CN109985279B - 一种复合有载药mof的微图案化纳米纤维材料及其制备方法和应用 - Google Patents

一种复合有载药mof的微图案化纳米纤维材料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物材料领域，涉及一种复合有载药MOF的微图案化纳米纤维材料及其制备方法和应用。该材料以相互交错排列的亲水性复合静电纺丝纳米纤维为骨架，有序排列微图案化结构，并分布开放的三维贯通的多孔结构；亲水性复合静电纺丝纳米纤维为支撑性生物相容材料、亲水性生物相容材料及负载修复活性分子的金属有机框架纳米颗粒的共混物。其制备方法为：以均匀分散有负载修复活性分子的金属有机框架纳米颗粒、支撑性生物活性材料和亲水性生物活性材料的有机溶剂作纺丝液，静电纺丝制备。该材料基于缓控释药物载体活性及生物组织活性，协同促进细胞在机体环境与微图案化纳米纤维材料内的活性，利于组织修复及创面愈合，用于制备创伤修复材料。

Description

一种复合有载药MOF的微图案化纳米纤维材料及其制备方法 和应用
技术领域
本发明属于生物材料领域，具体涉及一种复合有载药MOF的微图案化纳米纤维材料及其制备方法和应用。
背景技术
足部溃疡是糖尿病主要并发症之一，创面迁延不愈，严重者甚至需截趾/肢治疗，术后五年死亡率高达50％～68％。正常的皮肤伤口一般能及时而有序的自我修复，而糖尿病伤口则血管新生不足、伤口愈合缓慢，这主要是由于高糖环境下促血管生成的生长因子分泌减少，其相应的受体表达减少，基质沉积减少，无法形成伤口愈合所需的微环境。
近年兴起的皮肤组织工程利用人工合成的皮肤支架材料，再结合生长因子、药物或无机颗粒等构建组织工程化皮肤，有效治疗和修复皮肤损伤。
静电纺丝纳米纤维材料具有较多结构上的优势，由静电纺丝技术制备的纳米纤维材料绝大多数为薄膜状，较好地贴附于创面，质量轻薄不会给创面造成负担，并且还具有同天然人体细胞外基质(ECM)相似的纳米纤维结构以及较大的比表面积，能够促进皮肤组织细胞在其上的粘附及生长，其良好的孔连通性也有利于创面区域细胞所需的营养物质的传输以及气体的交换，近年来作为皮肤组织工程支架受到研究者的广泛重视。
天然人体细胞外基质(ECM)对一切生理活动的调控不仅取决于细胞外基质中起连接、支撑及保护等作用的支架结构，还取决于细胞外基质中储存的支撑细胞生命现象的微环境。
静电纺丝纳米纤维材料虽可模拟天然细胞外基质中起连接、支撑及保护等作用的支架结构，但无法提供支撑细胞生命现象(尤其是增殖、迁移、分化现象)的微环境，无法满足机体对创伤修复等特殊生理功能的需求，尤其在人体自身微环境遭到破坏时，对应用于创伤修复等特殊生理功能的静电纺丝纳米纤维材料的要求更高。
二甲基草酰甘氨酸(DMOG)作为生长因子的小分子替代物，其可诱导缺氧诱导因子1α(HIF-1α)。然而过渡使用DMOG存在副作用，例如促进大量血管生成导致肿瘤的形成及增加红细胞生成等。若能控制DMOG在体内缓慢释放，使其控制在安全浓度范围内，实现治疗作用的同时，降低或免除毒副作用，将扩大DMOG应用于组织修复的医疗应用。
随着纳米技术的蓬勃发展，金属有机框架(MOFs)是近20年来发展极为迅速的新型有机-无机纳米多孔材料，它是以金属离子或金属簇单元为中心，与有机配体分子通过配位作用自组装形成的一类具有周期性的三维网络结构的多孔晶态材料。MOFs具有高度有序、巨大的比表面积和孔隙率等优点，被广泛应用于气体分离、催化、传感和药物负载等。
沸石咪唑酯骨架材料(ZIF)是MOFs的一种，具有与沸石分子筛相似的拓扑结构，热稳性和水稳定性更高，其比表面积达1900m2·g-1，孔径为
Figure BDA0002014549900000021
不仅可以作为药物载体，同时还兼具诊断剂的作用，广泛应用于生物医药领域。如含有钴离子的ZIF-67，被广泛用作过渡金属氧化物的前躯体，应用于储能、生物传感器、超级电容器等。
本发明基于金属有机框架多孔晶态的药物载体活性及静电纺丝技术，制备复合金属有机框架颗粒的静电纺丝纳米纤维材料，该静电纺丝纳米纤维材料不仅具有与ECM相似的起连接、支撑及保护等作用的支架结构，静电纺丝纳米纤维材料内复合的金属有机框架颗粒还可持续缓释、控释创伤修复活性分子，在静电纺丝纳米纤维材料内形成促细胞生长(增殖、迁移及分化等)的微环境，为创伤修复提供生长组织；同时，静电纺丝纳米纤维材料作为修复活性分子的载体，其内的修复活性分子还可持续释放到机体环境中，刺激机体环境细胞活性，修复机体环境。
发明内容
本发明旨在提供一种复合有载药MOF的微图案化纳米纤维材料，该微图案化纳米纤维材料作为药物载体，具有持续缓释、控释活性，MOF内负载的修复活性分子先持续缓释、控释至微图案化纳米纤维材料内，形成具有与ECM相似的支架结构与微环境，支架结构与微环境协同作用，为细胞生长提供生物活性组织；微图案化纳米纤维材料内的修复活性分子再缓释、控释至机体环境中，刺激并提高机体环境细胞活性，修复机体环境；该微图案化纳米纤维材料协同促进细胞在机体环境与微图案化纳米纤维材料内的活性，利于组织修复及创伤高效、安全愈合。
本发明还提供上述复合有载药MOF的微图案化纳米纤维材料的制备方法，该制备方法简单易操作，环境友好，成本低廉。
本发明还提供上述复合有载药MOF的微图案化纳米纤维材料的应用。
本发明的技术方案为，一种复合有载药MOF的微图案化纳米纤维材料，以相互交错排列的亲水性复合静电纺丝纳米纤维为骨架，有序排列微图案化结构，并分布开放的三维贯通的多孔结构；亲水性复合静电纺丝纳米纤维为支撑性生物相容材料、亲水性生物相容材料及负载修复活性分子的金属有机框架纳米颗粒的共混物。
所述支撑性生物相容材料包括左旋聚乳酸、聚己内酯、壳聚糖或甲壳素等，优选为左旋聚乳酸。
所述亲水性生物相容材料包括明胶或透明质酸等，优选为明胶。
所述金属有机框架纳米颗粒优选为以钴离子为中心，与有机配体分子配位自组装形成的三维网络结构的多孔晶体，更优选为以钴离子为中心形成的沸石咪唑骨架晶体；作为优选方案，为ZIF-67晶体。
所述金属有机框架纳米颗粒的粒径为50～500nm，优选为100～200nm；负载修复活性分子前，金属有机框架纳米颗粒的比表面积为1500～2000m2/g，孔径小于5nm，优选不大于2nm，更优选为1～2nm，孔体积为0.5～3cm3/g。
所述修复活性分子包括修复活性药物和/或天然修复活性因子，天然修复活性因子为生长因子，修复活性药物优选为小分子修复活性药物，如DMOG。
微图案化结构由相互间隔呈横向、纵向、横向与纵向垂直或横向与纵向多角度相互交叉排列的、尺寸可调的多个单位图案组成，单位图案包括圆形、椭圆形、平行四边形、梯形或正多边形(n≧5)，平行四边形优选为矩形、菱形、方形；单位图案优选为圆形或椭圆形，更优选为半径30～500μm圆形；作为优选方案，为半径300～500μm圆形。
亲水性复合静电纺丝纳米纤维的直径10～1000nm，优选为80～450nm，更优选为150～300nm，作为优选方案，为200nm。
亲水性复合静电纺丝纳米纤维中，支撑性生物活性材料、亲水性生物活性材料与负载修复活性分子的金属有机框架纳米颗粒的质量比为1：0.5～2：0.5×10-3～5×10-3，优选为1：0.9～1.2：1×10-3～3×10-3，更优选为1：0.9～1.2：1.5×10-3～2×10-3。
亲水性复合静电纺丝纳米纤维在微图案化结构处低密度沉积，在微图案化结构间高密度沉积，静电纺丝纳米纤维基于这种有规律的沉积，形成有序排列的疏密相间的微图案化纳米纤维材料，提高孔隙率，更利于细胞的迁移及营养物质的传输。
作为本发明的优选方案，一种复合有载药MOF的微图案化纳米纤维材料，以相互交错排列的亲水性复合静电纺丝纳米纤维为骨架，有序排列微图案化结构，并分布开放的三维贯通的多孔结构；亲水性复合静电纺丝纳米纤维为左旋聚乳酸、明胶及负载二甲基草酰甘氨酸的ZIF-67纳米颗粒的共混物。
ZIF-67纳米颗粒的粒径为50～500nm，优选为100～200nm；负载二甲基草酰甘氨酸前，ZIF-67纳米颗粒的比表面积为1500～2000m2/g，孔径小于5nm，优选不大于2nm，更优选为1～2nm，孔体积为0.5～3cm3/g；负载二甲基草酰甘氨酸后，ZIF-67的比表面积为1000～1400m2/g，孔径小于5nm，优选不大于2nm，更优选为1～2nm，孔体积为0.5～3cm3/g；以ZIF-67纳米颗粒的质量计，二甲基草酰甘氨酸的载药量为200～360mg/g，优选为300～360mg/g。
微图案化结构由相互间隔呈横向、纵向、横向与纵向垂直或横向与纵向多角度相互交叉排列的、尺寸可调的多个单位图案组成，单位图案包括圆形、椭圆形、平行四边形、梯形或正多边形(n≧5)，平行四边形优选为矩形、菱形、方形；单位图案优选为圆形或椭圆形，更优选为半径30～500μm圆形；作为优选方案，为半径300～500μm圆形。
亲水性复合静电纺丝纳米纤维的直径10～1000nm，优选为80～450nm，更优选为150～300nm，作为优选方案，为200nm。
亲水性复合静电纺丝纳米纤维中，左旋聚乳酸、明胶与负载二甲基草酰甘氨酸的ZIF-67纳米颗粒的质量比为1：0.5～2：0.5×10-3～5×10-3，优选为1：0.9～1.2：1×10-3～3×10-3，更优选为1：0.9～1.2：1.5×10-3～2×10-3。
上述复合有载药MOF的微图案化纳米纤维材料的制备方法，步骤包括：采用微图案化的接收模板，以均匀分散有负载修复活性分子的金属有机框架纳米颗粒、支撑性生物活性材料和亲水性生物活性材料的有机溶剂作纺丝液，静电纺丝制备复合有载药MOF的微图案化纳米纤维材料。
纺丝液中，支撑性生物活性材料、亲水性生物活性材料与负载修复活性分子的金属有机框架纳米颗粒的质量比为1：0.5～2：0.5×10-3～5×10-3，优选为1：0.9～1.2：1×10-3～3×10-3，更优选为1：0.9～1.2：1.5×10-3～2×10-3；支撑性生物活性材料与亲水性生物活性材料的总质量与有机溶剂的体积的比值为1g：5～20mL，优选为1g：20mL。
所述支撑性生物相容材料包括左旋聚乳酸、聚己内酯、壳聚糖或甲壳素等，优选为左旋聚乳酸。
所述亲水性生物相容材料包括明胶或透明质酸等，优选为明胶。
所述金属有机框架纳米颗粒优选为以钴离子为中心，与有机配体分子配位自组装形成的三维网络结构的多孔晶体，更优选为以钴离子为中心形成的沸石咪唑骨架晶体；作为优选方案，为ZIF-67纳米颗粒。
所述修复活性分子包括修复活性药物和/或天然修复活性因子，天然修复活性因子为生长因子，修复活性药物优选为小分子修复活性药物，如DMOG。
有机溶剂包括六氟异丙醇、二氯甲烷、氯仿或三氟乙醇等，优选为六氟异丙醇(HFIP)。
静电纺丝的参数为：常温，40％RH～60％RH，施加电压为7～9kV，溶液推进速度为0.01～0.03mL/min，喷头和图案化接收模板之间的距离为8～12cm。
静电纺丝制备复合有载药MOF的微图案化纳米纤维膜真空干燥处理8～48小时，以去除残余溶剂。
负载修复活性分子的金属有机框架纳米颗粒的制备步骤包括：金属有机框架纳米颗粒浸于含有修复活性分子的溶液中，修复活性分子负载于金属有机框架纳米颗粒的孔道内，形成负载修复活性分子的金属有机框架纳米颗粒。
含有修复活性分子的溶液中，修复活性分子的浓度为2～50mg/ml，优选为15～25mg/ml，更优选为25mg/ml。优选为含有修复活性分子的磷酸盐溶液，pH＝7.3～7.5，更优选为pH＝7.4。
于25℃～37℃浸泡12～200小时，温度优选为37℃，优选时间为24～168小时。
所述金属有机框架纳米颗粒优选为以钴离子为中心，与有机配体分子配位自组装形成的三维网络结构的多孔晶体，更优选为以钴离子为中心形成的沸石咪唑骨架晶体；作为优选方案，为ZIF-67纳米颗粒。
金属有机框架纳米颗粒的粒径为50～500nm，优选为100～200nm；负载修复活性分子前，金属有机框架纳米颗粒的比表面积为1500～2000m2/g，孔径小于5nm，优选不大于2nm，更优选为1～2nm，孔体积为0.5～3cm3/g。
所述修复活性分子包括修复活性药物和/或天然修复活性因子，天然修复活性因子为生长因子，修复活性药物优选为小分子修复活性药物，如DMOG。
金属有机框架纳米颗粒的制备步骤包括：将金属盐与有机配体分子溶于有机溶剂中，恒温并搅拌条件下反应制备金属有机框架纳米颗粒。
有机溶剂中，金属元素的浓度为20～80mmol/L，优选为65～70mol/L；金属元素与有机配体分子的摩尔比为1：5～10，优选为1：5～8；有机溶剂包括甲醇、乙醇或N-N二甲基甲酰胺，优选为甲醇。
反应温度为20℃～30℃，优选为室温。
反应结束后，离心，洗涤，并真空干燥，得到金属有机框架纳米颗粒。金属有机框架纳米颗粒的粒径为50～500nm，优选为100～200nm；比表面积为1500～2000m2/g；孔径小于5nm，优选不大于2nm，更优选为1～2nm；孔体积为0.5～3cm3/g。
所述金属盐优选为钴盐，如氯化钴或硝酸钴。
所述有机配体分子优选为2-甲基咪唑。
作为本发明的优选方案，一种复合有载药MOF的微图案化纳米纤维材料的制备方法，步骤包括：采用微图案化的接收模板，以均匀分散有负载二甲基草酰甘氨酸的ZIF-67纳米颗粒、左旋聚乳酸和明胶的有机溶剂作纺丝液，静电纺丝制备复合有载药MOF的微图案化纳米纤维膜。
纺丝液中，左旋聚乳酸、明胶与负载二甲基草酰甘氨酸的ZIF-67纳米颗粒的质量比为1：0.5～2：0.5×10-3～5×10-3，优选为1：0.9～1.2：1×10-3～3×10-3，更优选为1：0.9～1.2：1.5×10-3～2×10-3；左旋聚乳酸与明胶的总质量与有机溶剂的体积的比值为1g：5～20mL，优选为1g：20mL。左旋聚乳酸的分子量为10万～100万，优选为20万～50万。
有机溶剂包括六氟异丙醇、二氯甲烷、氯仿或三氟乙醇等，优选为六氟异丙醇(HFIP)。
静电纺丝的参数为：常温，40％RH～60％RH，施加电压为7～9kV，溶液推进速度为0.01～0.03mL/min，喷头和图案化接收模板之间的距离为8～12cm。
负载二甲基草酰甘氨酸的ZIF-67纳米颗粒的制备步骤包括：ZIF-67纳米颗粒浸于含有DMOG的溶液中，二甲基草酰甘氨酸负载于ZIF-67纳米颗粒的孔道内，形成负载二甲基草酰甘氨酸的ZIF-67纳米颗粒。
含有DMOG的溶液中，DMOG的浓度为2～50mg/ml，优选为15～25mg/ml，更优选为25mg/ml。优选为含有DMOG的磷酸盐溶液，pH＝7.3～7.5，更优选为pH＝7.4。
于25℃～37℃浸泡12～200小时，温度优选为37℃，优选时间为24～168小时。
ZIF-67纳米颗粒的粒径为50～500nm，优选为100～200nm；负载二甲基草酰甘氨酸前，ZIF-67纳米颗粒的比表面积为1500～2000m2/g，孔径为1～2nm，孔体积为0.5～3cm3/g；负载二甲基草酰甘氨酸后，ZIF-67的比表面积为1000～1400m2/g，孔径为1～2nm，孔体积为0.5～3cm3/g；以ZIF-67纳米颗粒的质量计，二甲基草酰甘氨酸的载药量为200～360mg/g，优选为300～360mg/g。
ZIF-67纳米颗粒的制备步骤包括：将钴盐与2-甲基咪唑溶于有机溶剂中，恒温并搅拌条件下反应制备ZIF-67纳米颗粒。
有机溶剂中，钴元素的浓度为20～80mmol/L，优选为65～70mmol/L；钴元素与2-甲基咪唑的摩尔比为1：5～10，优选为1：5～8；有机溶剂包括甲醇、乙醇、N-N二甲基甲酰胺，优选为甲醇。
反应温度为20℃～30℃，优选为室温。
反应结束后，离心，洗涤，并真空干燥，得到ZIF-67纳米颗粒。ZIF-67纳米颗粒的粒径为50～500nm，优选为100～200nm；比表面积为1500～2000m2/g；孔径为微孔，优选为1～2nm；孔体积为0.5～3cm3/g。
本发明制备的复合有载药MOF的微图案化纳米纤维材料，以左旋聚乳酸、明胶和负载二甲基草酰甘氨酸的ZIF-67纳米颗粒共混形成的亲水性复合静电纺丝纳米纤维为骨架，分布开放的三维贯通的多孔结构，并辅以有序排列的微图案化结构。ZIF-67纳米颗粒内负载的二甲基甘氨酸先从ZIF-67纳米颗粒内持续缓释、控释到微图案化纳米纤维材料内，再从微图案化纳米纤维材料内持续缓释、控释到机体环境中，达到缓释和控释效果，同时，钴离子可从ZIF-67纳米颗粒中降解持续缓释、控释至微图案纳米纤维材料内，并从微图案化纳米材料内持续缓释、控释到机体环境中，在此过程中，微图案化纳米纤维材料内形成利于细胞生长(增殖、粘附、迁移、成血管化、胶原沉积并抑制炎症反应)的由二甲基甘氨酸与钴离子协同作用的微环境，协同微图案纳米纤维材料的支架结构，形成利于细胞生长的组织；且微图案化纳米纤维材料内形成的二甲基甘氨酸与钴离子协同作用的微环境还可释放到机体环境中，刺激并促进机体环境细胞的增殖、粘附、迁移、成血管化、胶原沉积并抑制炎症反应，修复机体环境。
本发明制备的微图案化纳米纤维材料内形成稳定的利于细胞生长的与天然人体细胞外基质类似的支架结构与微环境，为机体细胞提供生物活性组织；同时，该微图案化纳米纤维材料作为载体，还可将其内形成的微环境缓、控释放到机体环境中，刺激并促进机体环境细胞的生长，修复机体环境；该微图案化纳米纤维材料协同缓控释药物载体活性和生物组织活性，协同促进细胞在机体环境与微图案化纳米纤维材料内的生长活性，促进机体创伤修复。
综上，复合有载药MOF的微图案化纳米纤维材料，均可在微图案化纳米纤维材料内形成与天然人体细胞外基质类似的支架结构与微环境，形成利于细胞生长的生物活性组织，该微环境由MOF内负载的修复活性分子组成，必要时还可辅以活性金属离子；并可将微图案化纳米纤维材料内形成的微环境缓控释放到机体环境中；复合有载药MOF的微图案化纳米纤维材料的缓控释药物载体活性及生物组织活性，协同促进细胞在机体环境与微图案化纳米纤维材料内的生长活性，促进创伤修复。
因此，本发明复合有载药MOF的微图案化纳米纤维材料可用于制备创伤修复材料，尤其适用于糖尿病伤口的高效、安全愈合。
一种生物材料，具有创伤修复活性，含有本发明复合有载药MOF的微图案化纳米纤维材料。
相对于现有技术，本发明的优点在于：本发明复合有载药MOF的微图案化纳米纤维材料基于其自身的缓释、控释作用，可在微图案化纳米纤维材料内形成利于细胞生长的微环境，协同微图案化纳米纤维材料的支架结构，形成利于细胞生长的生物活性组织；微图案化纳米纤维材料内形成的利于细胞生长的微环境还可持续缓释、控释至机体环境中，刺激机体细胞生长，修复机体环境；复合有载药MOF的微图案化纳米纤维材料基于缓控释药物载体活性及生物组织活性，协同促进细胞在机体环境与微图案化纳米纤维材料内的生长活性，利于组织修复与创面愈合。
附图说明
图1为实施例1制备的ZIF-67的SEM(A)、TEM(B)、EDS(C)、XRD(D)、氮气吸附脱附曲线图(E、F)及孔径分布图(G)。
图2为实施例1制备的PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(PL/G，A1、A2、A3)、ZIF-67/PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(Z-PL/G，B1、B2、B3)和DMOG@ZIF-67/PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(DZ-PL/G，C1、C2、C3)的光学显微图、扫描电镜图和透射电镜图。
图3为实施例1制备的DMOG@ZIF-67/PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜体外DMOG释放曲线图(A)和Co离子释放曲线图(B)。
图4为PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(PL/G)、ZIF-67/PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(Z-PL/G)和DMOG@ZIF-67/PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(DZ-PL/G)作用下，HUVECs(A)、HaCaT(B)、HAF(C)的增殖柱状图。
图5为PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(PL/G)、ZIF-67/PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(Z-PL/G)和DMOG@ZIF-67/PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(DZ-PL/G)作用下，HUVECs细胞的transwell迁移图(A、B、C)及定量分析(D)。
图6为PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(PL/G)、ZIF-67/PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(Z-PL/G)和DMOG@ZIF-67/PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(DZ-PL/G)作用下，HUVECs细胞成血管图(A、B、C)及定量分析(D)。
图7为PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(PL/G)、ZIF-67/PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(Z-PL/G)和DMOG@ZIF-67/PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(DZ-PL/G)作用下，HUVECs成血管相关基因VEGF(A)、eNOS(B)、HIF-1α(C)的表达量。
图8为手术后第0、3、7、9和11天，对照组、PL/G组、Z-PL/G组与DZ-PL/G组糖尿病小鼠背部切口愈合图(A)、切口修复模拟效果图(B)及切口修复统计图(C)。
图9为手术后第7和11天，对照组、PL/G组、Z-PL/G组与DZ-PL/G组糖尿病小鼠背部切口处新生血管图(A)及新生血管定量分析图(B、C)。
图10为手术后第7和11天，对照组、PL/G组、Z-PL/G组与DZ-PL/G组糖尿病小鼠切口处的CD31早期血管染色、DAPI细胞核染色及Merge血管化染色图(A、B)；及手术后第7和11天，血管新生定量分析(C、D)。
图11为手术后第7和11天，对照组、PL/G组、Z-PL/G组与DZ-PL/G组糖尿病小鼠切口组织切片Massion三色染色图(A、B)及胶原表达定量分析(C、D)。
图12为对照组、PL/G组、Z-PL/G组与DZ-PL/G组糖尿病小鼠切口处I型胶原(A)、III型胶原(B)、Ki67(C)和TGF-β(D)的Q-PCR表达结果图。
图13为对照组、PL/G组、Z-PL/G组与DZ-PL/G组糖尿病小鼠切口处促炎细胞因子IL-10(A)、IL-6(B)、IL-1β(C)基因表达结果图。
具体实施方式
下面结合实例对本发明作进一步说明，但它们并不是对本发明作任何限制。
实施例1微图案化纳米纤维膜的制备
(一)ZIF-67(沸石咪唑类骨架材料)和装载DMOG(二甲基乙二酰甘氨酸)的ZIF-67的制备及其形态表征
1.制备ZIF-67纳米颗粒
将0.291g六水硝酸钴和0.66g 2-甲基咪唑分别溶于15mL甲醇，室温下混合搅拌24h，于10000rpm下离心5min所得产物，用甲醇反复洗涤后，于80℃真空干燥24h，即得ZIF-67纳米颗粒，其SEM、TEM、EDS、XRD、氮气吸附脱附曲线如图1所示。
2.制备载药ZIF-67纳米颗粒
37℃时，将25mg ZIF-67置于浓度为15mg/mL的DMOG磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH＝7.4)中浸泡3天，离心并洗涤后，于37℃下真空干燥24h，得到装载DMOG的ZIF-67(DMOG@ZIF-67)纳米颗粒，其XRD、氮气吸附脱附曲线如图1所示。
由ZIF-67纳米颗粒的SEM图(图1A)与TEM图(图1B)可知，ZIF-67纳米颗粒的晶体类型一致，且大小均匀，粒径范围为50～500nm，粒径多分布在100～200nm。DMOG@ZIF-67纳米颗粒的SEM图和TEM图同图1A和图1B。
由ZIF-67纳米颗粒的EDS图(图1C)可知，ZIF-67纳米颗粒中含有钴元素。
由ZIF-67纳米颗粒与DMOG@ZIF-67纳米颗粒的XRD图(图1D)可知，ZIF-67纳米颗粒XRD图的峰位置、峰形及相对强度，同软件模拟的理论XRD谱图相吻合，由此证实本实施例制备纯相的ZIF-67纳米颗粒。与F-67纳米颗粒的XRD图相比，DMOG@ZIF-67纳米颗粒的峰强度变弱，峰位置及峰形为发生变化。
由ZIF-67纳米颗粒(图1E)与DMOG@ZIF-67纳米颗粒(图1F)的氮气吸附-脱附曲线可知，ZIF-67纳米颗粒和DMOG@ZIF-67纳米颗粒的氮气吸附-脱附曲线属于I型吸附等温线，在较低相对气压时，氮气吸附有急剧增加，说明ZIF-67纳米颗粒中分布微孔，如图1G显示；相对压力继续增加，氮气增加趋势放缓，在相对压力P/P0＞0.9时显示微小滞后环，说明ZIF-67纳米颗粒中偶有介孔，介孔数较微量。
由表1的氮气吸脱附分析表明，相较于ZIF-67，DMOG@ZIF-67的比表面积有明显降低，孔径和孔体积有些微降低，ZIF-67的载药量为359.12mg/g(1g ZIF-67能装载359.12mg的DMOG)，装载效率为23.9％。
表1.ZIF-67与DMOG@ZIF-67的结构参数及ZIF-67的装载效率
Figure BDA0002014549900000111
(二)复合有ZIF-67纳米颗粒的微图案化纳米纤维膜的制备及其形态和亲疏水性能的表征
分别将ZIF-67和DMOG@ZIF-67超声分散在六氟异丙醇(HFIP)中，对应得到浓度为0.004g/100mL的ZIF-67悬浮液与DMOG@ZIF-67悬浮液。
向ZIF-67悬浮液与DMOG@ZIF-67悬浮液中分别加入将质量比为1：1的左旋聚乳酸(分子量30万，PLLA)和明胶(Gel)，左旋聚乳酸与明胶的总质量与HFIP体积的比值为5g：100mL，分别形成含有ZIF-67的纺丝液与含有DMOG@ZIF-67的纺丝液。
同时按照左旋聚乳酸(分子量30万，PLLA)和明胶(Gel)质量比为1：1，左旋聚乳酸与明胶的总质量与HFIP体积的比值为5g：100mL，制备既不含有ZIF-67又不含有DMOG@ZIF-67的平行对照纺丝液。
平行对照纺丝液、含有ZIF-67的纺丝液与含有DMOG@ZIF-67的纺丝液，采用图案化接收模板，在常温、50％RH条件下，静电纺丝制备各自对应的图案化的多孔复合电纺纤维膜并真空干燥(24小时)，依次为PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(PL/G)、ZIF-67/PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(Z-PL/G)和DMOG@ZIF-67/PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(DZ-PL/G)。
静电纺丝的参数为：施加电压为7kV，溶液推进速度为0.02mL/min，喷头和图案化接收模板之间的距离为10cm。
采用光学显微镜、扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)和接触角(WCA)对上述制备的微图案化纳米纤维膜的物相组成和表面微观结构进行分析与表征。通过Image J软件测量纤维直径和孔径，从SEM图像中至少测量100根纤维计算其平均纤维直径。
PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(PL/G)的光学显微图如图2(A1)，扫描电镜图如图2(A2)，透射电镜图如图2(A3)；ZIF-67/PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(Z-PL/G)的光学显微图如图2(B1)，扫描电镜图如图(B2)，透射电镜图如图2(B3)；DMOG@ZIF-67/PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(DZ-PL/G)的光学显微图如图2(C1)，扫描电镜图如图2(C2)，透射电镜图如图2(C3)。
PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(PL/G)、ZIF-67/PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(Z-PL/G)和DMOG@ZIF-67/PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(DZ-PL/G)的水接触角依次为28°、29°、30°，由图2A1-C1可知，PL/G、Z-PL/G与DZ-PL/G微图案化纳米纤维膜上均具有圆形的微图案化结构且亲水性良好。
由图2A2-C2的测量结果可知，PL/G、Z-PL/G与DZ-PL/G微图案化纳米纤维膜的纤维直径均在200nm左右。
由图2A3-C3可知，PL/G微图案化纳米纤维膜的纤维内部没有纳米颗粒，Z-PL/G与DZ-PL/G微图案化纳米纤维膜的纤维内部分别对应显现出ZIF-67和DMOG@ZIF-67纳米颗粒，表明ZIF-67和DMOG@ZIF-67均已掺入各自的图案化纤维膜中。
(三)DMOG@ZIF-67/PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜体外的药物和离子释放行为
将DMOG@ZIF-67/PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜剪成面积为2.0×2.0cm2的正方形样品，编号并记录它们的重量。于37℃，将每个样品在摇床中浸入20mL PBS(pH＝7.4)中，摇床振荡速度为100r/min。每个时间点收集4mL释放后的介质用于检测，并倒入等体积的新鲜PBS。使用UV-vis分光光度计在230nm处测定收集溶液中释放的DMOG含量，结果如图3A。通过感应耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)测定复合膜中释放的Co离子的浓度，结果如图3B。
由图3A可知，DMOG的整个释放过程是一个积极的缓慢释放过程，未出现爆发式释放。释放过程持续至25天左右，释放的药物量达到了70.7％。释放的速度分为两个阶段：第一个阶段从释放开始至11天，释放的药物量达到了49.2％，释放速度相对缓慢；之后为第二个阶段，释放速度更为缓慢，25天时药物释放量达到70.7％。
由图3B可知，随着释放时间的增加，Co离子浓度增加。至释放15天，DMOG@ZIF-67/PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜释放的Co离子浓度为2.899μM。
实施例2实施例1制备的微图案化纳米纤维膜对软组织伤口损伤修复过程中细胞增殖的影响
将实施例1制备的PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(PL/G)、ZIF-67/PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(Z-PL/G)和DMOG@ZIF-67/PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(DZ-PL/G)分别裁剪成Φ＝13mm的圆形片状，粘在细胞爬片上，于75％酒精中浸泡2次，每次20min，使用灭菌的PBS浸泡2次，每次10min，最后放入48孔板中备用。分别将HUVECs、HAFs、HaCaTs以每孔7×103个细胞密度接种于各组样品表面，加入培养基依次对应为5％FBS及内皮细胞生长因子(ECGS)的ECM培养基、10％FBS的DMEM培养基和10％FBS的1640培养基，放入37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养，培养基每两天更换一次。CCK8显色法检测三种细胞在材料表面的增殖情况。分别于细胞培养的第1、3和7天，避光条件下在48孔板中加入CCK8溶液，37℃培养箱中孵育2～4h，将孵育液加到96孔板中，用分光光度计于450nm波长处检测显色液的吸光值。CCK8值用吸光度表示，吸光度与材料表面活细胞的数量成正比。
PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(PL/G)、ZIF-67/PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(Z-PL/G)和DMOG@ZIF-67/PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(DZ-PL/G)的血管内皮细胞(HUVECs)增殖情况如图4A。
PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(PL/G)、ZIF-67/PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(Z-PL/G)和DMOG@ZIF-67/PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(DZ-PL/G)的角质形成细胞(HaCaTs)增殖情况如图4B。
PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(PL/G)、ZIF-67/PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(Z-PL/G)和DMOG@ZIF-67/PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(DZ-PL/G)的人成纤维细胞(HAFs)增殖情况如图4C。
由图4A-C可知，血管内皮细胞、角质形成细胞与人成纤维细胞在PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(PL/G)、ZIF-67/PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(Z-PL/G)和DMOG@ZIF-67/PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(DZ-PL/G)上的增殖情况良好，且细胞数目具有良好的时间依赖性。相对于PL/G组和Z-PL/G组，血管内皮细胞、角质形成细胞与人成纤维细胞在DZ-PL/G上的增殖能力最强，DZ-PL/G微图案化纳米纤维膜具有良好的细胞相容性。
实施例3实施例1制备的微图案化纳米纤维膜对HUVECs的迁移和成管能力的影响
分别向24孔细胞培养板底部加入PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(PL/G)、ZIF-67/PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(Z-PL/G)和DMOG@ZIF-67/PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(DZ-PL/G)，然后放入transwell小室，小室下室加入600μL含有血清的血管内皮细胞提前浸泡过的培养基，小室上室接入100μL含有6×104个HUVECs不含血清的培养基，于37℃、5％CO2培养箱中孵育，时间为6～8小时，结晶紫染色观察细胞迁移情况。
PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(PL/G)、ZIF-67/PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(Z-PL/G)和DMOG@ZIF-67/PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(DZ-PL/G)作用下，迁移至下室的细胞结晶紫染色结果依次如图5A、B、C所示，HUVECs细胞迁移定量分析如图5D所示，HUVECs细胞在DZ-PL/G作用下的细胞迁移能力最强，促细胞迁移效果最好。
将Matrigel基质胶置于冰上4℃冰箱化冻过夜，96孔板置于-80℃冰箱内预冷。向预处理后的96孔板中加入50μLmatrigel基质胶，放于37℃培养箱中孵育30min，以便matrigel发生聚合。Matrigel聚合后，每孔加入含有1×104个HUVECs的各组材料浸提液(空白组(Ctrl)、PL/G组、Z-PL/G组与DZ-PL/G)，放于37℃培养箱中继续培养8小时后观察细胞成管情况。
PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(PL/G)、ZIF-67/PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(Z-PL/G)和DMOG@ZIF-67/PLLA/Gel微图案化纳米纤维膜(DZ-PL/G)作用下，HUVECs细胞成血管图如图6A、B、C所示，HUVECs细胞成血管定量分析如图6D所示，HUVECs细胞在DZ-PL/G作用下的成血管效果最好。
实施例4实施例1制备的微图案化纳米纤维膜对HUVECs的成血管基因表达能力的影响
将HUVECs细胞分别接种在各组材料(PL/G、Z-PL/G与DZ-PL/G)上，培养到48h后，移去培养基，PBS洗2次，加入1mL Trizol，充分吹打，将细胞和纤维膜一并加入到1.5mL离心管中。提取细胞RNA，得到RNA通过反转得到cDNA。将反转录得到的HUVECs cDNA稀释5倍，实验时吸取2μl作为模版，使用SYBR Green(Takara，Japan)荧光染料。实验验证的血管新生相关基因为VEGF、e-NOS、HIF1α，其表达活性如图7所示。
由图7可知，DZ-PL/G作用下，VEGF、e-NOS、HIF1α基因的表达活性均显著高于PL/G和Z-PL/G。Z-PL/G作用下，VEGF、e-NOS基因的表达活性显著高于PL/G，HIF1α基因的表达活性与PL/G相当。
实施例5体内全层创伤修复实验
利用STZ诱导30只18g的雄性BALB/c实验鼠患糖尿病，诱导一周后测血糖，血糖值升高并且数值稳定在250mg/dl，说明小鼠被成功诱导为糖尿病小鼠，用于后续的实验。
在糖尿病小鼠背部区域建立一个完整的厚度的皮肤伤口(圆形，直径为8mm)，在小鼠创伤区域分别植入实施例1制备的微图案化纳米纤维材料并进行分组，分别为：空白对照组(Control)、PL/G组、Z-PL/G组、DZ-PL/G组。分别于0、3、7、9和11天利用数码相机于固定的距离及角度记录创伤区域的伤口愈合变化情况，如图8A。根据图8A，制作的糖尿病小鼠背部创伤修复模拟效果图如图8B，制作的糖尿病小鼠背部创伤修复统计图如图8C。
由图8A-C可知，第7天时，DZ-PL/G组糖尿病小鼠背部创伤面积减少74.6％、Z-PL/G组减少74.9％、PL/G组减少73.9％、Control组减少62.6％；第11天时，DZ-PL/G组糖尿病小鼠背部创伤面积减少95.3％、Z-PL/G组减少93.8％、PL/G组减少91.2％、Control组减少88.1％。相对Control组、PL/G组和Z-PL/G组，DZ-PL/G组糖尿病小鼠伤口愈合速度明显更快，促伤口愈合效果显著。
实施例6实施例1制备的微图案化纳米纤维膜对小鼠体内创面修复质量的影响及其相关机理
6.1创伤区域组织形态分析
分别于7天和11天时处死实施例5的实验小鼠，取出创伤区域周围的组织标本(2mm左右)进行组织分析。
将取得的组织标本用4％的多聚甲醛固定36h后，利用分级醇以及二甲苯对组织进行脱水，并利用石蜡包埋。使用RM2155切片机切取5μm厚切片，采用Masson三色染色用作观察创伤组织处胶原网络的形成以及表皮迁移情况。利用Image Pro Plus version 6.0(Media Cybernetics,Rockville,MD,USA)统计胶原形成量，其中蓝绿色表示胶原纤维。
7天和11天时，各组小鼠(Control组、PL/G组、Z-PL/G组与DZ-PL/G组)伤口的Masson’s三色染色图如图11A、B所示，图11A、B中左侧图片的黑色虚线方框部位出现表皮迁移，图11A、B中右侧图片对应为左侧图片中黑色虚线框部位的放大图，表皮迁移效果越好，蓝色染色越多越显著。相对于Control组、PL/G组和Z-PL/G组，DZ-PL/G组更利于伤口处表皮细胞的再生。
7天和11天时，各组小鼠(Control组、PL/G组、Z-PL/G组与DZ-PL/G组)伤口处单位面积的胶原含量如图11C、D所示，11天时，DZ-PL/G组单位面积胶原含量明显高于Control组、PL/G组、Z-PL/G组。
Q-PCR评估各组小鼠伤口组织中胶原沉积相关基因的表达，结果如图12，DZ-PL/G组的胶原I、胶原III、Ki67表达水平明显高于Control组、PL/G组和Z-PL/G组，TGF-β的表达也是DZ-PL/G组最高。
6.2免疫组织荧光染色分析
分别于第7天和11天获取实施例5实验小鼠伤口部位的皮肤，利用体式显微镜对伤口部位进行拍照，观察伤口处血管新生的情况。将切片后的组织标本(5μm)经过脱蜡处理，在100℃的柠檬酸钠缓冲溶液中浸泡20min，冷却至室温1h，后在4℃下进行一抗(CD31)孵化过夜。随后，将其浸泡在PBS中清洗，室温下进行2h小时的二抗孵化过程。最后，用DAPI对细胞核进行染色。利用荧光显微镜(Leica Confocal microscope)进行观察分析。
第7天和第11天时，各组糖尿病小鼠(Control组，PL/G组，Z-PL/G组和DZ-PL/G组)创伤区域组织的血管新生情况如图9A，可观察到DZ-PL/G组的新生血管明显较比其他组多，伤口处的血管更加密集。
第7天和第11天时，各组糖尿病小鼠单位面积的新生血管统计结果如图9B、C，DZ-PL/G具有明显的促进血管新生的效果。
第7天和第11天时，各组糖尿病小鼠血管生成标志物CD31、DAPI、Merge的组织免疫荧光图如图10A、B，相较于Control组，PL/G组、Z-PL/G组、DZ-PL/G组CD31的表达明显增加，说明其血管生成量明显增加。
第7天和第11天时，各组糖尿病小鼠CD31标记新生血管统计结果如图10C、D，DZ-PL/G有明显的促进血管新生效果。
综上，DZ-PL/G组能够显著促进CD31的表达，即可显著增加创伤区域血管的新生。
6.3促炎细胞因子的基因表达分析
过Trizol提取重新上皮化的皮肤组织的总RNA。对于cDNA合成，使用PrimeScriptTM RT Master Mix将分离的RNA(1μg)分别在37℃下反转30分钟和在85℃下反转10秒钟。使用SYBR Green检测试剂进行Q-PCR测试，使用肌动蛋白作为参照基因。
各组(Control组、PL/G组、Z-PL/G组和DZ-PL/G组)糖尿病小鼠伤口组织中促炎细胞因子IL-10、IL-6和IL-1β的表达，如图13所示。结果表明，DZ-PL/G组能够显著下调IL-10、IL-6、和IL-1β的表达(图13A-C)。

Claims (7)

1.一种复合有载药MOF的微图案化纳米纤维材料，其特征在于，以相互交错排列的亲水性复合静电纺丝纳米纤维为骨架，有序排列微图案化结构，并分布开放的三维贯通的多孔结构；亲水性复合静电纺丝纳米纤维为支撑性生物相容材料、亲水性生物相容材料及负载修复活性分子的金属有机框架纳米颗粒的共混物；
所述支撑性生物相容材料为左旋聚乳酸、聚己内酯、壳聚糖或甲壳素，亲水性生物相容材料为明胶或透明质酸，金属有机框架纳米颗粒的粒径为50～500nm，修复活性分子包括修复活性药物和/或天然修复活性因子；
通过以下方法制备：采用微图案化的接收模板，以均匀分散有负载修复活性分子的金属有机框架纳米颗粒、支撑性生物活性材料和亲水性生物活性材料的有机溶剂作纺丝液，静电纺丝制备复合有载药MOF的微图案化纳米纤维膜；
所述的纺丝液中，支撑性生物活性材料、亲水性生物活性材料与负载修复活性分子的金属有机框架纳米颗粒的质量比为1：0.5～2：0.5×10-3～5×10-3，支撑性生物活性材料与亲水性生物活性材料的总质量与有机溶剂的体积的比值为1g：5～20mL；有机溶剂包括六氟异丙醇、二氯甲烷、氯仿或三氟乙醇。
2.根据权利要求1所述的微图案化纳米纤维材料，其特征在于，亲水性复合静电纺丝纳米纤维中，支撑性生物活性材料、亲水性生物活性材料与负载修复活性分子的金属有机框架纳米颗粒的质量比为1：0.5～2：0.5×10-3～5×10-3。
3.根据权利要求1所述的微图案化纳米纤维材料，其特征在于，静电纺丝的参数为：常温，40%RH～60%RH，施加电压为7～9kV，溶液推进速度为0.01～0.03mL/min，喷头和图案化接收模板之间的距离为8～12cm。
4.根据权利要求1所述的微图案化纳米纤维材料，其特征在于，负载修复活性分子的金属有机框架纳米颗粒的制备步骤包括：金属有机框架纳米颗粒浸于含有修复活性分子的溶液中，修复活性分子负载于金属有机框架纳米颗粒的孔道内，形成负载修复活性分子的金属有机框架纳米颗粒。
5.根据权利要求4所述的微图案化纳米纤维材料，其特征在于，金属有机框架纳米颗粒的制备步骤包括：将金属盐与有机配体分子溶于有机溶剂中，恒温并搅拌条件下反应制备金属有机框架纳米颗粒。
6.权利要求1-5任一项所述微图案化纳米纤维材料在制备创伤修复材料方面的应用。
7.一种生物材料，具有创伤修复活性，其特征在于，含有权利要求1-5任一项所述微图案化纳米纤维材料。
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