KR101649798B1 - 마이크로다공성 구조를 갖는 생분해성 고분자 스캐폴드의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생분해성 고분자 슬러리를 준비하는 제1단계; 상기 고분자 슬러리에 상온 이온성 액체(RTIL; room temperature ionic liquid)를 첨가하여 고분자와 상온 이온성 액체의 혼합 용액을 준비하는 제2단계; 상기 혼합 용액을 가열자켓을 구비한 실린지를 이용하여 분사하여 스캐폴드를 형성하는 제3단계; 및 형성된 스캐폴드로부터 상기 상온 이온성 액체를 추출하는 제4단계를 포함하는, 마이크로다공성 구조를 갖는 생분해성 고분자 스캐폴드의 제조방법, 및 상기 방법에 따라 제조된 마이크로다공성 구조를 갖는 생분해성 고분자 스캐폴드에 관한 것이다.

Description

마이크로다공성 구조를 갖는 생분해성 고분자 스캐폴드의 제조방법{Method for preparation of biodegradable polymer scaffold with microporous structure}

본 발명은 생분해성 고분자 함유 슬러리를 준비하는 제1단계; 상기 고분자 함유 슬러리에 상온 이온성 액체(RTIL; room temperature ionic liquid)를 첨가하여 고분자와 상온 이온성 액체의 혼합 용액을 준비하는 제2단계; 상기 혼합 용액을 분사하여 온도 차이에 의한 고형화에 의해 스캐폴드를 형성하는 제3단계; 및 형성된 스캐폴드로부터 상기 상온 이온성 액체를 추출하는 제4단계를 포함하는, 마이크로다공성 구조를 갖는 생분해성 고분자 스캐폴드의 제조방법, 및 상기 방법에 따라 제조된 마이크로다공성 구조를 갖는 생분해성 고분자 스캐폴드로서, 상기 스캐폴드는 생분해성 고분자를 매트릭스 수지로 함유하는 고분자 가닥을 2개 이상 구비한 생분해성 고분자 층이 2개 이상 적층된 형태인 고분자 스캐폴드에 관한 것이다.

조직 공학용 스캐폴드는 이식거부, 세포독성, 염증반응 등을 유발하지 않는 생체에 적합한 성질을 가져야할 뿐만 아니라 세포 주입 및 세포 증식 유도 효율이 높고 물질 전달이 용이한 것이 바람직하다.

이러한 점에서 생체고분자 재질의 3-D 열린 채널이 형성된 스캐폴드는 조직 공학을 위한 유망한 매트릭스 후보물질이다. 뿐만 아니라, 스캐폴드가 생물활성 분자를 전달할 수 있는 능력을 갖추었을 때, 조직 재생에 대한 잠재력은 현저히 향상된다. 줄기세포 또는 전구체 세포와 함께 스캐폴드를 생체 외 배양하는데 있어서, 스캐폴드에 결합된 치료적 분자들은 세포 증식을 향상시키고 계통-특이적 분화를 촉진할 수 있다. 나아가, 인공 스캐폴딩 매트릭스의 줄기세포 보충, 염증성 반응 억제, 신생혈관 형성 및 천연 세포(native cells)의 분화 및 성숙 등을 포함한 생체 내 치료적 기능은 현저히 향상될 수 있다.

폴리락트산(polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리카프로락톤(polycaprolactone; PCL) 및 이들의 공중합체를 포함하는 생분해성 고분자는 이들의 상대적으로 낮은 독성, 조절가능한 분해도(controllable degradability) 및 다공성 스캐폴드 형태로 조직 공학 스캐폴드로의 제작의 용이성으로 인해 널리 유용하게 사용되고 있다. 그러나, 바람직한 세포 및 조직 반응을 유도 또는 촉진하는 관점에서 이들 생분해성 고분자의 생물학적 활성은 잘 알려져 있지 않다. 이들 고분자의 생물학적 활성을 향상시키고자 하는 다양한 노력이 시도되고 있으며, 부착성 단백질과 같은 생물학적 활성 분자로 표면을 개질하는 것이 하나의 예이다. 또한 천연 고분자 또는 생물활성 무기물과 같은 생물활성 물질을 포함하는 조성물이 특히 경조직에 대한 유망한 전략으로 여겨지고 있다.

보다 열린 그리고 유망한 가능성은 고분자 스캐폴드 내에 치료적 분자를 조합 또는 봉입하는 것이며, 이는 최근 지대한 관심을 끌고 있는 분야이다. 합성 고분자는 주로 유기 용매에서 가공할 수 있으므로, 공정 과정 동안 스캐폴드 내에 직접 봉입할 수 있는 생물활성 분자에 대한 선택의 폭은 크게 제한된다. 수가용성 구획에 예컨대, 마이크로/나노입자 내에 생물활성 분자를 선-봉입(pre-loading)하여 간접적으로 결합(incorporation)되도록 하거나, 고분자 스캐폴드의 표면을 적당한 조성의 생물활성 분자로 코팅하는 단계를 포함하는 몇 가지의 방법이 있다. 이러한 방법들은 이들 생물활성 분자를 상당히 조절 가능한 방법으로 봉입하고 방출할 수 있으며, 결과적으로 시험관 내 세포 거동에 대한 및/또는 조직 재생 모델에서 치료 작용을 도출할 수 있음을 보여준다.

KR 10-1181738 B KR 10-0751733 B

본 발명자들은 고분자 스캐폴드 내에 조절된 방식으로 효율적으로 약물 등의 생체 물질을 봉입 및 방출할 수 있는 방법을 발굴하고자 예의 연구 노력한 결과, 생분해성 고분자에 친수성 음이온을 포함하는 상온 이온성 액체를 혼합하여 스캐폴드를 제조하는 경우 상분리에 의해 마이크로기공이 균일하게 분포되어 형성된 스캐폴드를 제조할 수 있으며, 또한 상기 스캐폴드의 표면을 개질함으로써 다양한 약물을 기공 내에 봉입 및 지속적으로 방출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 제1양태는 생분해성 고분자 함유 슬러리를 준비하는 제1단계; 상기 고분자 함유 슬러리에 상온 이온성 액체(RTIL; room temperature ionic liquid)를 첨가하여 고분자와 상온 이온성 액체의 혼합 용액을 준비하는 제2단계; 상기 혼합 용액을 분사하여 온도 차이에 의한 고형화에 의해 스캐폴드를 형성하는 제3단계; 및 형성된 스캐폴드로부터 상기 상온 이온성 액체를 추출하는 제4단계를 포함하는, 마이크로다공성 구조를 갖는 생분해성 고분자 스캐폴드의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 제2양태는 본 발명의 제1양태에 따라 제조된 마이크로다공성 구조를 갖는 생분해성 고분자 스캐폴드로서, 상기 스캐폴드는 생분해성 고분자를 매트릭스 수지로 함유하는 고분자 가닥을 2개 이상 구비한 생분해성 고분자 층이 2개 이상 적층된 형태인 고분자 스캐폴드를 제공한다.

본 발명의 제3양태는 본 발명의 제2양태의 마이크로다공성 구조를 갖는 생분해성 고분자 스캐폴드를 포함하는 이식체를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 생분해성 고분자 스캐폴드를 제조함에 있어서 친수성 음이온을 함유하는 상온 이온성 액체를 고분자 슬러리와 혼합한 용액을 방사하여 스캐폴드를 제조하는 경우, 온도차이에 의한 상분리에 의해 상온 이온성 액체에 의한 마이크로채널이 스캐폴드 내부에 형성되며 적절한 용매를 사용하여 이를 추출해 내면 상호 연결된 3차원 마이크로채널을 구비한 마이크로다공성 구조를 갖는 생분해성 고분자 스캐폴드를 제조할 수 있음을 발견한 것에 기초한다. 특히, 상기 상온 이온성 액체와 고분자의 혼합 슬러리를 초음파 처리하고 가열자켓을 이용하여 고온으로 유지하다가 저온으로 방사하여 스캐폴드를 형성하는 경우, 균일한 혼합물 상태를 유지하던 슬러리가 온도 차이에 의해 급격하게 고형화하여 균일하게 마이크로채널이 형성된 스캐폴드를 제조할 수 있다.

본 발명에 따라 마이크로다공성 구조를 갖는 생분해성 고분자 스캐폴드의 제조방법은 생분해성 고분자 함유 슬러리를 준비하는 제1단계; 상기 고분자 함유 슬러리에 상온 이온성 액체를 첨가하여 고분자와 상온 이온성 액체의 혼합 용액을 준비하는 제2단계; 상기 혼합 용액을 분사하여 온도 차이에 의한 고형화에 의해 스캐폴드를 형성하는 제3단계; 및 형성된 스캐폴드로부터 상기 상온 이온성 액체를 추출하는 제4단계를 포함한다.

바람직하게, 본 발명의 제조방법은 상기 제조된 고분자 스캐폴드를 세척하는 단계, 건조하는 단계 또는 둘 모두를 추가로 포함할 수 있다. 상기 세척은 RTIL의 추출에 사용되는 용매와 동일한 용매를 사용하여 수행함으로써 채널 내부에 잔류할 수 있는 여분의 RTIL을 제거할 수 있다. 상기 세척과정은 수회 반복하여 수행될 수 있다. 이후 건조하는 단계는 제조된 스캐폴드를 안전하고 위생적으로 보관하기 위하여 스캐폴드 표면 및 내부에 남아있는 용매를 제거하기 위하여 수행할 수 있다. 자연적으로 증발시켜 건조할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 공지의 생분해성 고분자 스캐폴드 건조 방법을 이용하여 수행할 수 있다.

바람직하게, 제1단계는 생분해성 고분자를 유기 용매에 용해시킨 후 균질화하여 수행할 수 있다. 상기 유기 용매로는, 디클로로메탄을 이용할 수 있으나, 사용한 생분해성 고분자를 용해시킬 수 있고 상온 이온성 용액과 소정의 조건에서 균질한 혼합 용액을 형성할 수 있는 한, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 균질화는 40 내지 70℃에서 6 내지 24시간 동안 고온 볼밀링(ball-milling)에 의해 달성할 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 균질화는 50℃에서 12시간 동안 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

바람직하게, 상기 마이크로다공성 구조는 전체 스캐폴드를 통해 열린 마이크로채널이 형성된 것이 특징이다.

바람직하게, 상기 마이크로다공성 구조는 평균입경 1 내지 10 μm의 기공 단면을 갖는 것이 특징이다. 입경이 너무 작을 경우 기공의 표면 처리가 어려우며, 너무 클 경우에는 약물이 쉽게 빠져나갈 수 있어 방출을 조절하기가 어려울 수 있다. 이와 같이 수 마이크로미터 수준의 평균입경을 가지므로 도중에 막히거나 하지 않고 전체 스캐폴드를 통해 연결된 열린 구조의 마이크로채널을 형성할 수 있다. 또한, 작은 크기의 소분자 화합물 이외에도 단백질 약물들을 봉입하기 위한 충분한 공간을 확보할 수 있으며, 필요에 따라 봉입된 약물의 지연된 방출을 위해 보다 견고한 결합을 형성할 수 있도록 봉입하고자 하는 약물과 특이적으로 결합할 수 있는 물질 예컨대, 특정 단백질을 특이적으로 인식하는 수용체 등을 코팅하는 등의 수식이 가능하다. 한편, 상기 마이크로기공의 평균입경은 생체 내 이식 시 일부 세포의 침투도 가능한 수준의 크기이므로 빠른 생착을 도모할 수 있다. 상기 기공 단면의 평균입경은 상온 이온성 액체에 함유된 음이온의 종류 및/또는 사용된 생분해성 고분자와 상온 이온성 액체의 비율 등에 따라 조절될 수 있다.

바람직하게, 상기 마이크로다공성 구조를 갖는 생분해성 고분자 스캐폴드의 공극율은 60 내지 90%의 범위일 수 있다. 공극율이 60% 미만인 경우 원하는 만큼 충분한 표면적 증가 효과를 나타낼 수 없고 또한 약물을 봉입할 수 있는 충분한 공간이 확보되지 못할 수 있다. 한편, 공극율이 90%를 초과하는 경우에는 지나친 기공의 형성으로 인해 골격이 유지되기 어렵고 강도가 현저히 감소되어 스캐폴드로서의 역할을 수행하기 어려울 수 있다.

본 발명의 용어, "생분해성 고분자(biodegradable polymer)"는 소정의 목적을 달성한 후 이산화탄소, 질소 등의 기체, 물, 바이오매스 및 무기염과 같은 천연 부산물(natural byproducts)로 분해되는 특정한 형태의 고분자를 의미한다. 상기 생분해성 고분자는 비교적 단시간 내에 분해되며, 분해 산물은 환경 오염 등의 문제를 일으키지 않는 환경 친화적 물질이다. 또한, 적당한 강도를 가지며 성형이 용이하고 분해 전이나 후에 체내에서 독성을 나타내지 않으므로 체내 이식을 위한 지지체로 사용될 수 있다. 상기 생분해성 고분자는 자연적으로 또는 인공적으로 합성하여 생산될 수 있으며, 에스테르, 아미드 또는 에테르 등의 작용기를 주로 포함한다. 고분자의 성질 및 분해 기전은 정확한 구조에 의해 결정될 수 있으며, 이들 고분자는 축합반응(condensation reaction), 고리 개방 중합화(ring opening polymerization) 및/또는 금속 촉매반응(metal catalysis) 등에 의해 합성될 수 있다.

바람직하게, 상기 생분해성 고분자는 폴리락트산(polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산(polyclycolic acid; PGA), 폴리카프로락톤(polycaprolactone; PCL), 폴리(D,L-락트산-코-글리콜산)(poly(D,L-lactic acid-co-glycolic acid); PLGA), 폴리(L-락타이드-코-D,L-락타이드)(poly(L-lactide-co-D,L-lactide); PLDLLA), 폴리히드록시부티레이트(polyhydroxybutyrate; PHB), 폴리히드록시발러레이트(polyhydroxyvalerate; PHV), 폴리(발레로락톤)(poly(valerolactone); PVL) 및 폴리디옥사논(polydioxanone; PDO 또는 PDS)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 당업계에 공지된 생체적합성 고분자를 제한없이 사용할 수 있다.

바람직하게, 제2단계로부터 형성된 혼합 용액을 초음파 처리하여 균질화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 혼합 용액 제조 후 이를 분사하여 스캐폴드로 제조하기 전에 초음파 처리하여 균질화하는 단계를 포함 또는 불포함하는 것을 제외하고는 동일한 물질, 방법 및 조건으로 제조한 스캐폴드의 형태를 비교하여, 초음파 처리하지 않은 스캐폴드에서는 불균일한 크기와 분포로 기공이 형성되는 것을 확인하였다. 따라서, 혼합 용액을 초음파 처리하는 단계를 추가로 포함함으로써 최종적으로 균일한 크기 및 분포로 형성된 마이크로기공을 포함하는 스캐폴드를 제공할 수 있다.

본 발명의 용어, "상온 이온성 액체(room temperature ionic liquid; RTIL)"는 상온(약 20 내지 25℃)에서 온전히 이온으로 구성되는 액체 상태로 존재하는 염을 의미하는 것으로, 예컨대, 800℃ 이상의 고온에서 용융상태로 존재하는 염화나트륨 등의 금속 염과 유사한 특성을 상온에서도 나타낼 수 있다. 상온 이온성 액체는 영하 수십℃ 이하의 낮은 융점을 갖는 물질들로 상온에서 고점도의 액체 상태로 존재할 수 있다. 상온 이온성 액체는 크고 비대칭적인(bulky and asymmetric) 유기 양이온을 포함하여 구성될 수 있다. 상기 양이온의 예로는 1-알킬-3-메틸이미다졸리움, 1-알킬피리디니움, N-메틸-N-알킬피롤리디니움 및 암모늄 이온이 있다. 또한, 흔하지는 않지는 하지만 포스포늄 양이온도 포함된다. 한편, 음이온으로는 다양한 범위의 음이온을 포함하여 구성할 수 있다. 상기 음이온의 범주는, 일반적으로 높은 융점을 제공하는 단순한 할라이드로부터, 비스트리플이미드(bistriflimide), 트리플레이트(triflate; OTf) 또는 토실레이트(tosylate)와 같은 커다란 유기 음이온에 이른다. 또한 포르메이트(formate), 알킬설페이트(alkylsulfate), 알킬포스페이트(alkylphosphate) 또는 글리콜레이트(glycolate)와 같은 비할로겐화 유기 음이온도 포함한다.

바람직하게, 상기 상온 이온성 액체는 비치환된 또는 C_{1 -6} 알킬로 치환된 이미다졸 양이온을 함유할 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 이미다졸 양이온은 부틸메틸이미다졸리움(butylmethylimidazolium; bmim) 또는 에틸메틸이미다졸리움(ethylmethylimidazolium; emim)일 수 있다.

한편, 바람직하게, 상기 상온 이온성 액체는 상대 음이온으로 친수성 음이온을 함유할 수 있다. 상기 용어, "친수성(hydrophilic)"은 물 분자와 상호작용하여 쉽게 융화되는 성질을 의미하는 것으로, 일반적으로 극성을 띠는 물질인 경우 친수성이라 할 수 있고, 이와 반대로 극성을 띠지 않는 경우 소수성이라 할 수 있다. 상기 친수성 및 소수성은 상호 상대적인 개념으로 친수성의 정도는 음이온의 극성 정도에 영향을 받으며, 일반적으로 이온성 액체에 널리 사용되는 음이온들에 있어서 극성 정도는 다음와 같다: Cl ＞ OTf ＞ BF₄ ＞ N(Tf)₂ ≒ PF₆. 보다 바람직하게, 상기 친수성 음이온은 트리플레이트(triflate; OTf) 또는 할로겐 예컨대, 염소 이온(Cl)일 수 있다.

바람직하게, 상기 상온 이온성 액체는 사용된 생분해성 고분자 100 중량부에 대해 25 내지 50 중량부로 사용할 수 있다. 사용된 상온 이온성 액체의 양이 너무 적은 경우 충분한 크기의 마이크로채널이 형성되지 못하여 좁은 또는 비연속적인 채널이 형성될 수 있으며, 반대로 너무 많은 경우 과도한 상분리로 마이크로채널 형성이 어려울 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 다양한 음이온을 함유하는 상온 이온성 액체를 사용하여 스캐폴드를 제조함으로써 상온 이온성 액체 중에 함유된 음이온의 성질에 따른 마이크로기공 구조의 형성을 확인하였다. 먼저 외관상으로 친수성 음이온인 OTf 또는 Cl을 함유하는 RTIL은 소수성 음이온인 BF₄ 또는 SbF₆을 함유하는 RTIL에 비해 잘 분산되어 균질한 투명 용액을 형성함을 확인하였다. 나아가, 상기 RTIL에 함유된 음이온의 성질(친수성 또는 소수성)에 따라 상분리 및 마이크로기공 구조 형성이 현저히 변화하는 것을 확인하였다. 결과적으로, 친수성 음이온을 함유한 RTIL을 사용한 경우 전체 영역에 걸쳐 균일한 크기 및 분포로 마이크로기공이 형성된 스캐폴드를 형성할 수 있었으나(도 2a, 2b, 2g, 및 2h), 소수성 음이온을 함유한 RTIL을 사용한 경우 균일하게 기공이 형성되거나 열린 채널 형태로 형성되지 못하고 불균일하게 기공이 형성된 또는 막힌 채널 구조가 나타나 증가된 표면적 및 공간을 제공하여 내부에 약물 등을 봉입할 수 있는 열린 마이크로채널이 형성된 구조를 갖는 스캐폴드의 장점을 얻을 수 없는 것으로 확인되었다(도 2i, 2j, 2k, 및 2l).

또한, 바람직하게, 제3단계에서는 가열자켓을 이용하여 혼합 용액을 50℃ 이상으로 유지하도록 조절할 수 있다. 전술한 바와 같이, 방사하기 전에 혼합 용액을 초음파 처리하여 균질화하는 것은 균일한 크기 및 분포로 마이크로기공을 형성하는 데 도움이 된다. 이와는 별도로 방사하기 전까지 혼합 용액의 온도를 50℃ 이상의 고온으로 유지하는 것 또한 중요하다. 용액의 온도가 50℃ 이상으로 유지되지 못할 경우 이로부터 제조되는 스캐폴드는 마이크로기공 구조가 쉽게 무너질 수 있으며, 이른 상분리로 인해 고형화 이전에 용액 상태로부터 이온성 액체와 고분자 용액 상이 분리되어 균질한 용액상을 유지하지 못하여 나타나는 것으로 사료된다.

이때, 상기 가열자켓은 그 형태나 방식에 제한되지 않으며, 실린지의 내부 또는 외부에 구비되어 용액의 온도를 일정 수준 이상으로 유지할 수 있도록 고안된 장치를 제한없이 사용할 수 있다.

바람직하게, 제3단계는 -10℃ 내지 10℃의 물을 함유하는 용매에 분사함으로써 수행될 수 있다. 상기 가열자켓을 이용하여 고온으로 유지된 혼합 용액을 상기 저온의 용매에 분사함으로써 상분리와 고형화가 동시에 발생함으로써 RTIL에 의해 형성된 마이크로채널을 포함하는 생분해성 고분자 스캐폴드를 형성할 수 있다.

상기 혼합 용액을 분사하여 스캐폴드를 형성하는 제3단계는 자동 분사 기법(robotic dispensing method)에 의해 수행될 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업계에 공지된 분사 방식의 스캐폴드 성형 기법을 제한없이 사용할 수 있다.

이어서, 상기 형성된 마이크로채널을 포함하는 생분해성 고분자 스캐폴드로부터 RTIL을 추출하는 제4단계를 수행함으로써 스캐폴드 내에 함유된 RTIL을 제거하고 이에 의해 형성된 마이크로채널을 포함하는 생분해성 고분자 스캐폴드를 순수하게 얻을 수 있다.

바람직하게, 제4단계는 양성자성 용매를 사용하여 수행할 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 양성자성 용매는 물, C_{1 -4} 저급 알콜 또는 이들의 혼합 용매일 수 있다. 보다 바람직하게는 에탄올 수용액일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 제3단계의 방사를 빙냉의 에탄올 수용액에서 수행하는 경우 고형화에 의한 스캐폴드 형성과 동시에 용매 즉, 에탄올에 의한 상온 이온성 액체의 추출을 동시에 달성할 수 있다. 즉, 제3단계와 제4단계는 동시에 수행될 수 있다.

한편, 형성된 스캐폴드의 친수성을 향상시키기 위하여 스캐폴드 표면을 개질하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 스캐폴드 표면을 개질하는 단계는 스캐폴드를 염기성 용액으로 처리하여 수행할 수 있으며, 이때, 상기 염기성 용액으로는 수산화나트륨과 에탄올의 혼합 용액을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 염기성 용액으로 처리하여 표면 개질하는 단계는 마일드한 조건에서 수행할 수 있다. 예컨대, 1 M NaOH 용액에서 1시간 처리하는 등의 과도한 조건에서 수행하는 경우, 형성되어 있던 스캐폴드의 마이크로기공이 막히거나 균열되는 등 손상될 수 있다. 따라서, 바람직하게, 표면 개질을 위하여 염기성 용액으로 처리하는 단계는 마일드한 조건, 예컨대, 0.1 M NaOH 용액으로 15분 동안 처리하여 수행될 수 있으나, 스캐폴드에 형성된 마이크로기공 구조를 유지하는 한, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 마이크로다공성 구조를 갖는 생분해성 고분자 스캐폴드로서, 상기 스캐폴드는 생분해성 고분자를 매트릭스 수지로 함유하는 고분자 가닥을 2개 이상 구비한 생분해성 고분자 층이 2개 이상 적층된 형태인 고분자 스캐폴드를 제공할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 x, y 및 z 방향으로 이동 가능한 스테이지를 이용하여 조절된 속도 및 방향으로 실린지 또는 수조를 이동시키면서 용액을 분사하여 2개 이상의 마이크로다공성 구조를 갖는 생분해성 고분자 가닥을 구비한 고분자 스캐폴드를 제조하였다. 먼저, x 및 y 방향으로 실린지 또는 수조를 이동시키면서 용액을 분사하여 2개 이상의 고분자 가닥을 소정의 면적으로 동일한 평면에 소정의 간격으로 평행하게 위치시켜 하나의 층을 이루게 한 후 z 축 방향으로 상기 형성된 고분자 가닥의 두께만큼 이동시키고 하단의 고분자 가닥과는 수직을 이루도록 x 및 y 방향으로 이동시키면서 전술한 방법으로 제2층을 형성하였다. 상기 과정을 원하는 두께에 이를 때까지 반복하여 수행함으로써 원하는 크기의 3차원적 스캐폴드를 수득하였다. 이렇게 제조된 스캐폴드의 예를 도 1a 및 10에 나타내었다.

나아가, 본 발명은 상기 마이크로다공성 구조를 갖는 생분해성 고분자 스캐폴드에 포함하는 이식체를 제공할 수 있다.

바람직하게, 상기 마이크로다공성 구조를 갖는 생분해성 고분자 스캐폴드를 포함하는 이식체는 이의 마이크로 기공에 추가로 약물을 봉입시킨 이식체일 수 있다. 전술한 바와 같이, 상기 스캐폴드의 마이크로기공은 수 마이크로미터의 평균직경을 가지며 표면을 개질하여 친수성을 향상시킬 수도 있으므로, 다양한 성질의 생물학적 활성을 갖는 화합물 또는 단백질 등의 약물을 봉입할 수 있다. 상기 화합물은 천연 또는 합성 화합물일 수 있다. 보다 바람직하게, 성장인자(growth factors)를 봉입시킨 이식체일 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 시험관 내 시험을 통해 마이크로기공을 포함 또는 불포함하는 동일한 소재의 생분해성 고분자 스캐폴드 상에 골아전구세포를 부착배양하여 세포부착능 및 생체적합성을 확인하여, 마이크로기공 형성에 따른 표면 변화에도 불구하고 마이크로기공을 포함하는 스캐폴드에서 보다 우수한 세포접착능 및 부착율을 나타내는 것으로 확인하였다(도 4a 내지 4c). 이는 증가된 표면적에 의한 초기 접촉률의 증가에 따른 것으로 보여지며, 이는 이어지는 증식 및 조직 특이적 분화를 촉진할 수 있는 조건을 제공한다. 또한, 상기 마이크로기공을 포함 또는 불포함하는 생분해성 고분자 스캐폴드를 생체 내 이식하고 4주 후 회수하여 조직 반응을 확인한 결과, 이식거부, 염증발생 및 독성 등의 부작용을 나타내지 않았다. 특히, 마이크로기공을 포함하는 스캐폴드의 경우 스캐폴드 내로의 세포가 침투하여 균일하게 분포되었으며, 따라서, 이식체에 의한 보다 효과적인 조직 유사 구조의 유도가 가능하며 이에 따라 스캐폴드에 의한 천연 조직 구조물을 치환을 가속화할 수 있을 것으로 기대된다(도 4d 내지 4i).

본 발명에 따른 마이크로다공성 구조를 갖는 생분해성 고분자 스캐폴드의 제조방법은 친수성 음이온을 함유하는 상온 이온성 액체와 생분해성 고분자의 균일한 혼합물로부터 상분리에 의해 마이크로기공이 균일하게 형성되어 조절된 방식으로 약물을 봉입 및 방출할 수 있는 스캐폴드를 제공할 수 있으며, 추가적인 표면 개질을 통해 상기 스캐폴드에 봉입될 수 있는 약물의 종류를 확장할 수 있다. 또한, 상기 제조된 스캐폴드는 세포의 접착에 유리하고 이식거부나 염증 등의 부작용을 나타내지 않고 스캐폴드의 내부까지 균일하게 세포가 침투하여 조직 유사 구조를 형성할 수 있으므로 성장인자 등을 추가로 봉입시켜 뼈와 같이 손상된 경조직을 위한 이식체로 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 마이크로채널이 형성된 생체고분자 스캐폴드의 이미지 및 이를 제조하기 위한 자동 분사 기법(robotic dispensing technique)을 개략적으로 나타낸 도이다. (a)는 상기 마이크로채널이 형성된 생체고분자 스캐폴드 제조용 장비 및 이로부터 제조된 스캐폴드 이미지를 나타내며, (b)는 RTIL과의 혼합물로부터 생체고분자 스캐폴드 내에 마이크로기공 구조를 형성하는 기전을 개략적으로 나타낸다.
도 2는 다양한 조건에서 제조된 생체고분자 스캐폴드의 이미지를 나타낸 도이다. (a) 및 (b)는 RTIL(OTf)-지원형(assisted) PLA(polylactic acid) 스캐폴드의 SEM 형태이며, (c) 및 (d)에 나타난 RTIL을 배제한 순수한 PLA와는 대조적으로, 스캐폴드 전체를 통해 다수의 균일하게 분포된 마이크로기공이 형성되었음을 나타낸다. RTIP-PLA 혼합물을 초음파 처리하고 서모자켓(thermojacket)을 이용하여 용액을 실린지 내에서 50℃로 유지하였으며, 이후 빙냉(-4℃)의 수조로 자동 분사하였다. (e)는 용액을 초음파 처리하지 않았을 때 관찰되는 균일하지 않은 마이크로기공 구조를 나타낸다. (f)는 용액을 50℃로 가열하지 않은 경우 마이크로기공이 형성되지 않았음을 나타내며, 이는 공정 온도의 중요성을 나타낸다. (g) 및 (h)는 OTf 대신에 친수성 음이온 Cl을 함유한 RTIL을 사용하는 경우 유사한 마이크로기공 구조가 형성되었음을 나타내는 반면, (i) 및 (j) 또는 (k) 및 (l)은 각각 소수성 음이온 SbF₆ 또는 BF₄를 함유하는 RTIL을 사용하는 경우 본 발명의 고도의 마이크로기공 형태를 형성할 수 없음을 나타내며, 이는 음이온성 RTIL의 성질(친수성 또는 소수성)의 중요성을 나타낸다. (m) 및 (n)은 RTIL(OTf)-지원형 PLA 마이크로기공 스캐폴드의 단면 형태를 나타내며, 이는 스캐폴드 내에 균일하게 분포된 마이크로기공의 존재를 보여준다.
도 3은 NaOH/에탄올 용액으로 표면 처리한 마이크로기공 PLA 스캐폴드의 친수성 향상을 나타낸 도이다. (a)는 고도의 마이크로다공성 및 소수성 표면에 의한 마이크로다공성 PLA 스캐폴드의 부력(buoyancy)을 나타낸 도이다. 20℃에서 가볍게 교반하면서 0.1 M NaOH/에탄올(1:1) 용액으로 15분 동안 처리한 후, PLA 표면은 친수성화하여 스캐폴드는 완전히 그리고 빠르게 물을 흡수하여 침전되었다. (b) 및 (c)는 스캐폴드의 SEM 형태를 나타낸 것으로, (b)는 적절한 조건(0.1 M NaOH/에탄올로 15분 동안 처리) 하에서 NaOH/에탄올 처리한 경우 마이크로기공 구조가 유지되는 것을 나타내는 반면, (c)는 과도한 조건(1 M NaOH로 1시간 동안 처리)으로 처리한 경우 마이크로기공이 심하게 손상(막힘 및 균열)되었음을 나타낸다. (d)는 0.1 M NaOH/에탄올(1:1) 용액에서 15분까지 표면 처리 시간에 따른 RTIL(OTf) 지원형 또는 비지원형 PLA 스캐폴드의 접촉각 변화를 나타낸 도이다. 특히 마이크로다공성 PLA 스캐폴드에 대해 접촉각의 현저한 감소가 관찰되었다(비-마이크로다공성 스캐폴드에서 60°로부터 35°로, 대 마이크로다공성 스캐폴드에서 58°로부터 15°로). 우측에는 접촉각 측정에 사용한 디스크 형태의 시료를 나타내었으며, 색상의 차이는 마이크로기공의 존재에 기인한다.
도 4는 본 발명에 따른 마이크로다공성 PLA 스캐폴드의 생체적합성 평가 결과를 비-마이크로다공성 스캐폴드와 비교하여 나타낸 도이다. (a) 내지 (c)에는 24시간 동안 배양한 MC3T3-E1 세포를 사용하여 수행한 세포 부착 어세이 결과를 나타내었다. (a) 및 (b)는 세포의 SEM 이미지로 광범위한 세포골격 과정(extensive cytoskeletal processes) 및 친밀한 부착 접촉(intimate adhesion contact)을 수반하는 마이크로다공성 표면 상에 대한 우수한 부착능을 가짐을 나타낸다. (c)는 24시간에 걸친 CCK 기법에 의해 분석한 결과를 나타내며, 그 결과로부터 비-마이크로다공성 기재에 비해 마이크로다공성 기재에 현저히 세포가 현저히 높은 세포 부착 수준을 나타냄을 확인하였다. (d) 내지 (i)는 랫트 피하 조직에서 수행한 스캐폴드의 생체 내 조직적합성 분석 결과를 나타낸다. 4주 동안 이식 후 (d) 비-마이크로다공성 및 (e) 마이크로다공성 PLA 스캐폴드의 H&E 염색한 조직학적 이미지는 거시적인 조직(macroscopic tissue) 및 세포 반응을 보여준다. 이로부터 신생 혈관 형성의 실질적 징후(화살표)가 관찰되었다. 세포는 스캐폴드 뼈대(scaffold framework; "S"로 표기) 상에 잘 정렬되었으며, 조밀히 집적되었다. 계면에서 조직 반응이 나타나는 비-마이크로다공성 및 마이크로다공성 스캐폴드 뼈대 주변의 몇몇 대표적인 이미지를 확대하여 각각 (f)와 (g)에 나타내었다. 비-마이크로다공성 스캐폴드에서 얇은 주변을 둘러싼 세포막을 수반하는 스캐폴드 뼈대의 주변부에서 많은 수의 섬유아세포성 세포(fibroblastic cells)이 나타나는 반면, 마이크로다공성 스캐폴드에서는 많은 세포가 스캐폴드 뼈대 내에서 발견되었으며, 스캐폴드에서 주변을 둘러싼 세포층이 보다 확연히 나타났다. 대표적인 이미지를 고배율로 획득하여 (h) 비-마이크로다공성 및 (i) 마이크로다공성 스캐폴드 간의 대조적인 특징을 관찰하였다. 스케일 바 = 100 μm.
도 5는 마이크로다공성 또는 비-마이크로다공성 PLA 스캐폴드에 대한 앰피실린-봉입 연구 결과를 나타낸 도이다. 각각의 스캐폴드 시료를 PBS에 녹인 앰피실린 용액(100 μg/ml)에 담그고 시간에 따른 약물 봉입을 측정하였다. 비-마이크로다공성 스캐폴드에 비해 마이크로다공성 스캐폴드에 대한 앰피실린 봉입이 현저히 증가되었다. 포화량은 마이크로다공성 PLA에 대해 ~17%인 반면, 비-마이크로다공성 PLA에 대해서는 단지 ~3%였다.
도 6은 28일까지 측정한 마이크로다공성 또는 비-마이크로다공성 PLA 스캐폴드로부터 Na-앰피실린 방출 연구 결과를 나타낸 도이다. (a) 및 (b)는 각각 약물 누적 프로파일 및 정상화한 앰피실린 방출률을 나타낸다. 약물 누적 프로파일은 초기 약물 봉입량에 대해 정상화하였다. 각각의 삽입도는 초기 48시간 동안의 방출 플롯을 보여준다. 거의 모든 앰피실린이 비-마이크로다공성 스캐폴드로부터 1일 이내에 방출되었다. 그러나, 마이크로다공성 스캐폴드로부터는 1일 후까지 단지 30% 만이 방출되었으며, 잔류 약물은 28일까지의 테스트 기간에 걸쳐 상당히 지속적으로 방출되었다. 마이크로다공성 PLA에 대해, 시점 간의 방출량의 통계적 비교는 현저한 차이를 나타내었으며, 이로부터 테스트 기간에 걸친 현저한 앰피실린 방출을 확인하였다(P＜0.05). 그러나, PLA에 대해서는 72시간 이후 눈에 띄는 방출이 존재하지 않았다.
도 7은 비-마이크로다공성 스캐폴드에 대한 마이크로다공성 PLA 스캐폴드의 Cyt C 봉입의 비교 연구 결과를 나타낸 도이다. PBS에 용해시킨 Cyt C 용액(100 μg/ml)에 각각의 스캐폴드 시료를 담그고 시간에 따른 단백질-봉입량을 측정하였다. 비-마이크로다공성 PLA에 비해 마이크로다공성 PLA에 대해 현저히 증가된 앰피실린 봉입율을 나타내었다. 포화량은 마이크로다공성 PLA에 대해 ~38%인 반면, 비-마이크로다공성 PLA에 대해서는 단지 ~5%였다.
도 8은 초기 Cyt C 농도를 변화시키면서 수행한 Cyt C 봉입 연구 결과를 나타낸 도이다. PBS에 25, 50, 100, 200, 400 및 800 μg/ml 농도로 용해시킨 Cyt C 용액을 사용하였다. (a) 및 (b)는 각각 비-마이크로다공성 PLA 또는 마이크로다공성 PLA 스캐폴드에 대해 측정한 다른 초기 Cyt C 농도(25, 50, 100 및 200 μg/ml)에서 봉입 시간에 따른 Cyt C 봉입량을 나타낸다. (c)는 초기 Cyt C 봉입 농도 C_e에 대한 봉입용량 q_e로 나타낸 봉입 등온선(loading isotherm)으로서, 초기 농도의 증가에 따라 점진적인 증가를 나타내었으나, 그 증가율은 점차 감소하여 근사 플래토 효과(near plateau effect)를 나타내었다. 봉입용량에 있어서 마이크로다공성 및 비-마이크로다공성 스캐폴드 간의 현저한 차이가 나타났다. 그래프에 수정된 랭뮤어 모델(Langmuir model)을 적용하여 우수한 최적화를 도출하였으며, 이로부터 속도상수 K 값을 결정하였다. 도출된 K 값은 마이크로다공성 및 비-마이크로다공성 스캐폴드에 대해 각각 5.8×10^-3 및 9.1×10^-3이었다.
도 9는 28일까지 측정한 마이크로다공성 또는 비-마이크로다공성 PLA 스캐폴드로부터 Cyt C 방출 연구 결과를 나타낸 도이다. 초기 봉입량 100 μg의 시료를 방출 연구에 사용하였다. (a) 및 (b)는 각각 Cyt C의 누적 프로파일 및 정상화한 Cyt C 방출률을 나타낸다. Cyt C의 누적 프로파일은 초기 단백질 봉입량에 대해 정상화하였다. 각각의 삽입도는 초기 48시간 동안의 방출 플롯을 보여준다. 비-마이크로다공성 스캐폴드로부터 Cyt C는 최초 1일에 ~73%만큼 매우 빠르게 방출되었으며, 이후 2일 이내에 거의 완전히 방출(~93%)되었다. 그러나, 마이크로다공성 스캐폴드로부터는 최초 1일 동안 단지 28% 만이 방출되었고 이후로부터 28일까지 0승에 가까운 반응속도를 갖는 고도로 지속적인 방출 패턴이 관찰되었다. 마이크로다공성 PLA에 대한 시점 간의 방출량의 통계적 비교는 현저한 차이를 나타내었으며, 이로부터 테스트 기간에 걸친 현저한 Cyt C 방출을 확인하였다(P＜0.05). 그러나, PLA에 대해서는 72시간 이후 눈에 띄는 방출이 존재하지 않았다.
도 10은 PCL 생체고분자 스캐폴드에 대한 RTIL(OTf)-지원형 마이크로다공성 구조 형성 방법론의 적용을 나타낸 도이다. (a) 및 (b)는 스캐폴드에 걸쳐 마이크로 기공의 성공적으로 형성되었음을 나타낸다. 이의 단면을 각각 (c) 및 (d)에 나타내었으며, 이로부터 표면뿐만 아니라 스캐폴드 뼈내 내부에도 마이크로 기공이 형성되었음을 확인하였다. (e) 및 (f)는 RTIL(OTf)를 사용하지 않고 제조한 종래 PCL 스캐폴드에 대한 이미지로 상기 RTIL(OTf)-지원형 스캐폴드와 현저한 대조를 나타내었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 마이크로다공성 매크로채널이 형성된 스캐폴드의 제조

폴리락트산(PLA; polylactic acid; L-type, 6201D, Nature Works LLC)를 30%(w/v)로 디클로로메탄에 용해시키고 50℃에서 12시간 동안 고온 볼밀링(ball-milling)으로 균질화하여 PLA 슬러리를 제조하였다. 상온 이온성 액체(room temperature ionic liquid; RTIL)로서 다양한 상대 음이온(counter anion)을 함유하는 1-부틸-3-메틸이미다졸리움(1-butyl-3-methylimidazolium; [bmim])-기반 이온성 액체([bmim]X; X=OTf, Cl, BF₄ 또는 SbF₆, C-Tri Co. Ltd.로부터 구입)를 마이크로다공성 구조를 갖는 PLA 제조를 위한 상대-상(counter-phase)으로 선택하였다. PLA과 RTIL은 3:1의 중량비로 사용하였다. 상기 PLA와 RTIL의 비율을 변화시키면서 확인한 바, RTIL의 비율이 증가함에 따라 상분리가 발생하는 것이 관찰되었다. OTf 또는 Cl을 함유하는 RTIL은 BF₄ 또는 SbF₆을 함유하는 RTIL에 비해 잘 분산되어 균질한 투명 용액을 형성함을 확인하였다.

자동 분사 기법(robotic dispensing technology)을 이용하여 PLA-RTIL 혼합 용액으로부터 마이크로채널이 형성된 스캐폴드를 제조하였다. PLA-RTIL 혼합 용액을 열적으로 조절된 50℃로 세팅된 히팅 자켓(heating jacket) 내에 위치시킨 실린지에 넣었다. 이후 용액을 520 μm 직경의 바늘을 통해 주사하였다. 이때, 힘-조절된 플런저(force-controlled plunger)를 이용하여 질량 흐름 속도를 조절하였다. 컴퓨터에 연결된 위치 조절 단위를 사용하여 섬유 분사 경로(fiber dispensing path)를 지휘하였다. 섬유를 분사하는 속도를 5 mm/s로 하여 균일한 섬유 디포짓 및 잘 발달된 매크로채널이 형성된 구조물을 수득하였다. 분사 프로그램을 조절함으로서 기공 크기 및 공극률 등 다른 기공 형태(configuration)의 다공성 스캐폴드를 제조하였다. 본 발명에서 제조하고자 의도한 스캐폴드의 기공크기는 xy-평면에서 500 μm×500 μm이며, 분사하는 섬유의 상호 간격을 조절함으로써 이를 달성하였다. 한편, z-축을 따른 기공 규모는 섬유의 직경에 의해 결정되었다. 한편, PLA-RTIL 조성을 빠르게 고체화하기 위하여 냉각된 에탄올 수조에서 디포지션을 수행하였다. 이때, RTIL 상은 에탄올 수조에서 완전히 용해되므로, 제조된 스캐폴드는 고형화된 매크로채널이 형성된 구조를 보존하였다. 디포지션 후, 스캐폴드를 에탄올로 각 10분씩 3회 세척하고 이후 사용을 위하여 건조하여 보관하였다.

또한, 상기 제조된 스캐폴드의 표면을 염기성 용액으로 처리하여 친수성을 향상시켰다. 스캐폴드를 실온에서 동일한 부피의 0.1 M NaOH 수용액과 에탄올의 혼합용액에 15분 동안 담그고 흔들어 주었다. 스캐폴드의 마이크로다공성 및 매크로채널 구조를 유지하면서 우수한 물 친화성을 부여하기 위한 최적의 NaOH 농도 및 처리시간을 결정하였다. 그 결과, 처리 전 증류수에 부유하였던 스캐폴드는 상기 염기성 용액으로 표면 개질 후 증류수에 완전히 잠기게 되었다. 상기 염기성 용액으로 처리한 스캐폴드를 증류수로 완전히 세척하였다(각 10분씩 3회). 비교를 위하여, 상기 자동 분사된 스캐폴드 대신에 막 형태의 PLA를 준비하였다. 구체적으로 PLA-RTIL 용액을 에탄올을 함유하는 주형에 투입하고 에탄올로 연속적으로 세척하여 마이크로다공성 PLA 막을 제조하였다.

실시예 2: 마이크로다공성 스캐폴드의 특성분석

백금으로 시료를 스퍼터-코팅한 후 주사전자현미경(SEM, Hitachi 3000, Japan)으로 스캐폴드의 마이크로다공성 구조를 확인하였다. 시료의 표면에 형성된 마이크로기공을 확인하고, 액체 질소에서 담금질(quenching)하고 파단(fracturing)하여 스캐폴드의 단면형태를 관찰하였다. SEM 2-D 이미지에 기초하여 총 계수된 350개 기공에 대해 기공 크기를 측정하고 평균하였다. 수은압입법(Mercury intrusion porosimetry, PoreMaster 33, Quantachrome GmbH & Co. KG, Germany)을 이용하여 시료의 마이크로공극율 및 총 표면적을 측정하였다. 각 군에 대해 3개의 다른 시료를 테스트하여 결과를 평균하였다. NaOH/에탄올 처리와 관련된 시료의 친수성 변화는 물 접촉각을 측정(Phoenix, SEO, Korea)하여 확인하였다. 구체적으로 실린지로부터 0.5 μl 탈이온수를 시료 표면에 떨어뜨리고 이미지를 캡쳐하여 물방울의 전진각(advancing angle)을 측정하였다.

도 1a 및 1b는 각각 본 발명에 따른 매크로채널이 형성된 생체고분자 스캐폴드 제조에 사용된 자동 분사 기법을 개략적으로 나타낸 도와 RTIL과의 혼합물을 이용하여 생체고분자 스캐폴드 내에 마이크로다공성 구조를 형성하는 데 사용된 메커니즘을 나타낸 도이다. 매크로채널이 형성된 3-D 스캐폴드를 구축하기 위하여 디클로로메탄에 용해시킨 RTIL-생체고분자 혼합 용액(RTIL/생체고분자=1/3 중량비)을 자동 분사하였으며, 상기 과정 동안 RTIL-생체고분자가 고체화할 때 발생하는 두 가지 상의 분리로 인해 형성되는 스캐폴드 내부에 복연속성 상호연결된 네트워크가 형성되었다. RTIL 상을 에탄올 용액에서 선택적으로 용해시켜 생체고분자 스캐폴드 내에 열린-채널이 형성된 마이크로다공성 구조를 남겼다. 이와 같이 형성된 마이크로다공성 채널은 약물 분자 봉입을 위한 확장된 표면적 및 공간을 제공하는 한편, 매크로다공성 구조는 세포 지지 및 조직 공학을 위한 3-D 골격(scaffolding)으로서의 역할을 할 수 있다.

RTIL 공급원으로는 OTf(triflate), Cl, BF₄ 또는 SbF₆을 상대 음이온 파트로 함유하는 [bmim]-기반 물질을 이용하였다. 상기 OTf 및 Cl은 친수성인 반면, BF₄ 및 SbF₆은 고도의 소수성 이온이다. 따라서, 사용한 음이온의 종류에 따라, 혼합 용애그이 성질이 변화하며, 그 결과로서 일어나는 상 분리 및 마이크로기공 구조의 형성이 현저하게 변화하였다. 또한, 초음파 처리하여 균질화한 PLA-RTIL 혼합 용액을 준비하고, 빙냉 조건에서 자동 분사하되 슬러리를 고온으로 유지하였다. 이는 공정 조건을 최적화함으로써 마이크로기공 형성을 가능하게 할 수 있음을 나타내는 것이다. 본 발명자들은 SEM 이미지를 이용하여 마이크로기공 구조 형성에 있어서 이러한 공정 변수의 효과를 확인하였다.

마이크로다공성 구조가 형성된 PLA 스캐폴드의 SEM 이미지를 도 2에 나타내었다. 제조된 RTIL(OTf)-지원형(assisted) PLA 스캐폴드의 이미지는 전체 스캐폴드를 통해 균일하게 분포된 많은 마이크로기공이 형성되었음을 명확히 나타내었으며(도 2a 및 2b), 이는 종래 RTIL을 사용하지 않는 자동 분사된 PLA 스캐폴드와는 대조적이다(도 2c 및 2d). 마이크로기공은 상대적으로 균일한 크기(수 마이크로미터 직경)로 형성되었다. 상기 마이크로다공성 구조의 연속적인 형성은 RTIL-PLA 혼합물을 초음파 처리하여 균질화함으로써 달성될 수 있다. 이때, 열자켓(thermojacket)을 이용하여 실린지 내부의 온도를 50℃로 유지하였으며, 이후 슬러리를 빙냉(-4℃)의 수조에 분사하였다. 혼합 용액을 초음파 처리하지 않거나(도 2e), 증가된 온도로 유지되지 않는(도 2f) 조건에 있어서는 이와 같은 균일한 마이크로다공성 구조의 형성이 불가능하였다. 이는 최종 산물을 얻기까지 과정의 온도 조절뿐만 아니라 초음파 처리에 의한 균질화가 필수적인 역할을 함을 나타내는 것이다. OTf를 사용하는 대신에 친수성 음이온 Cl을 함유하는 RTIL을 적용했을 때에는 유사한 마이크로다공성 구조가 형성되었다(도 2g 및 2f). 그러나, 소수성 음이온 예컨대, SbF₆(도 2i 및 2j) 또는 BF₄(도 2k 및 도 2l)을 함유하는 RTIL을 사용한 경우 OTf 또는 Cl 등의 친수성 음이온 함유 RTIL을 사용한 경우와 같은 고도의 마이크로다공성 구조를 형성할 수 없었다. 이는 RTIL에서 음이온성 분자의 성질(친수성 또는 소수성)이 또한 스캐폴드 내의 마이크로기공 형성에 중요한 역할을 가짐을 나타내는 것이다.

RTIL(Cl)-지원형 스캐폴드는 다소 확장된 마이크로기공을 나타내는 한편, RTIL(SbF₆)- 및 RTIL(BF₄)-지원형 스캐폴드에서는 마이크로기공이 거의 형성되지 않는 것으로 확인되었다. 소수성 음이온의 경우, PLA와의 상분리 과정이 발생하지 않으며, 따라서 복연속적 네트워크 및 기공 채널 형성이 불가능하였다. RTIL(Cl)의 융점/빙점은 65℃로 RTIL(OTf)에 대한 값인 ~100℃보다 더 낮으므로, -4℃의 에탄올에 분사시 동결되는 구동력(driving force)는 RTIL(OTf)가 RTIL(Cl)에 비해 더 높다(OTf에 대해 104℃ vs. Cl에 대해 69℃). 따라서, 연속적인 RTIL 마이크로채널 형성을 위한 보다 작지만 보다 풍부한 핵을 제공할 수 있었다. 액체 질소에 담금질하고 파단하여 채취한 시료에서 관찰되는 바와 같이, RTIL(OTf)-지원형 PLA 마이크로다공성 스캐폴드의 단면 형태는, 스캐폴드를 통해 채널이 형성된 RTIL-지원형 마이크로기공 형성을 뒷받침하는, 균일하게 분포된 마이크로기공의 존재를 나타내었다(도 2m 및 2n). 제한적인 공정 도구로 인해 -4℃의 빙점을 사용하였음에도 불구하고, 온도를 낮추는 것이 마이크로기공 크기를 추가로 감소(수 마이크로미터 미만 및 가능하게는 서브마이크론 범위)시킬 수 있을 것으로 유추된다. 획득한 마이크로다공성 스캐폴드를 기공 크기, 공극율 및 특이적인 표면적에 대해 추가로 특성분석하였다. RTIL(OTf)를 사용 또는 비사용여 제조한 스캐폴드를 대표적으로 비교하였다. 공극율은 각각 69.8±5.3%(RTIL 사용) 및 11.2±2.1%(RTIL 비사용)였으며, 특이적인 표면적은 각각 0.132±0.03 cm²/g(RTIL 사용) 및 0.018±0.01 cm²/g(RTIL 비사용)으로, RTil(OTf) 사용시 현저히 더 높은 값(공극율에서 약 6배 및 표면적에서 약 7배)을 나타내었다. 평균 기공 크기는 2.43±2.1 μm로 측정되었다.

PLA 스캐폴드의 고도의 마이크로다공성 구조 및 표면 소수성으로 인해, 스캐폴드는 증류수에 잠기지 않고 부유하였다. 이러한 특성은 약물 봉입 및 조직공학을 위한 세포 배양 등의 생물의학적 적용을 현저히 제한한다. 따라서, 염기성 용액을 이용하여 마이크로다공성 PLA 스캐폴드를 표면처리하여 친수성을 향상시켰다. 구체적으로 마이크로다공성 PLA 스캐폴드를 NaOH/에탄올 용액(1:1)에 15분 동안 담그고 서서히 교반하였다. NaOH와 함께 에탄올을 사용함으로써 용액이 마이크로다공성 채널 내로 침투할 수 있도록 하여 균일하게 표면 처리될 수 있도록 하였다. 이로부터 획득한 이미지는 처리전 마이크로다공성 PLA 스캐폴드는 물에 부유하였으나, NaOH/에탄올 처리 후 고도의 마이크로다공성 및 향상된 표면의 친수성으로 인해 완전히 잠기고 침전되어 가라앉게 되었다(도 3a). 표면 처리된 스캐폴드의 SEM 이미지는 마이크로다공성 구조가 유지됨을 나타내었다(도 3b). 이와 같이 마이크로다공성 구조를 유지하는 동시에 우수한 친수성을 나타낼 수 있도록 처리하는 조건(0.1 M NaOH/에탄올 1:1 혼합물로 15분 동안 처리)을 최적화하였다. 과도한 조건 예컨대, 1 M NaOH 용액으로 1시간 동안 처리하였을 때, 마이크로기공은 막히거나 갈라지는 등 심하게 손상되었다(도 3c, 화살표). 상기 처리에 의한 표면의 친수성을 확인하기 위하여 접촉각을 측정하였다. 이를 위하여, 막 형태의 마이크로다공성 또는 비-마이크로다공성 PLA를 준비하여 시험하였다(도 3d의 삽입도로 나타냄, 마이크로기공의 존재로 인해 색상의 차이가 있음). 15분까지 표면 처리 시간에 대해 접촉각을 기록하였다(도 3d). 두 가지 시료군 모두에서 염기성 용액 처리 후 접촉각의 현저한 감소가 나타났으며, 그 효과는 마이크로다공성 PLA에 대해 더 크게 나타났다. 구체적으로 비-마이크로다공성 PLA에서 15분 동안 처리 후 60°로부터 35°까지 변화한 반면, 마이크로다공성 PLA에서는 동일한 시간 동안 처리 후 58°로부터 15°까지 변화하였다.

이와 같은 결과에 기초하여, 친수성 음이온(특히, OTf 및 Cl) 함유 RTIL를 PLA 스캐폴드를 통해 마이크로다공성 채널을 형성하였으며, 이어서 적절한 조건 하에 NaOH/에탄올로 처리함으로써 표면 친수성을 추가적으로 향상시켰다. 이에 따라 제조된 스캐폴드는 완전한 물 투과성을 갖게 되었으므로, 약물 봉입 및 세포 배양과 같은 생물의학적 적용이 가능하게 되었다.

실시예 3: 마이크로다공성 스캐폴드의 생체적합성 실험

상기 실시예 1로부터 제조한 마이크로다공성 스캐폴드의 생체적합성을 시험간 내 세포 및 생체 내 조직 반응을 통해 확인하였다. 먼저, 막 형태로 제조한 시료의 표면에 대한 세포부착을 확인하였다. 상기 제조된 막은 마이크로다공성 또는 비-마이크로다공성 막으로 모두 염기성 용액으로 처리하였다. 생체적합성 테스트에 앞서 14 mm 직경의 시료를 24-웰 플레이트에 두고 70% 에탄올로 세척하여 건조하였다. 골아전구세포 MC3T3-E1 세포를 2×10⁴ 세포/ml 밀도로 각 시료에 분주하여 10% FBS 및 항생제(100 U/ml 페니실린 및 100 mg/ml 스트렙토마이신)를 첨가한 α-MEM을 포함하는 성장배지에 37℃의 5% CO₂를 포함하는 습식 인큐베이터에서 배양하였다. 24시간 배양 후, 세포 계수 어세이 키트(cell counting assay kit; CCK-8, Dojindo Molucular Technologies)를 사용하여 스캐폴드에 부착된 세포의 수를 확인하였다. CCK-8은 생존 세포 수에 직접 비례하여 오렌지색 포르마잔 염료를 생성하는 WST-8 반응에 기초한다. 구체적으로, 배지를 200 μl 무혈청 배지로 교환하고, 20 μl CCK-8 용액을 첨가하였다. 2시간 동안 반응하도록 두었다가 UV-vis 분광광도계를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 15 kV의 가속전압에서 구동하는 SEM으로 세포 부착 형태를 관찰하였다. 세포-배양된 시료를 글루타르알데하이드(2.5%)로 10분 동안 고정하고, 단계별 농도의 에탄올(75%, 90%, 95% 및 100%)로 각 7분 동안 처리하여 탈수화한 후, 헥사메틸디실라잔으로 10분 동안 처리하고 백금으로 스퍼터 코팅하였다.

나아가, 랫트 피하조직에서 마이크로다공성 스캐폴드의 생체 내 조직 반응을 확인하였다. 동물 수술은 단국대학교 실험동물윤리위원회(the Animal Care and Use Committee of Dankook University, Republic of Korea)의 지침에 따라 수행하였다. 2마리의 12주령 수컷 Sprague-Dawley 랫트(Daehan Biolink Co. Ltd., Korea)에 케타민(80 mg/kg)/크실라진(10 mg/kg)을 근육 내 주사하여 마취시키고, 등쪽 피부를 면도하고 포비돈 아이오딘(povidone iodine)과 70% 에탄올로 소독하였다. #10 면도날의 Bard-Parker 메스를 사용하여 2 cm 길이로 피부를 절개하고 각 랫트의 척추로부터 횡방향으로 메젬바움가위(baby Metzenbaum scissors)로 비절개박리(blunt dissection)하여 등에 4개의 작은 피하주머니(척추 양측에 각 2개씩)를 만들었다. 마이크로다공성 또는 비-마이크로다공성인 4개의 스캐폴드(6 mm×6 mm×4 mm)를 서로 접촉하지 않도록 randomized scheme에 따라 이식하였다. 절개는 4-0 단섬유 봉합사(monofilament suture; Prolene, Ethicon, Germany)로 봉합하였다. 수술 과정 동안, 랫트를 따뜻하게 유지하였으며, 마취로부터 회복될 때까지 관찰하였다. 회복 후, 실험동물을 상대습도(30-70%) 및 온도(20-24℃)가 조절된 환경에서 12시간 명암 순환(light/dark cycle; 오전 8시부터 오후 8시까지 조명)으로 유지하였다. 랫트에 정상식이와 물을 무제한(ad libitum) 허용하였다.

수술 후 4주에 실험동물을 치사시켜 주위 조직과 함께 시료를 회수하였다. 조직학적 분석을 위해, 조직 구조물을 랫트로부터 하나의 덩어리(single mass)로 회수하였다. 시편을 즉시 10% 중성 포르말린(buffered neutralized formalin)에 담그어 24시간 동안 처리하고 단계별 농도의 에탄올(70%, 80%, 90%, 95% 및 100%)로 탈수시켰다. 이어서, 시료를 이등분하고 파라핀에 포매시킨 후 마이크로톰(RM2245, Leica, Germany)을 이용하여 ~5 μm 두께의 일련의 절편으로 절단하고 현미경 슬라이드에 위치시켰다. 조직 절편을 포함하는 슬라이드를 탈파라핀화하고(deparaffinize) 자일린과 일련의 에탄올을 통해 수화하고 헤마톡실린과 에오신(hematoxylin and eosin; H&E)으로 염색하였다. 상기 염색한 슬라이드를 광학현미경(IX71, Olympus, Japan)으로 가시화하고 디지털 영상을 획득하였다. Scion Image(v. Alpha 4.0.3.2 for Windows, Scion Corp., USA)로 스캐폴드 골격 내로 침범한 세포의 수를 결정하여 정량분석하였다. 조직학적 연구를 위하여, 단편을 절단하여 스캐폴드의 중앙 단면으로부터 고배율로 분석하였다. 데이터는 4개 다른 스캐폴드로부터 평균하였다.

랫트 피하 자리에서의 조직 반응뿐만 아니라 시험관 내 초기 세포 반응을 관찰하여 마이크로다공성 스캐폴드의 생체적합성을 확인하였다. 먼저, 세포 부착 및 확산(spreading) 어세이를 수행하였다. 이를 위하여, 막 형태의 마이크로다공성 또는 비-마이크로다공성 PLA를 준비하였다. 골아전구세포(preosteoblastic) MC3T3-E1 세포를 각 시료군에 분주하고 24시간 동안 배양하여 세포-부착 형태를 SEM으로 관찰하였다(도 4a 및 4b). 이미지는 광범위한(extensive) 세포골격성 과정(cytoskeletal process) 및 밀접한 부착 접촉(intimate adhesion contacts)과 함께 마이크로다공성 표면에 대한 세포의 우수한 접착성을 나타내었다. 이어서 세포 부착수준을 CCK 어세이로 측정하였다(도 4c). 그 결과, 비-마이크로다공성 기재 상에서 보다 마이크로다공성 기재 상에서 현저히 더 높은 세포 부착 수준을 나타내었다. 이는 마이크로다공성 구조가 형성된 표면이 세포 고정에 불리한 영향을 미치지 않았으며, 오히려 마이크로다공성 표면에 의해 표면적이 증가함에 따라 초기 세포 인식을 위한 더 많은 자리를 제공할 수 있으므로 더 나은 세포 부착을 가능하게 함을 나타내는 것이다. 이는 초기 세포 반응 및 이어지는 증식 및 조직 특이적 분화를 촉진하는 것을 목적으로 하는 세포 배양 기재로서 마이크로다공성 표면의 사용을 고려하는 경우 마이크로다공성 기재 표면에 대한 호의적인 세포 부착 조건을 제공함을 확인하였다.

다음으로, 랫트 피하 조직에서 마이크로다공성 스캐폴드의 생체 내 조직적합성을 확인하였다. 마이크로다공성 또는 비-마이크로다공성 구조의 PLA 스캐폴드를 랫트에 이식하고 4주 후에 조직 시료를 채취하여 H&E 염색하여 조직학적 분석을 수행하였다. 4주 연구 기간을 통해, 실험동물은 부정적인 조직 반응이나 물질 독성의 징후 없이 우수한 치유 반응을 나타내었으며, 회수된 조직에서 인지할만한 육안으로 보이는 내부 염증의 징후도 없었다. 현미경 관찰은 2개의 PLA 스캐폴드 모두에서, 만약 있다면, 약간의 염증세포가 존재함을 나타내었다. 또한, 많은 섬유아세포가 두 가지 형태의 스캐폴드 모두의 매크로채널을 통해 관찰되었으며(비-마이크로다공성(도 4d) 및 마이크로다공성(도 4e)), 신규한 혈관 형성의 상당한 징후(화살표)가 확인되었다. 세포는 스캐폴드("S"로 표기)의 골격 상에 잘 정렬되었으며, 견고하게 결합되었다. 스캐폴드 골격 주변의 대표적인 이미지는 물질-조직 계면에서 조직 반응이 나타남을 보여주었다. 많은 수의 섬유아세포가 비-마이크로다공성 스캐폴드의 주변에 얇은 주변을 둘러싸는(circumferential) 세포층을 형성하며 존재하는 것으로 관찰되었으며(도 4f), 마이크로다공성 스캐폴드에서는 다수의 세포가 스캐폴드 골격 내에서 관찰되었을 뿐만 아니라 스캐폴드 주변에서 주변을 둘러싸는 세포띠도 보다 확연히 나타났다(도 4g). 고배율로 확보한 대표적인 이미지는 비-마이크로다공성(도 4h) 및 마이크로다공성(도 4i) 스캐폴드 간의 이러한 차이를 명확히 나타내었다. 마이크로다공성 스캐폴드에 있어서 많은 세포가 스캐폴드의 마이크로 기공 채널을 통해 실질적으로 스캐폴드 골격 내로 침투하는 것으로 확인되었다. 스캐폴드에서 옅은 분홍색 모자이크 이미지는 마이크로기공 채널 내로 H&E 염색의 투과를 반영하였다. 나아가 본 발명자들은 각 골격의 2-D 단면적 내에서 관찰되는 세포 수를 추가로 정량분석하였다. 마이크로다공성 스캐폴드는 측정된 각 영역(70690 μm²) 내에 평균 14.3±8.7 세포를 함유하였으나, 비-마이크로다공성 스캐폴드에서는 전혀 세포가 관찰되지 않았다.

마이크로다공성 스캐폴드의 골격 내에서 세포가 관찰되는 것은, 상기 형성된 마이크로기공의 크기가 단지 수 마이크로미터로 세포가 이동하기에는 상대적으로 w작은 것으로 관찰되었음을 고려할 때, 매우 흥미롭다. 따라서, 몇몇 더 큰 기공들(＞5 μm)에 의해 제공되는 세포 이동을 개시할 수 있는 채널 및/또는 이식기간 동안의 가수분해성/효소성 분해로 인한 기공 확장 또는 굵어짐이 세포의 침투를 촉진할 수 있다. 스캐폴드 내로의 세포 이동은 세포 침윤에 의해 천연의 조직 구조물과 스캐폴드의 치환을 궁극적으로 가속화하는데 이점을 가질 수 있다. 생체역학적 관점에 있어서, 세포 침윤된 그리고 세포 결합된 생체물질 구조물은 차례로 재생 과정에 영향을 주는 적용된 봉입물 및 기계적 작용을 지속하는데 더욱 효과적이며 보다 나은 조직 유사 구조(tissue-mimicking structure) 형성을 유도할 수 있다. 상기 생체적합성 테스트를 통해, 마이크로다공성 구조가 형성된 스캐폴드는 바람직한 세포 및 조직 반응을 나타내므로 궁극적으로 조직 공학의 목적에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

실시예 4: Na - 앰피실린을 이용한 마이크로다공성 스캐폴드의 약물 봉입 및 방출 실험

먼저 친수성 약물을 선택하여 약물 봉입 및 방출에 대한 스캐폴드 상의 마이크로포러스 구조의 효과를 확인하였다. 모델 약물로는 Na-앰피실린(Sigma-Aldrich)을 사용하였다. 구체적으로 각각의 마이크로다공성 또는 비-마이크로다공성 스캐폴드 시료(6 mm×6 mm×4 mm)를 100 μg 앰피실린을 함유한 1 ml 인산완충염용액(PBS)에 담그고 다양한 시간(1시간, 3시간, 6시간 및 9시간) 동안 150 rpm(KOMA orbital shaker)으로 수평으로 교반하면서 20℃에 두었다. 각 시점에 약물 용액을 채취하여 UV-vis 분광광도계(Libra S22, Biochrom Ltd.)를 이용하여 285 nm 파장에서 분석하였다. 표준 곡선을 참조하여 측정된 광학밀도를 잔존하는 앰피실린의 양으로 환산하여 그로부터 스캐폴드에 담지된 앰피실린의 양을 계산하였다.

이어서, PBS에서 스캐폴드로부터 Na-앰피실린의 방출 연구를 진행하였다. 약물을 봉입한 스캐폴드(마이크로다공성 또는 비-마이크로다공성)를 1 ml PBS에 담그고 회전교반기(orbital shaker)를 이용하여 150 rpm에서 수평으로 서서히 교반하면서 37℃에서 인큐베이션하였다. 각각 미리 정해진 시점(1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 1일, 3일, 7일, 14일, 21일 및 28일)에 용액을 회수하여 UV-vis 분광광도계를 이용하여 285 nm 파장에서 광학밀도를 측정함으로써 용액 내로 방출된 Na-앰피실린을 정량하였다. 각 시점에 배지를 신선한 배지로 완전히 교환하였고 포화점까지 약물 방출 실험을 계속하였다.

앰피실린은 생물의학적 분야에 널리 사용되는 잘 알려진 항생제이다. 앰피실린은 친수성이므로 PLA 스캐폴드의 마이크로기공 채널로 잘 투과될 수 있을 것으로 예상된다. 이에 본 발명잗르은 마이크로다공성 또는 비-마이크로다공성 스캐폴드 상에서 앰피실린 봉입 연구를 수행하였다. PBS에 용해시킨 앰피실린 용액(100 μg/ml)을 각 스캐폴드 시료에 적용하고, 다양한 시점에서 약물 봉입을 측정하여 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타난 바와 같이, 비-마이크로다공성 스캐폴드에 비해 마이크로다공성 스캐폴드에서 현저히 많은 양의 앰피실린이 봉입되었다. 포화량은 마이크로다공성 스캐폴드에서 ~17% 수준이었으나, 비-마이크로다공성 스캐폴드에서는 단지 ~3%로, 그 차이는 약 6배에 달하였다. 동일한 염기성 용액으로 처리한 후 각 스캐폴드에 대한 표면 화학은 동일하므로, 이러한 결과는 비-마이크로다공성 PLA에 비해 마이크로다공성 PLA의 증가된 표면적에 온전히 기인함을 나타내는 것이다.

봉입 연구에 이어, 각 스캐폴드로부터 앰피실린의 방출 프로파일을 결정하였다. 각 시료를 37℃, 중성(pH 7.0) 조건에서 PBS에 인큐베이션하고 28일까지 정해진 시점에서 방출을 모니터하였다. 앰피실린의 방출을 누적하여 플롯하여 도 6a에 나타내었다. 이는 마이크로다공성 PLA로부터 대부분의 약물이 방출되었으나, 비-마이크로다공성 PLA로부터는 제한적인 양만이 방출됨을 나타내었다. 또한 삽입도는 특히 초기 방출 기간(최초 48시간) 사이의 큰 차이를 나타내었다. 누적 프로파일은 봉입된 약물의 초기 양(도 6b)에 대해 정상화하였다. 비-마이크로다공성 스캐폴드의 경우 앰피실린은 1일 이내에 거의 완전히 방출되었다. 그러나, 마이크로다공성 스캐폴드의 경우, 초기 봉입된 앰피실린의 30%만이 최초 1일 동안 방출되었으며 이후 6일 동안 55% 추가 방출되었고 28일까지 현저히 감소된 방출율로 지속적으로 방출되었다. 따라서, 방출 패턴은 약 7일에서 전환되는 2단계로 구성되는 것으로 사료된다. 초기 단계는 마이크로다공성 채널을 통해 PLA 표면에 느슨하게 결합된 앰피실린 분자(앰피실린 분자의 주된 분획, ~85%)의 방출을 반영하며, 후기 단계는 PLA 표면에 보다 견고하게 부착된 소량의 앰피실린 분자(총 봉입된 앰피실린 분자의 ~15%)의 방출을 반영하였다. 앰피실린의 봉입 및 방출 결과는 대량의 약물분자를 봉입하고 추후 이들 분자를 수주 내지는 한달에 걸쳐 방출하는데 있어서 마이크로기공의 뛰어난 효과를 잘 나타내었다. 나아가, 초기 및 후기 약물 방출이 PLA 표면과 약물 분자의 상호작용에 의한 것으로 유추되는 바, 추가적인 표면 개질 예컨대, 친수성 및 소수성 조절, 공유결합 형성, 또는 보다 강한 상호작용 가능한 물질로 코팅 등의 방법으로 스캐폴드 표면과 약물 분자와의 상호작용을 조절함으로써 지연된 방출을 조절할 수 있을 것이다.

실시예 5: Cyt C를 이용한 마이크로다공성 스캐폴드의 단백질 봉입 및 방출 실험

다음으로 본 발명에 따른 마이크로다공성 스캐폴드의 단백질 약물에 대한 봉입 및 방출을 확인하였다. 단백질 약물로는 대표적인 생물학적 단백질인 시토크롬 C(cytochrome C; Cyt C, Sigma-Aldrich)를 선택하였다. Cyt C의 분자량 및 전하 특성은 염기성 섬유 아세포 성장인자(basic fibroblast growth factors; bFGF)를 포함한 많은 성장인자들과 유사한 것으로 알려져 있다. 약물 봉입 실험을 위하여 PBS 용액에 다양한 농도(25, 50, 100, 200, 400 및 800 μg/ml)로 Cyt C를 준비하였다. 각 스캐폴드 시료를 준비한 Cyt C 용액에 담그고 다양한 시간(1, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 및 24시간) 동안 150 rpm에서 서서히 교반하면서 20℃에 두었다. 각 시점에 Cyt C 용액을 채취하여 UV-vis 분광광도계로 409 nm에서 광학밀도를 측정하였다. 상기 측정된 광학밀도 값을 용액에 잔존하는 Cyt C 값으로 환산하고, 이로부터 스캐폴드에 봉입된 Cyt C의 양을 계산하였다. 다양한 Cyt C 농도에서 기록된 봉입량을 기초로, 스캐폴드의 Cyt C 봉입 용량을 다음의 질량균형방정식(mass balance equation)에 따라 도시하였다:

,

여기서, q _e 는 스캐폴드 시료에 봉입된 Cyt C의 용량(μg/ml), C ₀ 및 C _e 는 각각 Cyt C의 초기 및 평형 농도(μg/ml), V는 용액의 부피(ml) 및 W는 사용한 스캐폴드의 질량(mg)이다. q _e 대 C _e 곡선을 플롯한 후, 하기 수식에 따라 곡선-맞춤을 위해 변형된 랭뮤어 등온 모델(modified Langmuir isotherm model)을 적용하였다:

,

이로부터 미지변수 K(반응속도상수; kinetic constant)를 결정할 수 있다.

대표적인 시료를 사용하여 스캐폴드로부터 Cyt C 방출 테스트를 수행하였다. 이때, 100 mg Cyt C를 초기에 사용하였다. Cyt C를 봉입한 각각의 스캐폴드 시료를 1 ml PBS에 담그고 150 rpm으로 서서히 교반하면서 37℃에서 인큐베이션하였다. 각각 정해진 시점(1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 1일, 3일, 7일, 14일, 21일 및 28일)에 용액을 회수하여 UV-vis 분광광도계를 이용하여 409 nm 파장에서 광학밀도를 측정함으로써 용액 내로 방출된 Cyt C를 정량하였다. 각 시점에 배지를 신선한 배지로 완전히 교환하였다.

본 발명자들은 약물 봉입 및 전달에 있어서 마이크로다공성 스캐폴드의 성능을 확인하기 위한 단백질 분자로서 다른 생물학적 단백질들 주로 bFGF 등의 성장인자와 유사한 물리화학적 성질 예컨대, 분자 크기 및 전하 특성을 갖는 Cyt C를 선택하였다. 마이크로다공성 및 비-마이크로다공성 PLA 스캐폴드에 대한 Cyt C 봉입량을 측정하여 도 7에 나타내었다. 각각의 스캐폴드 시료를 PBS에 용해시킨 Cyt C 용액(100 μg/ml)에 담그고, 단백질 봉입량을 봉입 시간에 대한 함수로 도시하였다. 그 결과, 비-마이크로다공성 스캐폴드에 비해 마이크로다공성 스캐폴드에 대한 Cyt C 봉입이 현저히 증가되었다. 포화량은 마이크로다공성 스캐폴드에서 ~38%였으나, 비-마이크로다공성 스캐폴드에서는 단지 ~5%였다. Cyt C에 대해 관찰된 봉입 곡선은 앰피실린에 대한 것과 매우 유사하였다. 그러나, 총 봉입된 양은 앰피실린(~17%)에 비해 Cyt C(~38%)가 더 높았다. 이는 마이크로다공성 구조가 형성된 PLA 스캐폴드 내로 약물의 침투에 있어서 앰피실린에 비해 Cyt C가 선호됨을 나타내는 것이다. 반면, 비-마이크로다공성 PLA에 대한 Cyt C 및 앰피실린 봉입을 비교한 결과는 두 약물 모두에서 비슷한 값을 나타냄을 확인하였다(앰피실린에 대해 ~3% 및 Cyt C에 대해 ~5%). Cyt C에 대한 봉입 데이터는 다량의 단백질 분자를 포획함에 있어서 마이크로기공의 잠재적인 효과를 나타내며(비-마이크로다공성 구조의 스캐폴드에 비해 6 내지 8배 향상), 이는 치료적 단백질을 봉입시킨 조직 공학 스캐폴드로서 활용 가능성을 나타내는 것이다. 마이크로다공성으로 인한 표면적의 증가(비-마이크로다공성 스캐폴드에 비해 마이크로다공성 스캐폴드에서 ~7배 향상)가 단백질 봉입량 증가의 주된 요인인 것으로 사료된다.

또한 추가적으로 초기 Cyt C 농도를 달리하면서 마이크로다공성 스캐폴드에 대한 단백질 봉입 프로파일을 확인하였다. 마이크로다공성 및 비-마이크로다공성 스캐폴드 모두에 대해 Cyt C의 봉입량을 각기 다른 초기 Cyt C 농도에서 봉입 시간에 따라 기록하고 그 결과를 각각 도 8a 및 8b에 나타내었다. 초기 Cyt C 농도가 증가함에 따라, 마이크로다공성 PLA의 봉입량은 현저히 증가하였다. 예컨대, 25 μg 초기 농도에서 ~10 μg 포화 봉입량으로부터, 200 μg 초기 농도에서 ~45 μg 포화 봉입량으로 총 봉입되는 약물의 최대량이 증가하였다. 비-마이크로다공성 PLA에 대해서도, 초기 농도가 증가함에 따라 Cyt C 봉입량이 증가하였으나, 그 차이는 미미하였다. 봉입용량거동(loading capacity behavior)의 보다 나은 평가를 위하여, Cyt C의 초기 봉입농도의 함수로서 봉입 용량을 나타내는 봉입 등온선을 플롯하여 도 8c에 나타내었다. 두 가지 스캐폴드에 대해 Cyt C의 초기 농도가 증가함에 따라, 물질 표면에 대한 단백질 분자의 흡착 등온선에서 전형적으로 관찰되는 바와 같이, 근사 플래토 효과(near plateau effect)를 나타내는 곡선 패턴으로 봉입 용량이 증가하였다. 모든 Cyt C 농도에서 마이크로다공성 및 비-마이크로다공성 스캐폴드 간의 봉입 용량의 차이는 현저하였으며, 그 차이는 초기 Cyt C 농도가 증가함에 따라 보다 뚜렷해졌다. 본 발명자들은 그래프의 곡선-최적화를 위하여 약간의 수정을 거친 공지의 랭뮤어 등온선 모델을 적용하였다. 실험적 등온선 곡선은 모델에 잘 맞았으며, 속도상수(kinetic constant, K)는 마이크로다공성 및 비-마이크로다공성 스캐폴드에 대해 각각 5.8×10^-3(R² = 0.98) and 9.1×10^-3(R² = 0.99)으로 결정되었다.

다음으로, 본 발명자들은 마이크로다공성 스캐폴드로부터 Cyt C 방출 패턴을 연구하였다. 초기 봉입 농도 100 μg으로 준비한 스캐폴드 시료를 사용하여 28일까지의 기간 동안 마이크로다공성 또는 비-마이크로다공성 PLA로부터 Cyt C의 방출 연구를 수행하였다. 먼저 Cyt C의 누적 방출을 기록하여 도 9a에 나타내었다. 또한, 이를 초기 Cyt C 봉입 농도에 대해 정상화하였을 때 백분율 데이터로 전환하여 도 9b에 나타내었다. 비-마이크로다공성 PLA로부터의 Cyt C 방출은 매우 빨랐으며, 최초 1일 동안 ~73% 방출을, 이후 2일에 걸쳐 거의 완전한 방출(~93%)을 나타내었다. 그러나, 마이크로다공성 PLA로부터 Cyt C 방출은 28일까지 지속되었다. 마이크로다공성 스캐폴드로부터 Cyt C의 초기 방출은 최초 1일 동안 ~28%로 상대적으로 빨랐으나, 이어지는 방출 패턴은 고도로 지속적이어서 28일까지 0차에 가까운 속도를 나타내었다. 따라서, Cyt C 방출 프로파일은 2-단계 패턴을 나타내는 것으로 확인되었다. 흥미롭게도, 제1단계 패턴은 빠르며 포물선 역학(초기 기간에 대해 나타난 삽입 이미지)을 나타낸 반면, 제2단계는 선형에 가까운 패턴을 나타내었다. 앰피실린에 대해 확인된 바와 같이, Cyt C의 초기 빠른 방출은 PLA 표면에 느슨하게 흡착된 Cyt C 분자에 기인하는 것으로 판단되었다(28%로 관찰됨). 앰피실린의 경우, 이어지는 방출(상기 제1단계 이후)은 선형적이지 않았으나 점진적이었고, 제2단계 방출이 선형 프로파일로 보다 급하게 전환되는, Cyt C에 대해 관찰된 것에 비해서 보다 빨랐다. 이와 같이, 마이크로기공 채널의 표면에 흡착된 Cyt C 분자들은 상당히 지속적으로 방출되는 것으로 확인되었다. Cyt C 분자는 고도로 양으로 하전되었으므로, 반대로 하전된 예컨대, 카르복실화된, 황산화된 또는 인산화된 분자 또는 표면과 이온성 상호작용을 형성할 수 있다. 따라서, Cyt C 분자는 염기성 용액으로 처리하여 표면에 다수의 히드록시기 및 카르복시기가 존재하는 표면 개질된 PLA와 우수한 상호작용을 나타낼 수 있으므로 보다 지속적인 방출이 가능하였다. 이와 같이, Cyt C의 방출 속도는 염용액 중에서 이온 결합을 통해 나타날 수 있는 Cyt C 분자의 해리에 의해 영향을 받을 수 있다. Cyt C의 해리속도와 더불어 마이크로기공 채널을 통한 확산 속도 또한 마이크로다공성 스캐폴드로부터 Cyt C의 전체 방출 메커니즘에 영향을 주었다. 따라서, 조밀한 마이크로다공성 스캐폴드의 표면 화학이 동일하게 조절되었다 할지라도 Cyt C 분자의 방출 프로파일은 큰 차이를 나타내었다. 흡착된 단백질 분자를 완전히 방출하기 위해 요구되는 물 침투(water ingress), 물-단백질 상호작용 및 단백질 해리를 포함한 일련의 과정 및 단백질 배출(protein egress)은 마이크로기공 채널을 통해서만 발생하며, 따라서 이와 같은 경우 단백질 방출 이벤트는 자유롭게 그리고 빠르게 일어나는 것으로 볼 수 없으며, 이것이 단백질이 비-마이크로다공성의 조밀한 표면 상에 흡착되는 개방 조건과 다른 점이었다. 조합하면, 마이크로다공성 스캐폴드의 증가된 표면적은 단백질 봉입량 향상에 대한 주된 요인이며, 형성된 마이크로다공성 채널은 지속적 방출 프로파일에 중요한 역할을 가짐을 나타내는 것이다.

Cyt C 봉입 및 방출 결과는 발달된 마이크로다공성 PLA 스캐폴드가 Cyt C 단백질 분자를 다량 봉입하고 추후 한달까지의 장기간 동안 근사 0차 속도로 지속적인 속도로 방출하는데 효율적임을 보여주었다. 이는 조직 공학 스캐폴드로서 치료적 효과를 달성하기 위하여 Cyt C와 유사한 물리화학적 성질을 갖는 표적 성장인자의 이용 가능성을 뒷받침하는 것이다.

본 발명자들은 생체적합성 고분자의 예시적인 물질로서 소수성을 나타내는 PGA(polyglycolic acid), PCL(polycaprolactone) 및 이들의 공중합체와 같은 분해성 생체고분자를 대표하여 PLA를 사용하였으며, 이는 친수성 음이온을 함유하는 RTIL과 복연속적 상을 형성할 수 있으므로 마이크로다공성 스캐폴드의 제조에 적합하였다. 도 10에는 마이크로기공 형성용 상대-상(counter-phase)으로서 RTIL(OTf)와 함께 스캐폴드 상으로서 PCL을 사용한 다른 연구 결과를 나타내었다. RTIL(OTf)를 사용하여 자동 분사하여 매크로채널 형성된 PCL 스캐폴드는 표면을 통해 마이크로다공성을 갖는 것을 확인하였다(도 10a 및 10b). 뿐만 아니라, 단면 이미지에서 스캐폴드의 내부 골격 내에도 마이크로기공이 형성되었음을 확인하였다(도 10c 및 10d). 이는 RTIL을 사용하지 않고 제조한 PCL 스캐폴드와는 대조적인 결과였다(도 10e 및 10f). 이에 따라, 이와 같은 형태적 특징을 마이크로다공성 PLA 스캐폴드에서 확인되었으며, RTIL-지원형 마이크로기공-형성 방법의 조직 공학을 목적으로 하는 생체고분자 범주에 공통적으로 적용할 수 있음을 확인하였다.

<통계적 분석>

각 실시예에서 측정한 데이터는 평균(mean)± 1 SD로 나타내었다. 일우너배치분산분석(one-way analysis of variance; ANOVA)에 의해 통계적 분석을 수행하였고, P＜0.05에서 통계적 유의성을 판단하였다.

Claims (11)

1. 생분해성 고분자 함유 슬러리를 준비하는 제1단계;
   상기 고분자 함유 슬러리에 상온 이온성 액체(RTIL; room temperature ionic liquid)를 첨가하여 고분자와 상온 이온성 액체의 혼합 용액을 준비하는 제2단계;
   상기 혼합 용액을 50℃ 이상으로 유지한 후 -10℃ 내지 10℃의 용매에 분사하여 온도 차이에 의한 고형화에 의해 스캐폴드를 형성하는 제3단계; 및
   형성된 스캐폴드로부터 상기 상온 이온성 액체를 추출하는 제4단계를 포함하는, 마이크로다공성 구조를 갖는 생분해성 고분자 스캐폴드의 제조방법.
   
2. 제1항에 있어서,
   제1단계는 생분해성 고분자를 유기 용매에 용해시킨 후 균질화하여 수행되는 것인 마이크로다공성 구조를 갖는 생분해성 고분자 스캐폴드의 제조방법.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 생분해성 고분자는 폴리락트산(polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산(polyclycolic acid; PGA), 폴리카프로락톤(polycaprolactone; PCL), 폴리(D,L-락트산-코-글리콜산)(poly(D,L-lactic acid-co-glycolic acid); PLGA), 폴리(L-락타이드-코-D,L-락타이드)(poly(L-lactide-co-D,L-lactide); PLDLLA), 폴리히드록시부티레이트(polyhydroxybutyrate; PHB), 폴리히드록시발러레이트(polyhydroxyvalerate; PHV), 폴리(발레로락톤)(poly(valerolactone); PVL) 및 폴리디옥사논(polydioxanone; PDO 또는 PDS)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 마이크로다공성 구조를 갖는 생분해성 고분자 스캐폴드의 제조방법.
   
4. 제1항에 있어서,
   제2단계로부터 형성된 혼합 용액을 초음파 처리하여 균질화하는 단계를 추가로 포함하는 것인 마이크로다공성 구조를 갖는 생분해성 고분자 스캐폴드의 제조방법.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 상온 이온성 액체는 비치환된 또는 C_{1 -6} 알킬로 치환된 이미다졸 양이온을 함유하는 것인 마이크로다공성 구조를 갖는 생분해성 고분자 스캐폴드의 제조방법.
   
6. 제5항에 있어서,
   상기 이미다졸 양이온은 부틸메틸이미다졸리움(butylmethylimidazolium; bmim) 또는 에틸메틸이미다졸리움(ethylmethylimidazolium; emim)인 것인 마이크로다공성 구조를 갖는 생분해성 고분자 스캐폴드의 제조방법.
   
7. 제1항에 있어서,
   상기 상온 이온성 액체는 상대 음이온으로 친수성 음이온을 함유하는 것인 마이크로다공성 구조를 갖는 생분해성 고분자 스캐폴드의 제조방법.
   
8. 삭제
9. 제1항에 있어서,
   친수성을 향상시키기 위하여 스캐폴드 표면을 개질하는 단계를 추가로 포함하는 것인 마이크로다공성 구조를 갖는 생분해성 고분자 스캐폴드의 제조방법.
   
10. 제9항에 있어서,
    상기 스캐폴드 표면을 개질하는 단계는 스캐폴드를 염기성 용액으로 처리하여 수행되는 것인 마이크로다공성 구조를 갖는 생분해성 고분자 스캐폴드의 제조방법.
    
11. 제1항 내지 제7항, 및 제9항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 마이크로다공성 구조를 갖는 생분해성 고분자 스캐폴드로서,
    상기 스캐폴드는 생분해성 고분자를 매트릭스 수지로 함유하는 고분자 가닥을 2개 이상 구비한 생분해성 고분자 층이 2개 이상 적층된 형태인 고분자 스캐폴드.

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