CN107715174B - 一种含微孔隙和纳米纤维复合结构的仿生组织工程支架及其制备方法 - Google Patents

一种含微孔隙和纳米纤维复合结构的仿生组织工程支架及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含微孔隙和纳米纤维复合结构的仿生组织工程支架及其制备方法。所述具有微孔隙和纳米纤维网络的仿生组织工程支架包括微孔隙和纳米纤维网络结构；所述微孔隙的孔径为20～200μm；所述纳米纤维网络的直径为10～2000nm，长度为1～100μm。本发明组织工程支架充分模拟了天然细胞外基质的结构特征，微孔为细胞长入支架提供了条件，较高的孔隙率利于氧和营养物质在之间内部的渗透和扩散；纳米纤维网络仿生细胞外基质的网络结构，能够促进细胞黏附、生长、增殖、分化和迁移。本发明制备方法很好地解决了现有传统的支架制备工艺的缺点，具有成为新的组织工程支架制备技术的潜力。

Description

一种含微孔隙和纳米纤维复合结构的仿生组织工程支架及其 制备方法
技术领域
本发明涉及一种含微孔隙和纳米纤维复合结构的仿生组织工程支架及其制备方法，属于组织工程和生物制造技术领域。
背景技术
组织工程再生医学(Tissue Engineering and Regenerative Medicine)是一门新兴交叉科学，通过在体外仿生构建具有一定结构与功能的人工组织，来修复、替代病损的组织与器官。目前组织工程产品已经在皮肤、骨/软骨、膀胱、血管、肝脏、神经等领域得到应用，为人类治疗各种组织器官损伤提供了新的可能性。组织工程的经典策略为细胞、支架和生长因子三要素，其中支架通过仿生细胞外基质(ECM)，为细胞提供结构支撑，促进细胞黏附、生长、增殖、分化和迁移，是组织工程的关键因素之一。
对于支架而言，孔隙率是一个重要指标，只有具有合适的微孔尺寸和孔隙率，才能使细胞充分长入支架内部，促进氧和营养物质的扩散。另一方面，天然细胞外基质(ECM)是由包括纤维性糖蛋白(主要是胶原和弹性蛋白)、结构性糖蛋白(粘着蛋白，以纤连蛋白、层粘蛋白为主)以及蛋白多糖构成复杂、动态的纤维网络构成，直径在数十到数百纳米。这些ECM纤维网络形成细胞组织结构框架，稳定组织，提供细胞粘附的机械支持；同时辅助内信号传播，在细胞繁殖分化、迁移、定位中发挥重要作用。因此理想的支架，应该同时具有合适的微孔尺寸(直径在数十到数百微米)和纳米纤维网络(直径在十到数百纳米)。
目前，组织工程支架制造方法包括致孔剂析出法、冷冻干燥法和电纺丝法等，其制备工艺各有优缺点，如，致孔剂析出法只能制备厚度不大(小于3mm)的片状结构，当支架厚度较大，致孔剂不易流出且会偏聚，导致微孔分布不均匀。冷冻干燥方法的优点在于能够成形贯通性良好的微孔，工艺工程没有高温，方便在支架中复合生物活性物质。电纺丝工艺的缺点是所制备的支架微孔较小，细胞难以长入支架内部，且一般力学性能较差。可见，上述现有方法均不能制备同时具有微孔隙和纳米纤维网络的仿生组织工程支架。
发明内容
本发明的目的是提供一种同时具有微孔隙和纳米纤维网络的仿生组织工程支架；本发明通过结合冷冻干燥法和电纺丝法，得到同时具有微孔隙和纳米纤维网络的仿生组织工程支架。
具体地，首先，通过电纺丝工艺制备纤维网络，这些长而连续的纤维网络通过超声震荡形成短纤维；然后将这些短纤维与生物材料溶液混合，低温下发生热致相分离，然后冷冻干燥得到具有微孔隙和纳米纤维的支架。所述支架充分模拟了天然细胞外基质结构，支架内微孔为细胞长入支架提供了条件，较高的孔隙率利于氧和营养物质在之间内部的渗透和扩散；支架内纳米纤维网络仿生细胞外基质的网络结构，促进细胞黏附、生长、增殖、分化和迁移。
本发明所提供的具有微孔隙和纳米纤维网络的仿生组织工程支架，包括微孔隙和纳米纤维网络结构。
所述微孔隙的孔径为20～200μm，具体可为25μm～75μm、25μm～125μm或50μm～150μm；
所述纳米纤维网络的直径为10～2000nm，具体可为2.5μm～7.5μm、1.5μm～2.5μm或182～348nm，长度为1～100μm，具体可为2.5～7.5μm、1.5～4.5μm或4.5～5.5μm；
所述微孔隙由生物材料制成；
所述生物材料可为天然高分子材料或合成高分子材料；
所述天然高分子材料可为胶原、壳聚糖、海藻酸钠、明胶、丝素蛋白、透明质酸、纤维蛋白原和白蛋白中至少一种；
所述合成高分子材料可为聚己内酯(PCL,Polycaprolactone)、聚乳酸(PLA,Polylactic acid)、聚乙醇酸(PGA,Polyglycolide)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA,Poly(Lactide-co-Glycolide))、聚癸二酸丙三醇酯(PGS,Poly(glycerol sebacate))、聚乙二醇(PEG,Poly(ethylene glycol))和聚丙交脂-乙交脂共聚物(PLLG,poly(L-lactide-co-glycolide))中至少一种。
所述纳米纤维网络由电纺丝材料制成；
所述电纺丝材料可为天然高分子材料或合成高分子材料；
所述天然高分子材料为胶原、壳聚糖、海藻酸钠、明胶、丝素蛋白、透明质酸、纤维蛋白原和白蛋白中至少一种；
所述合成高分子材料可为聚己内酯(PCL,Polycaprolactone)、聚乳酸(PLA,Polylactic acid)、聚乙醇酸(PGA,Polyglycolide)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA,Poly(Lactide-co-Glycolide))、聚癸二酸丙三醇酯(PGS,Poly(glycerol sebacate))、聚D,L-丙交酯(PDLLA)和聚丙交脂-乙交脂共聚物(PLLG,poly(L-lactide-co-glycolide))中至少一种。
本发明还进一步提供了所述仿生组织工程支架的制备方法，包括如下步骤：
(1)采用电纺丝方法制备电纺丝薄膜，经超声破碎分散得到所述纳米纤维网络；
(2)将所述纳米纤维网格与制备所述微孔隙的生物材料溶液混合，依次经凝固、冷冻干燥和交联，即得到具有微孔隙和纳米纤维网络的仿生组织工程支架。
上述的制备方法中，步骤(1)中，所述电纺丝方法的条件如下：
所述电纺丝材料的溶液的质量浓度为0.05～0.2g/mL，具体可为0.08～0.15g/mL、0.08g/mL、0.1g/mL或0.15g/mL，溶剂可选择六氟异丙醇(HFIP)、1,4二氧六环(1,4-dioxane)或三氯甲烷；
电压为5kV～30kV，具体可为20kV；
注射器挤出速度为0.1～5.0ml/h，具体可为0.8～1.6ml/h、0.8ml/h、1.3ml/h或1.6ml/h；
收集装置与针尖之间的间距为5～15cm，具体可为12cm或15cm；
在室温条件下进行即可。
上述的制备方法中，步骤(2)中，所述生物材料溶液的浓度可为0.001～0.02g/mL，具体可为0.005～0.015g/mL、0.005g/mL或0.015g/mL，溶剂可选择PBS缓冲溶液、醋酸水溶液等；
上述的制备方法中，步骤(2)中，所述纳米纤维网格与生物材料的质量比为1：10～10：1，具体可为1：1、1：4或4：1。
上述的制备方法中，步骤(2)中，所述凝固条件如下：
均匀或定向温度场，冷却温度为-20℃～-196℃，具体可为-20℃、-80℃、-196℃；
所述冷冻干燥的条件如下：压强为0.01～0.1mbar，时间为24h～48h；
所述交联可为物理交联或化学交联，所述化学交联包括温度交联、离子交联、共价交联、紫外交联等。
上述的制备方法中，步骤(1)中，当所述电纺丝方法采用的所述电纺丝材料为天然高分子材料时，制备所述电纺丝薄膜之前，还包括将所述电纺丝材料进行交联的步骤，如采用物理交联或化学交联。
本发明具有微孔隙和纳米纤维网络的仿生组织工程支架可用于制备组织替代物、药物筛选模型和病理研究模型等。
与现有的技术相比，本发明具有以下优点：
本发明组织工程支架充分模拟了天然细胞外基质的结构特征，微孔为细胞长入支架提供了条件，较高的孔隙率利于氧和营养物质在之间内部的渗透和扩散；纳米纤维网络仿生细胞外基质的网络结构，能够促进细胞黏附、生长、增殖、分化和迁移。本发明制备方法很好地解决了现有传统的支架制备工艺的缺点，具有成为新的组织工程支架制备技术的潜力。
附图说明
图1为本发明具有微孔隙和纳米纤维网络的仿生组织工程支架的制备方法的流程示意图。
图2为本发明实施例1制备的胶原(collagen)纳米纤维复合的明胶-海藻酸钠支架的扫描电镜照片。
图3为本发明实施例2制备的PCL纳米纤维复合的胶原-壳聚糖支架的扫描电镜照片。
图4为本发明实施例3制备的PDLLA纳米纤维复合的丝素蛋白-壳聚糖支架的扫描电镜照片。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
图1为本发明提供的具有微孔隙和纳米纤维网络的仿生组织工程支架的制备方法的流程示意图。该组织工程支架包括微孔隙和纳米纤维网络两个结构特征；其中微孔隙尺寸(孔隙)为20～200μm，主体材料为天然高分子材料(胶原、壳聚糖、海藻酸钠、明胶、丝素蛋白、透明质酸、纤维蛋白原和白蛋白中至少一种)或合成高分子材料(PCL、PLA、PGA、PLGA、PGS、PEG和PLLG中至少一种)；纳米纤维网格的直径为5～500nm，长度为1～50μm，材料为能够电纺的生物材料，具体可为天然高分子材料(胶原、壳聚糖、海藻酸钠、明胶、丝素蛋白、透明质酸、纤维蛋白原和白蛋白中至少一种)或合成高分子材料(PCL、PLA、PGA、PLGA、PGS、PEG和PLLG中至少一种)。
采用下述步骤制备本发明具有微孔隙和纳米纤维网络的仿生组织工程支架：
1)采用电纺丝法制备电纺丝薄膜，得到长而连续的纳米纤维网络；
2)将上述步骤1)收集的纳米纤维网络，同时放入超声水浴中震荡，得到短而分散的纳米纤维；
3)将上述步骤2)得到的短纤维网络，与支架主体生物材料溶液混合，低温凝固，冷冻干燥，交联，即得到具有微孔隙和纳米纤维网络的仿生组织工程支架；
当电纺丝材料为天然高分子材料时，在电纺丝步骤之前，还需要将电纺丝材料进行交联。
实施例1：制备具有微孔隙和纳米纤维网络的仿生组织工程支架
将明胶(Gelatin，15k～25kDa)溶解在PBS缓冲溶液中，制备成浓度为0.01g/mL的明胶溶液；将海藻酸钠溶解在PBS缓冲溶液中，制备成浓度为0.01g/mL的海藻酸钠溶液；将上述两种溶液制备成均匀、无气泡、无沉淀的混合溶液，即明胶-海藻酸钠混合溶液，明胶与海藻酸钠的质量比为1：1，明胶的浓度为0.005g/mL，海藻酸钠的浓度为0.005g/mL。
将I型鼠尾(Collagen,sigma)胶原溶于1％的醋酸溶液中，制备成浓度为0.08g/mL的胶原溶液，与0.5wt％的京尼平溶液交联，然后溶于六氟异丙醇(HFIP)中，利用电纺丝设备制备胶原纤维(直径为265±83nm)，其中注射器挤出速度为1.3ml/h，电压为20kV，收集装置距离针尖约12cm。将收集到的胶原纤维浸于70％酒精中24小时灭菌，然后用PBS缓冲溶液清洗3次，每次2小时；然后利用超声清洗器(Sonics VibraCell Sonicator)震荡30s，在20kHz，25％幅度下，得到短而分散的胶原纤维(长度为5±2.5μm)。
将短胶原纳米纤维与明胶-海藻酸钠溶液均匀混合(短胶原纳米纤维与明胶和海藻酸钠的总质量)的质量比1：4)，置于24孔板中，放于-20℃凝固6h，然后冷冻干燥(0.04mbar，48h)，在氯化钙溶液中充分交联，然后在PBS缓冲溶液中清洗数次，得到含均匀微孔隙(孔径100±50μm)和纳米纤维(长度为5±2.5μm，直径为265±83nm)的混合支架。
本实施例制备的胶原(collagen)纳米纤维复合的明胶-海藻酸钠支架的扫描电镜照片如图2所示，可以看出，支架具有50μm～150μm的均匀孔隙结构，同时在孔隙壁表面分布着短胶原纳米纤维。
实施例2：制备具有微孔隙和纳米纤维网络的仿生组织工程支架
将鼠尾I型胶原(SIGMA公司，产品编号C7661)溶解于1.0wt％醋酸溶液中，制备成质量分数为0.01g/mL的胶原溶液；将壳聚糖溶解在1.0wt％醋酸溶液中，制备成质量分数为0.01g/mL的壳聚糖溶液；将上述两种溶液制备成均匀、无气泡、无沉淀的混合溶液，即胶原-壳聚糖溶液，胶原与壳聚糖的质量比为1：1，胶原的浓度为0.005g/mL，壳聚糖的浓度为0.005g/mL。
将聚己内酯(PCL)溶于六氟异丙醇(HFIP)中，制备0.1g/mL的PCL溶液，利用电纺丝设备制备PCL纤维(直径为2.0±0.5μm)，其中注射器挤出速度为0.8ml/h，电压为20kV，收集装置距离针尖约15cm。将收集到的PCL纤维通过γ射线辐射灭菌(Co-60，2.5mRad)，再用PBS缓冲溶液清洗3次，每次2小时；然后利用超声清洗器震荡60s，在20kHz，25％幅度下，得到短而分散的PCL纤维(长度为3±1.5μm)。
将短PCL纳米纤维与胶原-壳聚糖溶液均匀混合(质量比1：1)，置于24孔板中，放于-20℃凝固6h，然后冷冻干燥(0.04mbar，48h)，在0.25％戊二醛溶液中充分交联，然后在PBS缓冲溶液中清洗数次，得到含均匀微孔隙(孔径75±50μm)和纳米纤维(长度为3±1.5μm，直径为2.0±0.5μm)的混合支架。
本实施例制备的PCL纳米纤维复合的胶原-壳聚糖支架的扫描电镜照片如图3所示，可以看出，支架具有25μm～125μm的均匀孔隙结构，同时在孔隙壁表面分布着PCL纳米短纤维。
实施例3：制备具有微孔隙和纳米纤维网络的仿生组织工程支架
将丝素蛋白(silk fiber)溶解于1.0wt％醋酸溶液中，制备成质量分数为0.005g/mL的丝素蛋白溶液；将壳聚糖溶解在1.0wt％醋酸溶液中，制备成质量分数为0.015g/mL的壳聚糖溶液；将上述两种溶液制备成均匀、无气泡、无沉淀的混合溶液，即丝素蛋白-壳聚糖溶液，丝素蛋白与壳聚糖的质量比为3：1，丝素蛋白的浓度为0.005g/mL，壳聚糖的浓度为0.015g/mL。
将聚D,L-丙交酯(PDLLA)溶于三氯甲烷中，制备0.15g/mL的PDLLA溶液，利用电纺丝设备制备PDLLA纤维(直径为5.0±2.5μm)，其中注射器挤出速度为1.6ml/h，电压为20kV，收集装置距离针尖约15cm。将收集到的PDLLA纤维通过γ射线辐射灭菌(Co-60，2.5mRad))，再用PBS缓冲溶液清洗3次，每次2小时；然后利用超声清洗器震荡100s，在10kHz，25％幅度下，得到短而分散的PDLLA纤维(长度为5±0.5μm)。
将PDLLA短纳米纤维与丝素蛋白-壳聚糖溶液均匀混合(质量比4：1)，置于24孔板中，放于-80℃凝固6h，然后冷冻干燥(0.04mbar，48h)，在0.25％戊二醛溶液中充分交联，然后在PBS缓冲溶液中清洗数次，得到含均匀微孔隙(孔径50±25μm)和纳米纤维(长度为5±0.5μm，直径为5.0±2.5μm)的混合支架。
本实施例制备的PDLLA纳米纤维复合的丝素蛋白-壳聚糖支架的扫描电镜照片如图4所示，可以看出，支架具有25μm～75μm的均匀孔隙结构，同时在孔隙壁表面分布着PDLLA短纳米纤维。

Claims (8)

1.一种具有微孔隙和纳米纤维网络的仿生组织工程支架的制备方法，包括如下步骤：
（1）采用电纺丝方法制备电纺丝薄膜，经超声破碎分散得到短纳米纤维；
（2）将所述短纳米纤维与制备微孔隙的生物材料溶液混合，依次经凝固、冷冻干燥和交联，即得到所述仿生组织工程支架；
所述生物材料溶液的浓度为0.001~0.02 g/mL；
所述短纳米纤维与所述生物材料的质量比为1：10~10：1；
所述仿生组织工程支架包括微孔隙和分布于所述微孔隙的孔隙壁表面上的所述短纳米纤维；
所述微孔隙的孔径为20~200μm；
所述短纳米纤维的直径为10~2000nm，长度为1~100μm。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述微孔隙由生物材料制成；
所述生物材料为天然高分子材料或合成高分子材料；
所述天然高分子材料为胶原、壳聚糖、海藻酸钠、明胶、丝素蛋白、透明质酸、纤维蛋白原和白蛋白中至少一种；
所述合成高分子材料为聚己内酯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚癸二酸丙三醇酯和聚乙二醇中至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述纳米纤维网络由电纺丝材料制成；
所述电纺丝材料为天然高分子材料或合成高分子材料；
所述天然高分子材料为胶原、壳聚糖、海藻酸钠、明胶、丝素蛋白、透明质酸、纤维蛋白原和白蛋白中至少一种；
所述合成高分子材料为聚己内酯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚癸二酸丙三醇酯和聚乙二醇中至少一种。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述电纺丝方法的条件如下：
所述电纺丝材料的溶液的浓度为0.05~0.2g/mL；
溶剂选择六氟异丙醇、1,4二氧六环或三氯甲烷；
电压为5kV ~30kV；
注射器挤出速度为0.1~5.0ml/h；
收集装置与针尖之间的间距为5~15cm。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述凝固条件如下：
均匀或定向温度场，冷却温度为-20℃~-196℃；
所述冷冻干燥的条件如下：压强为0.01~0.1mbar，时间为24h~48h；
所述交联为物理交联或化学交联。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，当所述电纺丝方法采用的所述电纺丝材料为天然高分子材料时，制备所述电纺丝薄膜之前，还包括将所述电纺丝材料进行交联的步骤。
7.权利要求1-6中任一项所述制备方法制备的仿生组织工程支架。
8.权利要求7所述仿生组织工程支架在制备组织替代物、药物筛选和病例模型研究中的应用。
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