 넣음으로써 남아 있는 NaCl 입자들을 용해시킨 후 거대 기공의 PHBV를 얻었다.

실험예 1: 멤브레인의 표면 및 횡단면 형태 조사

상기 실시예 1에서 제조한 멤브레인의 표면 및 횡단면의 형태를 금으로 시료를 코팅한 후에 주사전자현미경(SEM, Hitachi)으로 조사하였다.

다른 농도의 캠핀 (R = PHBV에 대한 캠핀의 비율 = 0 내지 12)를 사용하여 제조한 PHBV의 전형적인 표면 형태를 SEM으로 조사한 결과를 도 1에 나타내었다.

클로로포름 내 PHBV의 함량을 5%(w/v)로 고정하였다. 캠핀이 첨가되지 않았을 때 (R = 0), 치밀한 표면 형태가 관찰되었다. 캠핀 농도가 R = 3으로 증가하였을 때, 치밀한 표면이 여전히 유지되었다. R = 6에서는 훨씬 더 큰 기공이 관찰되고 몇몇의 섬유상의 망상조직이 상기 기공 주변에 존재하였다. 캠핀의 농도가 R = 12까지 증가함에 따라 섬유상 형태가 유지되었고 더욱 분명하여 졌다. 또한, R = 12에서, 전형적인 섬유상 형태가 증가하고, PHBV의 섬유상 망상조직과 기공 채널의 형성이 현저함이 명백하였다. 섬유의 크기는 마이크로미터보다 훨씬 더 작았으며, 이로써 나노섬유상 형태의 존재를 명백하게 알 수 있었다. 이러한 형태학적 특징은 전기방사법을 사용하여 일반적으로 얻은 것들과 상당히 유사하였다.

한편, 도 2에서 보여지듯이, 클로로포름 내 PHBV의 함량 변화 (1.5 및 3.5%, w/v)도 수득된 멤브레인의 형태에 영향을 미쳤다. 2 개의 다른 캠핀 농도 (R = 4 및 R = 8)를 대표적인 시료로서 사용하였다. 2개의 모든 경우에서, 클로로포름 내 PHBV 함량의 감소가 섬유상 형태의 형성 증가를 이끌었다. 또한, PHBV 함량이 감소하고 캠핀 농도가 증가 (R = 8)함에 따라 상대적으로 큰 크기의 미세기공이 관찰되었으나, 나노섬유상 구조는 여전히 관찰되었다.

R = 10에서 얻은 PHBV의 횡단면 이미지를 도 3에 나타내었다. 액체 질소에 보관한 후에 파단 표면을 준비하였다. 잘-발달된 섬유상 형태가 멤브레인의 파단 표면 전체에 존재하는 것으로 확인되었다. 이는 도 1에서 보여진 표면 형태와 유사하였다.

상기 SEM 결과들로부터 캠핀이 PHBV의 다공성 및 나노섬유상 구조 형성에 중요한 역할을 한다는 점을 명백하게 확인할 수 있다. 이는 대기 건조 조건 하에서 클로로포름이 캠핀-PHBV-클로로포름 균질화 혼합물로부터 증발하기 시작하기 때문에 일어난다. 이러한 단계 동안, 캠핀은 고화되기 시작하고 그것의 극히 높은 어는 점 (~40 ℃)으로 인하여 PHBV와 서로 연결된 망상조직을 형성한다. 더 나아가, 캠핀이 대기 조건에서 쉽게 승화하기 때문에, 고화되는 캠핀이 기공을 더욱 발달시키고, 다공성 및 나노섬유상의 PHBV 망상조직을 생성시킨다. 그러므로, 캠핀의 독특한 특성, 즉 그것의 높은 어는 점과 승화의 용이성이 바람직한 형태학적 특징을 가지는 생체 고분자를 수득하는데 중요한 역할을 하는 것이다.

실험예 2: 3D 스캐폴드의 표면 및 횡단면 형태 조사

상기 실시예 2에서 제조한 스캐폴드의 표면 및 횡단면의 형태를 금으로 시료를 코팅한 후에 주사전자현미경(SEM, Hitachi)으로 조사하였다.

도 4는 동결건조 단계와 함께 클로로포름/1,4-디옥산 중 캠핀-PHBV 용액의 사용으로 수득한 3D 스캐폴드를 보여준다. 3D 스캐폴드의 확대된 표면 이미지는 나노섬유상 망상조직의 형성을 명확하게 보여준다. 이로써 2D 구조가 3D 스캐폴드 상으로 용이하게 부착될 수 있음을 알 수 있다. 따라서, 다른 스캐폴드 제작 기술을 나노섬유상 표면을 가진 3D 스캐폴드를 수득하는데 적용할 수 있다.

이러한 점에 근거하여, 본원의 방법이 적어도 PHBV 계에서는 전기방사 방식을 대체할 수 있는 것으로 여겨졌다.

실험예 3: 세포 부착 및 성장 조사

세포 테스트를 위하여, 원반형의 멤브레인 시료(직경 = 15 mm)를 준비하고 70% 에탄올로 멸균하였다. 그 다음 초기 세포 부착에 대한 PHBV 멤브레인의 표면 형태 효과를 전구 골아 세포 (MC3T3-E1)를 사용하여 평가하였다. 간략하게, 세포는 1% 항생제/항진균제를 함유하는 우태아 혈청 (FBS)이 보충된 α-최소 필수 배지 (α-MEM)에서 37 ℃, 5% CO₂ 하에 배양하였다. 세포가 7 일째 거의 합류 지점에 이른 후에, 이들을 회수하고, 각각 10,000 또는 40,000 세포를 함유하는 150 ㎕를 각각의 멤브레인 시료 상에 접종하였다. 세포 부착을 처음 24 시간 동안 MTS 법으로 평가하였다. 또한, 세포의 미토콘드리아 활성을 1, 3, 6 및 24 시간에 기록하였다. 각 시료의 세포 부착 수준을 평균 ± 표준편차로 나타내었으며 그룹 간의 차이를 스튜던트'스 t-테스트를 사용하여 비교하였다. 그룹 간에 데이터는 p<0.05 및 p<0.01에서 평가하였다.

수득된 나노섬유상 및 다공성의 구조물은 극히 큰 표면적을 가지며, 이는 단백질 및 세포의 고정을 위한 결합 부위를 제공하고, 조직 재생 물질로서 사용하기에 이롭게 한다. 생체재료에 관련된 생물학적 반응들 중에서, 초기 세포 부착 과정은 이것이 결국 이후 조직 재생 능력을 결정하기 때문에 특히 중요하다.

도 5는 본 발명의 나노섬유상 PHBV 멤브레인 (대표적인 시료로서 사용되는 R = 10인 멤브레인)과 종래 치밀한 PHBV 멤브레인의 초기 세포 부착 수준을 비교한 결과를 보여준다. 배양 시간 (1, 3, 6 및 24 시간)과 세포 접종 밀도 (10,000 및 40,000 세포/시료)는 부착에 대한 이들의 효과를 종합적으로 이해하기 위하여 변화시켰다. 세포 부착은 모든 배양 조건 하에서 치밀한 표면보다 나노섬유상 표면 상에서 더욱 우수하였으며, 유의적으로 더 높은 부착 수준이 관찰되었다 (^*p<0.05).

표면에 부착된 세포의 형태는 그래프 아래에 나타내었다. 6 시간에서, 나노섬유상 멤브레인 표면 상의 세포는 잘 부착되었고 많은 확장된 사상위족을 함유하는 것으로 확인되었다. 반면 치밀한 PHBV 표면 상에서 세포들은 한정된 확장을 가지는 것으로 나타났다. 7일째, 나노섬유상 멤브레인 상의 세포들은 활발히 증식되어 전체 표면을 거의 뒤덮는 층을 형성하였다. 더 나아가, 3D 스캐폴드 표면 상의 초기 세포 부착 정도는, 치밀한 표면과 나노섬유상의 표면 간에서 극적으로 달라지는 것으로 확인되었다. 특히, 세포들은 수많은 확장 부위들을 통해 밑에 있는 나노섬유상 기질에 단단히 결합되는 것으로 나타났으며, 반면 치밀한 표면을 가진 스캐폴드 상의 세포들은 부착되기 힘든 것으로 나타났다.

비록 본원에서 수행된 실험이 시험관 내 실험으로 제한되었지만, 상기 조사 결과는 캠핀을 사용하여 수득된 PHBV 멤브레인이 우수한 세포 적합성을 가지고 초기 세포 부착과 확장 및 이후 세포 증식을 돕는다는 점을 입증하였다. 세포 단계에 있어 초기 부착의 향상은 나노섬유상 구조의 발달과 관련있는 것으로 여겨진다.

Claims

고분자 용액을 준비하는 단계; 캠핀 용액을 준비하는 단계; 상기 고분자 용액과 캠핀 용액을 혼합하여 혼합 용액을 얻는 단계; 상기 혼합 용액을 200 내지 500 mm 크기를 갖는 NaCl 입자가 포함되어 있는 주형에 부어 넣는 단계; 상기 주형에 넣은 혼합 용액을 동결시키는 단계; 상기 동결된 혼합물을 동결 건조시키는 단계; 상기 동결 건조된 혼합물을 물에 넣어 남아 있는 NaCl 입자를 용해시켜 기공을 가지는 성형체를 얻는 단계를 포함하는 3D 스캐폴드를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 고분자는 폴리하이드록시부티레이트(PHB), 폴리하이드록시발레르에이트(PHV), 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 폴리카프로락톤, 폴리프로필렌퓨머레이트, 폴리다이옥세논, 및 이들의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 3D 스캐폴드를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 고분자 용액과 캠핀 용액의 준비에 사용하는 용매는 클로로포름, 1,4-디옥산, 디클로로메텐, 아세톤, 트리플루오로에탄올, 헥사플루오로프로판올 또는 이들의 조합인, 3D 스캐폴드를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 혼합 용액의 동결은 -10 내지 -30 ℃에서 수행되는, 3D 스캐폴드를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 동결된 혼합물의 동결건조는 -50 내지 -70 ℃에서 수행되는, 3D 스캐폴드를 제조하는 방법.