KR20130029291A

KR20130029291A - 조직 재생 유도 구조물

Info

Publication number: KR20130029291A
Application number: KR1020110092650A
Authority: KR
Inventors: 이진호; 오세행; 김진래
Original assignee: 한남대학교 산학협력단
Priority date: 2011-09-14
Filing date: 2011-09-14
Publication date: 2013-03-22
Also published as: KR101293209B1

Abstract

본 발명은 비대칭 구조를 가지는 다공성 막, 헤파린 및 생리활성물질을 포함하는 조직 재생 유도 구조물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 제조된 막의 양 표면의 기공 구조가 상이한 비대칭 구조를 가지는 다공성 막은 선택적 투과성 및 친수성을 나타내어, 골 및 신경의 재생을 방해하는 섬유결합조직의 결손부위로의 침투를 억제하나 이들의 재생에 필수적인 산소/영양액은 결손부위로 공급이 가능하므로, 골 및 신경의 재생에 좋은 환경을 제공한다. 뿐만 아니라, 골 및 신경의 재생을 보다 촉진시킬 수 있는 생리활성물질의 결손부위로의 지속적인 공급이 가능하므로 조직 재생 유도 구조물이 필수적으로 필요한 고도로 분화된 다양한 조직들(골, 신경, 인대/건 등)의 재생에 매우 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

조직 재생 유도 구조물 {structure for guided tissue regeneration}

본 발명은 조직 재생 유도 구조물에 관한 것이다.

인간의 건강한 삶의 유지에 절대적인 역할을 하는 골 및 신경을 포함하는 다양한 조직 등의 손상은 교통사고, 생활수준 향상에 따른 빈번한 스포츠 활동에 의한 결손, 환경오염/서구화된 생활습관에 의해 발생빈도가 높아지고 있는 암 조직의 제거, 성형을 목적으로 한 수술 및 다양한 수술의 부작용 등에 의해 빈번히 발생되고 있다. 이렇게 손상된 조직의 재생은 삶의 질과 밀접한 관계를 가지고 있으므로 임상의학 분야에서 매우 중요한 위치를 차지하고 있다.

인체 내에 존재하는 조직 혹은 장기는 일반적으로 고도로 분화된 세포조직으로 이루어져 있으며, 이들이 손상되는 경우 이보다 덜 분화된 상피조직, 섬유결합 조직에 의해 손상부위가 먼저 채워져 조직 혹은 장기의 재생을 방해하게 된다.

따라서 조직 및 장기의 재생에 부정적인 역할을 하는 상피조직 및 섬유결합 조직의 침투를 물리적으로 차단하고, 조직 및 장기의 재생에 유용한 세포 및 물질만을 결손부에 접근시켜 원하는 조직 및 장기로 재생을 유도하는 치료술을 조직유도재생술 [guided tissue regeneration (GTR)]이라 하며, 이에 사용되는 막을 조직유도재생막 (GTR membrane)이라 한다. 이들 조직유도재생막 중, 골 재생 유도를 위한 시트형태의 골유도재생막 [guided bone regeneration (GBR) membrane]과 신경 재생 유도를 위한 튜브형태의 신경유도재생관 [nerve guided conduit (NGC)]이 가장 널리 사용되고 있다.

통상적으로, 조직유도재생막으로 사용되기 위해서는 아래와 같은 요건을 충족해야 한다.

1) 생체적합성을 가져야 하며,

2) 상피조직의 이동을 방지하고 섬유결합 조직의 결손부로의 침투를 방지하기 위해 적절한 폐쇄성을 지녀야 하고,

3) 결손부에서 조직 재생이 일어날 공간을 유지시킬 수 있을 정도의 기계적 물성을 가져야 하며,

4) 조직 재생에 필수적인 영양분 및 산소가 쉽게 투과되어야 하고,

5) 주변 정상조직의 손상 방지 및 시술 용이성 부여를 위해 유연한 특성을 지녀야 하며,

6) 조직 재생 후 재수술을 통한 제거가 필요 없도록 생분해성을 지녀야 한다.

조직유도재생막으로 사용되는 재료는 크게 인체조직; 콜라겐(collagen), 알긴산(alginate) 등과 같은 천연고분자와; 테프론(expanded-polytetrafluoro ethylene, ePTFE), 폴리락틱산[poly(lactic acid), PLA], 폴리글리콜산[poly(glycolic acid), PGA] 등의 합성고분자로 나눌 수 있다. 인체조직을 이용하는 경우, 조직의 공급이 충분하지 않으며, 자가이식(autograft)이 아닌 경우 면역반응에 의해 사용이 제한적이고, 천연고분자의 경우 물성이 약하며 체내에서 쉽게 흡수(absorption)되어 조직유도재생막으로의 기능을 충족시키기에는 아직까지 해결해야 할 점이 많은 것으로 알려져 있으며, 생체적합성이 우수한 합성고분자인 ePTFE를 이용한 연구로부터 조직 재생에 긍정적인 결과들이 발표되고 있으나, 체내에서 분해되지 않아 조직이 재생된 후, 다시 이차수술을 통해 제거해야 된다는 단점을 안고 있다.

최근 생분해성 합성고분자에 관한 지속적인 연구에 힘입어 생분해성 합성고분자를 기초로 한 다양한 조직유도재생막 제품이 출시되고 있지만 (Guidor, Vicryl Periodontal Mesh, Biomesh 등), 합성고분자의 딱딱한(brittle) 성질로 인한 시술의 어려움과 이들이 소수성을 나타내므로 (다공성을 가지는데도 불구하고) 조직유도재생막을 통해 결손부로 영양액 및 산소의 공급을 유도하는 데 많은 어려움 등 조직유도재생막으로의 가장 기본적인 요구사항도 충족시키지 못하고 있는 실정이며, 이로 인해 생분해성 합성고분자의 조직 재생 후 재수술이 필요없는 장점에도 불구하고 그 사용이 매우 제한적이었다. 더욱이 조직 재생에 필수적인 영양액과 산소의 투과는 가능하지만 섬유 결합조직(fibrous scar tissue)의 침투를 억제할 수 있는 성질을 동시에 지니는 선택적 투과막의 제조는 거의 전무한 실정이다.

이상과 같이, 조직유도재생막을 이용하여 조직/장기 재생을 위한 많은 연구가 진행되고 있음에도 불구하고 상기한 문제점을 개선하지 못해, 아직까지 만족할 만한 결과는 제시하지 못하고 있는 실정이다.

따라서 본 발명에서는 종래 골, 신경 등을 포함하는 고도로 분화된 조직의 재생을 위해 사용되는 치료기법들이 가지는 여러 가지 부작용 및 문제점들을 해결함은 물론, 골, 신경이 보다 효과적으로 재생될 수 있는 미세환경을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 목적은 영양액과 산소는 효과적으로 투과시키되, 골, 신경 등을 포함하는, 고도로 분화된 조직 재생에 방해가 되는 다른 조직들 (예를 들어, 섬유결합 조직 등)의 침투는 효과적으로 억제할 수 있는 선택적 투과성을 가질 뿐만 아니라 골, 신경의 재생을 촉진할 수 있는 생리활성물질이 서방형으로 공급될 수 있는 조직 재생 유도 구조물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 사용된 재료에 의한 부작용이 없으며, 조직 재생 후 제거가 필요 없는 생분해성 재료로 구성된, 효과적인 조직 재생 능력을 가지는 조직 재생 유도 구조물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 조직 재생 유도 구조물은 비대칭 구조를 가지는 다공성 막, 헤파린 및 생리활성물질을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 비대칭 구조를 가지는 다공성 막은 시트 형태 또는 튜브 형태일 수 있다.

상기 비대칭 구조를 가지는 다공성 막은 기공 크기가 서로 상이한 2층 이상의 층을 포함할 수 있다.

상기 비대칭 구조를 가지는 다공성 막은 생분해성 고분자와 친수성 고분자를 포함할 수 있다.

상기 비대칭 구조를 가지는 다공성 막을 구성하는 생분해성 고분자는 폴리락틱산, 폴리글리콜산, 폴리락틱산-글리콜산 공중합체, 폴리다이옥산온, 폴리카프로락톤, 폴리락틱산-카프로락톤 공중합체, 폴리다이옥산온-카프로락톤 공중합체, 폴리하이드록시부티릭산-하이드록시발러릭산 공중합체 및 폴리포스포에스터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.

또한, 상기 비대칭 구조를 가지는 다공성 막을 구성하는 친수성 고분자는 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드공중합체, 폴리에틸렌옥사이드-폴리락틱산 공중합체, 폴리에틸렌옥사이드-폴리락틱글리콜산 공중합체, 폴리에틸렌옥사이드-폴리카프로락톤 공중합체, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리비닐알콜, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르류, 폴리옥시에틸렌 케스터 오일 유도체류, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스터류 및 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.

상기 비대칭 구조를 가지는 다공성 막은 생분해성 고분자 100 중량부에 대하여 친수성 고분자를 0.1~20 중량부로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 비대칭 다공성 튜브는 상기 시트 형태의 비대칭 다공성 막을 튜브 형태로 권취시킨 것일 수 있다.

상기 헤파린은 상기 비대칭 구조를 가지는 다공성 막에 포함된 친수성 고분자의 에테르(-O-) 그룹과 상기 헤파린의 카르복실산(-COOH) 그룹 간의 수소 결합을 형성하여 포함될 수 있다.

상기 생리활성물질은 상기 헤파린의 카르복실산(-COOH) 그룹과 생리활성물질의 양이온 간의 이온 결합을 형성하여 포함될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 생리활성물질은 fibroblast growth factors(FGFs), vascular endothelial growth factor(VEGF), nerve growth factor(NGF), brain-derived neurotrophic factor(BDNF), transforming growth factors(TGFs), bone morphogenetic proteins(BMPs), epidermal growth factor EGF), insulin-like growth factor(IGF), 및 platelet-derived growth factor(PDGF)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 실시예에 따르면, 표면의 다공 구조가 상이한 비대칭 구조를 가지는 시트 형태의 다공성 막은 선택적 투과성 및 친수성에 의해 고도로 분화된 골 조직의 재생을 억제하는 섬유결합 조직의 침투는 억제하고 산소와 영양액의 투과가 가능하여 골 조직의 재생에 적합한 환경의 제공이 가능하다.

또한, 표면의 다공 구조가 상이한 비대칭 구조를 가지는 시트 형태의 다공성 막의 권취를 통해 튜브 형태로 제조가 가능하며, 시트 형태의 다공성 막과 동일한 특성 (선택적 투과성 및 친수성)에 의해 신경 조직의 재생에 알맞은 미세 공간의 제공이 가능하다.

또한, 표면의 다공 구조가 상이한 비대칭 구조를 가지는 시트 형태 및 튜브 형태의 다공성 막은 생체적합성이 우수한 생분해성 고분자 재료로 구성되어 있으며, 제조과정에서 사용되는 용매 또한 인체에 일정량 사용이 가능할 정도의 생체적합성 용매를 사용하므로, 제조된 시트 형태 및 튜브 형태의 다공성 막의 체내 도입 시 어떠한 부작용도 유발하지 않을 뿐만 아니라 재수술을 통해 이식물을 제거해야 하는 번거로움을 피할 수 있다.

또한, 비대칭 다공 구조를 가지는 시트 형태 및 튜브 형태의 다공성 막에 생리활성물질을 도입시킴으로써 골 및 신경 조직을 보다 효과적으로 재생 유도할 수 있는 구조물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 조직 재생 유도 구조물에서 생리활성물질은 30일 이상의 기간 동안 서방성 방출 거동을 나타내는 효과를 가진다.

따라서, 표면의 다공 구조가 상이한 비대칭 구조를 가지는 시트 형태 및 튜브 형태의 다공성 막에 생리활성물질을 탑재시킨 조직 재생 유도 구조물은 생분해성, 선택적 투과성, 친수성 및 생리활성물질의 손상조직 부위에 서방형으로 공급이 가능하여 골 및 신경의 재생을 보다 효과적으로 유도할 수 있는 조직 재생 유도 구조물로 이용될 수 있다.

도 1은 비대칭 구조의 시트 형태 다공성 막 제조 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 비대칭 구조의 시트 형태 다공성 막을 이용한 비대칭 구조의 튜브 형태 다공성 막의 제조 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 1~3에 따라 제조된 비대칭 구조의 시트 형태 다공성 막의 주사전자현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 4~6에 따라 제조된 비대칭 구조의 튜브 형태 다공성 막의 주사전자현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 1~3 및 비교예 1의 비대칭 구조의 시트 형태 다공성 막에 도입된 헤파린의 탑재량 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 실시예 4~6 및 비교예 2의 제조된 비대칭 구조의 튜브 형태 다공성 막에 도입된 헤파린의 탑재량 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 실시예 3과 비교예 3의 헤파린 도입 유무에 따른 생리활성물질 (BMP-2)의 도입량을 측정한 결과이다.
도 8은 실시예 6과 비교예 4의 헤파린 도입 유무에 따른 생리활성물질(NGF)의 도입량을 측정한 결과이다.
도 9는 실시예 3과 비교예 3의 생리활성물질(BMP-2)의 방출 특성 측정 결과이다.
도 10은 실시예 6과 비교예 4의 생리활성물질(NGF)의 방출 특성 측정 결과이다.
도 11은 실시예 3 및 대조군 1~2의 조직 재생 유도 구조물에서 생리활성물질(BMP-2) 도입 유무에 따른 골재생 효능 평가 결과이다 (동물실험; Masson's Trichrome staining).
도 12는 실시예 6 및 대조군 3의 조직 재생 유도 구조물에서 생리활성물질(NGF) 도입 유무에 따른 신경재생 효능 평가 결과이다 (동물실험; anti-neurofilament staining).
도 13은 실시예 6 및 대조군 3의 조직 재생 유도 구조물에서 생리활성물질(NGF) 도입 유무에 따른 신경재생 효능 평가 결과이다 (동물실험; TEM).

이하에서 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 다양한 조직의 재생을 유도할 수 있는 구조물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조직 재생 유도 구조물은 비대칭 구조를 가지는 다공성 막, 헤파린, 및 생리활성물질을 포함한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 비대칭 구조를 가지는 다공성 막은 비대칭 구조의 시트 형태 및 튜브 형태의 다공성 막 중에서 선택하여 사용할 수 있다.

먼저, 상기 비대칭 구조의 시트 형태 다공성 막은 상부와 하부의 기공 크기가 서로 상이한 2층 이상의 층을 포함할 수 있다. 즉, 상기 비대칭 다공성 막의 상부층은 상대적으로 평균 기공 크기가 작아 조밀한 구조가 형성되고, 그 하부층은 상대적으로 평균 기공 크기가 큰 다공 구조를 가진 비대칭 구조를 가지는 고분자 막을 사용한다.

상기 비대칭 다공성 막의 상부층은 평균 기공 크기(average pore size)가 1~3,000 ㎚, 보다 바람직하기로는 5~100 nm를 가진다. 따라서, 조직 재생에 필요한 영양액과 산소는 투과시키고, 상대적으로 수 천 nm (3,000 nm 초과)로 크기가 큰 섬유결합조직 또는 반흔 조직의 침투는 억제할 수 있는 선택적 투과성을 가지도록 제조하였다. 상기 상부층의 평균 기공 크기가 1 nm 미만이면 영양액의 침투가 어려운 문제가 있고, 평균 기공크기가 3,000 nm를 초과하는 경우에는 조직 재생에 방해가 되는 다른 조직이 침투할 수 있어 바람직하지 못하다.

또한, 비대칭 다공성 막의 하부층은 평균 기공 크기(average pore size)가 5~500 ㎛, 보다 바람직하기로는 50~200 ㎛를 가진다. 하부층의 평균 기공 크기가 상부층보다 상대적으로 큰 구조를 가짐으로써, 제조된 비대칭 다공성 막이 딱딱하지(brittle) 않고 유연성(flexibility)을 가짐으로써 조직으로의 시술과 점착이 용이한 특성을 가진다.

한편, 본 발명에 따른 상기 비대칭 구조의 시트 형태 다공성 막은 상전이 방법에 의하여 제조할 수 있다. 먼저 상기 비대칭 다공성 막 제조를 위하여 고분자 용액을 제조하고, 상기 고분자 용액을 일정 몰드에 채운 후, 이를 비용매에 침지시키면 상전이에 의해 비대칭 구조를 가지는 다공성 막을 제조할 수 있다.

상기 고분자 용액은 생분해성 고분자와 친수성 고분자를 포함할 수 있다.

상기 생분해성 고분자는 폴리락틱산, 폴리글리콜산, 폴리락틱산-글리콜산 공중합체, 폴리다이옥산온, 폴리카프로락톤, 폴리락틱산-카프로락톤 공중합체, 폴리다이옥산온-카프로락톤 공중합체, 폴리하이드록시부티릭산-하이드록시발러릭산 공중합체 및 폴리포스포에스터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.

또한, 상기 친수성 고분자는 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드공중합체, 폴리에틸렌옥사이드-폴리락틱산 공중합체, 폴리에틸렌옥사이드-폴리락틱글리콜산 공중합체, 폴리에틸렌옥사이드-폴리카프로락톤 공중합체, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리비닐알콜, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르류, 폴리옥시에틸렌 케스터 오일 유도체류, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스터류 및 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 고분자 용액은 생분해성 고분자 100 중량부에 대하여 친수성 고분자를 0.1~20 중량부로 포함할 수 있으며, 이때 생체적합성 고분자 용액의 제조 시에는 인체에 무해한 테트라글리콜(tetraglycol), 1-메틸-2-피롤리디논[1-methyl-2-Pyrrolidinone (NMP)], 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO), 트리아세틴(triacetin) 및 벤질 알콜(benzyl alcohol)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 용매에 용해시킨다.

또한, 상기 고분자 막을 침지시키는 비용매는 물(water), 에틸알콜(ethyl alcohol) 및 메틸알콜(methyl alcohol)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 상전이 시간은 1분 ~ 12시간 동안 수행될 수 있다.

상기 몰드에 담겨진 고분자 용액을 비용매에 침지하는 순간, 상기 고분자 용액과 비용매가 만나는 표면에서 고분자의 침전이 형성되기 시작하고, 상기 최초 침전이 형성되는 표면에 미세한 크기의 다공들이 생성되며(상부층), 비용매에서 멀어질수록 고분자 용액의 농도가 감소되어 다공크기가 점점 커지는 다공층(하부층)이 형성된다.

즉, 상기 생체적합성 고분자 용액에서 사용된 용매와 비용매가 교환되면서 상이한 다공 크기를 가지는 다공층을 가진 비대칭 구조를 가지는 다공성 막을 형성하게 된다.

또한, 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 비대칭 구조를 가지는 튜브 형태의 다공성 막은, 상기 비대칭 구조의 시트 형태 다공성 막을 튜브 형태로 권취시킨 것이다.

즉, 상기 제조된 비대칭 구조의 시트 형태 다공성 막을 원통 형상의 금속 지지체를 이용하여 튜브 형태로 권취시킨 다음, 상기 다공성 막이 겹쳐지는 끝단부를 소량의 조직 접착제로 접착시켜 제조할 수 있다.

상기 금속 지지체는 최종 제조되는 비대칭 구조의 튜브 형태 다공성 막의 크기를 결정하는 것으로, 신경 조직의 유도에 사용될 수 있는 정도의 내부 직경, 예를 들어, 1 ~ 10 mm 정도인 것이 바람직하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 조직 재생 유도 구조물은 헤파린을 포함한다. 상기 헤파린은 상기 비대칭 구조를 가지는 비대칭 다공성 막의 다공표면에 노출된 친수성 고분자 부분과 수소 결합을 통해 포함될 수 있다.

즉, 상기 비대칭 구조를 가지는 다공성 막을 헤파린 용액에 일정 시간 침지시키게 되면, 상기 다공성 막의 표면에 노출되어 있는 친수성 고분자의 에테르그룹(-O-)과 헤파린의 카르복실산 그룹(-COOH) 간의 분자 사슬간 수소 결합(intermolecular hydrogen bonding)을 형성하게 된다.

따라서, 상기 비대칭 구조를 가지는 다공성 막에 헤파린을 결합시키는 것은, 상기 헤파린의 음이온(-COOH)과 이하에서 포함되는 생리활성물질이 가지는 양이온 간의 이온 결합을 유도하기 위함이다. 상기 이온 결합에 의해 생리활성물질이 다공성 재료의 표면에 안정하게 탑재될 수 있도록 할 수 있다.

즉, 비대칭 구조를 가지는 다공성 막에 포함되는 친수성 고분자 부분과 헤파린 간의 물리적인 수소 결합을 통하여 다공성 막에서 헤파린의 활성(activity)을 그대로 유지할 수 있기 때문에 이후의 생리활성물질을 비대칭 구조를 가지는 다공성 막 표면에 더 많이 도입할 수 있는 효과를 가진다.

이러한 본 발명에 따른 생리활성물질은 fibroblast growth factors(FGFs), vascular endothelial growth factor(VEGF), nerve growth factor(NGF), brain-derived neurotrophic factor(BDNF), transforming growth factors(TGFs), bone morphogenetic proteins(BMPs), epidermal growth factor(EGF), insulin-like growth factor(IGF), 및 platelet-derived growth factor(PDGF)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 ‘생리활성물질’은 체내의 세포, 조직 및 장기의 기능을 증진 혹은 억제할 수 있는 물질을 의미하는 것으로, 대표적으로 성장인자, 호르몬, 약물 등이 이에 포함된다.

본 발명에 따른 상기 조직 재생 유도 구조물은 골, 신경, 인대/건 등을 포함하는 조직의 재생에 사용될 수 있다.

본 발명의 실시예에 따르면, 상기 조직 재생 유도 구조물를 체내 주입 시 생리활성물질은 1일 ~ 30일 동안 서방형 방출을 나타내는 특징을 가진다.

또한, 본 발명의 생리활성물질이 탑재된 조직 재생 유도 구조물은 상기 생리활성물질의 서방형 방출이 가능하므로 여러 가지 손상된 조직의 재생에 매우 효과적으로 사용될 수 있다.

이상에서 설명한 본 발명에 따른 조직 재생 유도 구조물을 이하의 실시예에 의해 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다. 본 발명의 실시예들은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위하여 제공되는 것이며, 하기 실시예는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 오히려, 이들 실시예는 본 개시를 더욱 충실하고 완전하게 하고, 당업자에게 본 발명의 사상을 완전하게 전달하기 위하여 제공되는 것이다.

실시예 1~3

1) 비대칭 구조를 가지는 시트 형태 다공성 막의 제조

생체적합성·생분해성을 나타내는 폴리카프로락톤(중량평균분자량 ~ 80,000 g/mol, PCL)과 생체적합성·친수성을 나타내는 PEO-PPO 공중합체인 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드 공중합체(Pluronic F127)를 농도를 달리하면서 (1, 3, 5 중량%, 각각 실시예 1, 2, 3) 섞고 이를 인체에 무해한 테트라글리콜에 12 중량%로 용해하고, 이를 90℃로 가열하여 혼합 고분자 용액을 제조하였다.

다음 도 1과 같이, 상기 혼합 고분자 용액을 상온에 보관 중인 일정 틀 (5 x 5 cm; 두께 ~ 0.4 mm)에 캐스팅한 후에 상기 고분자 용액을 포함한 틀을 비용매인 상온의 물에 함침시켰다. 상기 고분자 용액과 물이 접촉하는 순간, 고분자 용액의 표면에서 고분자의 침전이 형성되기 시작되며, 최초 1시간 동안 침전과정을 거친 후, 매 시간마다 과량의 신선한 초순수를 6시간 동안 교환하여 잔여 용매를 완전히 세척하였다. 세척이 끝난 후 진공 건조하여 비대칭 구조를 가지는 시트 형태의 다공성 막을 제조하였다.

2)헤파린의 도입

상기 1)에서 제조된 비대칭 구조를 가지는 각각의 다공성 막에 헤파린을 붙이기 위해, 제조된 다공성 막 (1.2 x 1.2 cm; 두께 ~ 0.4 mm)을 1 mg/ml(2 wt% NaCl 수용액)의 헤파린 용액에 4℃, 3시간 동안 침지시켰다. 그 다음, 상기 다공성 막을 2 wt% NaCl 수용액으로 완전히 세척하고, 동결 건조시켜 헤파린이 도입된 다공성 막을 제조하였다.

3)생리활성물질의 도입

상기 2)에서 제조된 헤파린이 도입된 비대칭 구조를 가지는 각각의 다공성 막에 생리활성물질을 도입시키기 위해, bone morphogenetic protein-2 (BMP-2)가 200n g/ml 농도로 PBS에 용해된 생리활성물질 수용액을 제조하였고, 이를 상기 헤파린이 도입된 다공성 막에 0.2 ml 떨어뜨린 후, 3시간 동안 상온에서 방치하였다. 상기 생리활성물질이 탑재된 다공성 막을 phosphate buffered saline (PBS pH ~ 7.4)로 3회 세척한 후, 탑재된 생리활성물질의 함량을 ELISA kit을 이용하여 정량하여 본 발명에 따른 조직 재생 유도 구조물을 제조하였다.

실시예 4~6

1) 비대칭 구조를 가지는 튜브 형태의 다공성막 제조

다음 도 2의 과정을 따라, 상기 실시예 1~3의 1)에서 Pluronic F127의 농도를 달리하여 제조된 비대칭 구조를 가지는 시트 형태의 다공성 막을 약 1.5 mm 직경의 금속 봉을 이용하여 권취시켰다. 상기 다공성 막의 끝단부에는 조직 접착제인 N-부틸-2-시아노아크릴레이트를 이용하여 접착시켰다. 최종 제조된 비대칭 구조를 가지는 튜브 형태의 다공성 막은 내부 직경이 1.5 mm 이고, 길이는 약 12 mm 이었다.

2) 헤파린의 도입

상기 1)에서 제조된 비대칭 구조를 가지는 각각의 튜브 형태의 다공성 막 (내부 직경 ~1.5 mm, 길이 ~12 mm)에 헤파린의 도입 과정은 상기 실시예 1~3과 동일한 과정으로 진행하였다.

3) 생리활성물질의 도입

상기 2)에서 제조된 헤파린이 도입된 비대칭 구조를 가지는 각각의 튜브 형태의 다공성 막에 생리활성물질을 도입시키기 위해, nerve growth factor(NGF)가 500 ng/ml 농도로 PBS에 용해된 생리활성물질 수용액을 제조하였고, 이를 상기 헤파린이 도입된 다공성 튜브에 1 ml 떨어뜨린 후, 6시간 동안 상온에서 방치하였다. 상기 생리활성물질이 탑재된 다공성 막을 PBS로 5회 세척한 후, 탑재된 생리활성물질의 함량을 ELISA kit을 이용하여 정량하여 본 발명에 따른 조직 재생 유도 구조물을 제조하였다.

비교예 1

1) 친수성 고분자를 포함하지 않는 비대칭 구조를 가지는 시트 형태의 다공성 막 제조

Pluronic F127을 포함하지 않고 PCL만을 이용한 것을 제외하고, 상기 실시예 1~3의 1)의 과정과 동일한 방법을 이용하여 비대칭 구조를 가지는 시트 형태의 PCL 다공성 막을 제조하였다.

2) 헤파린의 도입

상기 비교예 1의 1)에서 제조된 비대칭 구조를 가지는 PCL 다공성 막에 상기 실시예 1~3의 2)와 동일한 과정으로 헤파린을 도입시켰다.

비교예 2

1) 친수성 고분자를 포함하지 않는 비대칭 구조를 가지는 튜브 형태의 다공성 막 제조

상기 비교예 1의 1)에서 제조된 비대칭 구조를 가지는 시트 형태의 PCL 다공성 막으로부터, 상기 실시예 4~6의 1)의 과정으로 비대칭 구조를 가지는 튜브 형태의 PCL 다공성 막을 제조하였다.

2) 헤파린의 도입

상기 비교예 2의 1)에서 제조된 비대칭 구조를 가지는 튜브 형태의 PCL 다공성 막에 상기 실시예 1~3의 2)와 동일한 과정으로 헤파린을 도입시켰다.

비교예 3

비대칭 구조를 가지는 시트 형태의 다공성 막의 제조 및 생리활성물질의 도입은 상기 실시예 1~3과 동일한 과정으로 수행하되, 헤파린 도입 과정은 수행하지 않고 조직 재생 유도 구조물을 제조하였다.

비교예 4

비대칭 구조를 가지는 튜브 형태의 다공성 막 제조 및 생리활성물질의 도입은 상기 실시예 4~6와 동일한 과정으로 수행하되, 헤파린 도입 과정은 수행하지 않고 조직 재생 유도 구조물을 제조하였다.

실험예 1 : 구조 확인

상기 실시예 1~3과 비교예 1에서 제조된 비대칭 구조의 시트 형태의 다공성 막 및 상기 실시예 4~6과 비교예 2에서 제조된 비대칭 구조의 튜브 형태의 다공성 막의 구조를 주사전자현미경으로 측정하였으며, 그 결과를 다음 도 3과 4에 나타내었다.

도 3을 참조하면, 본 발명에 따라 제조된 비대칭 구조를 가지는 시트 형태의다공성 막은 물과 접촉한 면(상부층)이 영양액과 산소의 투과는 가능하지만, 섬유결합조직의 침투는 불가능한 약 200 nm의 다공 크기를 가지고 있고 막의 단면이 영양액과 산소의 투과가 용이한 기둥형태 (column shape)의 다공 구조이며, 하부층은 골 조직과의 점착이 용이한 약 200 ㎛의 다공크기를 가짐을 알 수 있었다.

상기 비교예 1의 Pluronic F127를 포함하지 않는 시트 형태의 다공성 막도, 실시예 1~3의 PCL/Pluronic F127 다공성 막과 동일한 구조를 가짐도 확인할 수 있었다.

또한, 다음 도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 비대칭 구조를 가지는 튜브 형태의 다공성 막은 내부 표면 (선택적 투과층)은 나노미터 단위의 미세한 기공들 (~ 200 nm)이 형성되어 있고, 마이크로미터 크기의 기공들 (~ 200 ㎛)이 외부 표면에 구조적인 결함 없이 형성되어 있음을 확인할 수 있다.

비교예 2의 Pluronic F127를 포함하지 않는 튜브 형태의 다공성 막도 PCL/Pluronic F127 다공성 튜브와 동일한 구조를 가짐도 확인할 수 있었다.

실험예 2 : 헤파린 도입량의 정량 분석

상기 실시예 1~3, 실시예 4~6, 비교예 1~2에서 제조된 비대칭 구조를 가지는 시트 형태 및 튜브 형태의 다공성 막에 도입된 헤파린의 정량적인 분석을 위해 Toluidine blue 염색법을 이용하여 분석하였다.

도 5에서 확인할 수 있듯이, 시트 형태의 다공성 막 표면에 Pluronic F127이 포함된 그룹 (실시예 1~3)이 그렇지 않은 그룹 (비교예 1)에 비해 많은 양의 헤파린이 도입됨을 관찰할 수 있었다.

또한, Pluronic F127의 양이 증가할수록 (실시예 1→3) 헤파린의 도입량이 많아짐도 확인할 수 있었다. 이러한 현상은 다공성 막의 다공 표면에 노출되어 있는 Pluronic F127과 헤파린의 수소결합에 기인한 결과라 판단된다. 즉, 다공성 막의 다공 표면에 존재하는 Pluronic F127이 생리활성물질과의 결합을 유도할 수 있는 다량의 헤파린을 다공 표면에 안정하게 도입할 수 있음을 확인할 수 있었다.

또한, 다음 도 6에서 확인할 수 있듯이, 튜브 형태의 다공성 막 표면에 Pluronic F127이 포함된 그룹 (실시예 4~6)이 그렇지 않은 그룹 (비교예 2)에 비해 많은 양의 헤파린이 도입됨을 관찰할 수 있었다.

상기 튜브 형태의 다공성 막에서 Pluronic F127의 양이 증가할수록 (실시예 4→6) 헤파린의 도입량이 많아짐도 확인할 수 있었으며, 이러한 결과는 상기 시트 형태 다공성 막에서와 일치되는 결과를 나타냈다.

실험예 3 : 생리활성물질의 탑재량 측정

상기 실시예 3, 실시예 6, 비교예 3~4의 비대칭 구조를 가지는 시트 형태 다공성 막에서 헤파린 유무에 따른 생리활성물질의 탑재량을 ELISA 법에 따라 측정하였으며, 그 결과를 다음 도 7과 8에 나타내었다.

비대칭 구조를 가지는 시트 형태 다공성 막의 결과인 다음 도 7을 참조하면, 실시예 3의 헤파린을 포함하는 경우 생리활성물질의 탑재량(BMP-2)은 +320.3 ± 6.5 ng이고, 동일한 구조를 가지더라도 헤파린을 포함하지 않는 비교예 3의 경우 95.3 ± 14.62 ng 이었다. 이러한 결과는 헤파린과 생리활성물질 간의 이온 결합에 의한 결과로 볼 수 있다.

또한, 비대칭 구조의 튜브 형태 다공성 막의 결과인 다음 도 8을 참조하면, 헤파린을 포함하는 실시예 6의 다공성 튜브에 탑재된 생리활성물질(NGF)의 함량은 305.4±64.46 ng이고, 헤파린을 포함하지 않는 비교예 4의 경우 90.25±4.21 ng 이었다. 이러한 결과는, 상기 비대칭 구조의 시트 형태 다공성 막과 일치하는 것이며, 이 역시 헤파린과 생리활성물질 간의 이온결합에 의한 결과로 볼 수 있다.

실험예 4 : 생리활성물질의 방출 거동 분석

상기 실시예 3, 실시예 6, 비교예 3~4의 비대칭 구조를 가지는 다공성 막에서 헤파린 유무에 따른 생리활성물질의 시간에 따른 방출거동을 분석하였다.

상기 재료들을 3 ml의 완충용액 (0.1 wt% BSA를 포함한 PBS)에 함침 시킨 후, 37℃, 50 rpm의 속도로 회전하는 항온조에 일정시간 (28일 이상) 보관하였다. 정해진 시간마다 전체 완충용액을 조심스럽게 채취하고 다시 새로운 완충용액을 교환해 주는 방법으로 시료를 채취하였으며, 얻어진 완충용액으로부터 용출된 생리활성물질의 양을 ELISA kit을 이용하여 분석하였다.

비대칭 구조의 시트 형태 다공성 막의 결과인 다음 도 9를 참조하면, 헤파린이 도입된 다공성 막 (실시예 3)은 생리활성물질의 초기 burst 방출이 현저하지 않았으며, 28일에 걸쳐 264.07 ± 7.07 ng의 생리활성물질이 서방형으로 방출되고 있음을 확인할 수 있었다. 그러나, 헤파린이 도입되지 않은 다공성 막 (비교예 3)의 경우 초기 6일 동안 대부분의 생리활성물질이 초기 burst되는 것을 알 수 있었다.

또한, 비대칭 구조의 튜브 형태 다공성 막의 결과인 다음 도 10을 참조하면, 헤파린이 도입된 다공성 튜브 (실시예 6)는 생리활성물질의 초기 burst 방출이 현저하지 않았으며, 28일에 걸쳐 263±10.5 ng의 생리활성물질이 서방형으로 방출되고 있음을 확인할 수 있었다. 그러나, 헤파린이 도입되지 않은 다공성 튜브( 비교예 4)의 경우 초기 7일 동안 대부분의 생리활성물질이 초기 burst되는 것을 알 수 있었다.

이러한 결과는, 상기 비대칭 구조의 시트 형태 다공성 막과 일치하는 것이며, 이 역시 헤파린과 생리활성물질 간의 이온결합에 의한 결과로 볼 수 있다.

실험예 5 : 조직 재생 유도 구조물의 골 재생 유도

실시예 3에 따라 제조된 조직 재생 유도 구조물의 골 재생 효과를 확인하기 위해, 체중 200~250 g의 쥐 [Sprague-Dawley (SD) rat]를 모델 동물로 사용하였다. 실험 동물의 마취를 위해 tiletamine/zolazepam (10 mg/kg; Zoletil 50, Virbac Laboratories, France) 과 2% xylazine hydrochloride (2 mg/kg, Rumpun, Byely Co., Korea)이 사용되었다. 사용 동물의 이마 부분 중앙의 피부를 4 cm 정도 절개한 후, 골막(periosteum)을 절개하여 옆으로 제쳐놓은 상태에서 뇌경막과 두개 정중부를 지나는 혈관의 손상을 주의하면서 직경 8 mm 치과용 펀치톱을 이용하여 임계 결손크기 (critical size defect)인 지름 8 mm 크기 [J. P. Schmitz et al., Clin. Orthop. Relat. Res., 205, 299 (1986)]의 골 결손부를 형성시킨 후, 실시예 1에서 제조한 골유도재생막 (φ 12 mm)으로 결손 부위를 덮어 주고, 골막과 피부를 각각 봉합하였다. 이때, 골유도재생막이 골 결손부 주위의 골조직과 잘 점착하여 막 이 들뜨지 않음을 확인 할 수 있었다.

또한 골 결손을 유발시킨 후, 어떠한 처리도 하지 않고 봉합한 것 (대조군 1이라 함) 및 생리활성물질을 도입하지 않은 비대칭 다공성 막 [비교예 1의 1)에서 제조된 것으로, 대조군 2라 함]도 함께 실험되었다. 일정기간 (4, 8 주) 동안 사육 후, 동물을 희생하여 골 결손부를 채취해 조직검사 (Masson's Trichrome staining)를 통해 생리활성물질이 도입된 비대칭 다공성 막의 사용에 따른 골 재생 효과를 평가하였다.

다음 도 11에 나타난 바와 같이, 대조군 1에 비해 비대칭 다공성 막을 사용한 실시예 3과 대조군 2의 골 재생이 우수한 것을 알 수 있다. 특히 생리활성물질이 도입된 비대칭 다공성 막 (실시예 3)인 조직 유도 구조물에서 가장 우수한 골 재생이 이루어지고 있음을 관찰할 수 있었다. 이러한 현상은 비대칭 다공성 막의 선택적 투과성과 생리활성물질의 서방형 방출에 따른 상호 상승효과 (synergistic effect)로 볼 수 있다.

실험예 6 : 조직 재생 유도 구조물의 신경 재생 유도

실시예 6에 따라 제조된 조직 재생 유도 구조물 (생리활성물질이 도입된 비대칭 다공성 튜브)에 의한 신경 재생 효과를 관찰하기 위해, Sprague-Dawley rat (SD rat, ~250g)을 이용한 동물실험이 수행되었다. 실험 동물의 마취를 위해 tiletamine/zolazepam (10 mg/kg; Zoletil 50VR ,Virbac Laboratories, France), 2 % xylazine hydrochloride (2 mg/kg; RumpunVR , Byely, South Korea)이 사용되었다. 우선 동물의 수술부위 털을 제거하고 포비돈으로 소독하였다. 왼쪽 허벅다리 중앙부의 피부와 근육을 순차적으로 절개하여, 좌골신경 (sciatic nerve)을 찾은 후, 좌골신경의 10 mm를 미세수술용 가위를 이용하여 조심스럽게 제거하였다. 손상된 신경의 근위부(proximal)와 원위부(distal)를 본 발명에서 제조한 비대칭 다공성 튜브로 연결하여 주었다. 이때 다공성 튜브와 신경이 서로 분리되는 것을 방지하기 위해 미세봉합사 (7-0 PDS; Ethicon, USA)를 이용하여 다공성 튜브의 양끝을 신경과 120°간격으로 각각 3 부분을 봉합하여 주었다. 절개된 근육은 5-0 Chromic catgut 봉합사, 피부는 5-0 Nylon 봉합사로 각각 봉합하였다.

또한 신경 결손을 유발시킨 후, 생리활성물질을 도입하지 않은 비대칭 다공성 튜브 [비교예 2의 1)에 의해 제조된 것으로, 대조군 3이라 함]도 함께 실험되었다. 일정기간 (4주) 동안 사육 후, 동물을 희생하여 다공성 튜브가 이식된 신경 결손부를 채취해 조직검사 (Anti-neurofilament 및 TEM)를 통해 비대칭 다공성 튜브의 사용에 따른 신경 재생 효과를 평가하였다.

도 12와 13에 나타난 바와 같이, 생리활성물질의 도입 유무와 상관없이 비대칭 다공성 튜브를 사용한 경우 손상된 신경이 근위부에서 원위부로 시간에 따라 재생됨을 확인하였으며, 특히 생리활성물질이 도입된 비대칭 다공성 튜브에서 보다 우수한 신경재생이 이루어지고 있음을 관찰할 수 있었다. 이러한 현상은 비대칭 다공성 튜브의 선택적 투과성과 생리활성물질의 서방형 방출에 따른 상호상승효과 (synergistic effect)로 볼 수 있다.

이상의 결과들로부터, 본 발명에서 제조한, 생리활성물질이 도입된 비대칭 다공구조를 가지는 시트 형태 및 튜브 형태의 다공성 막은 이들의 독특한 구조적 특성 (선택적 투과성) 및 생리활성물질의 서방형 방출에 의해, 섬유결합조직의 침투 억제, 산소/영양액의 투과 및 특정조직의 재생을 촉진할 수 있는 생리활성물질의 지속적인 공급이 가능하므로 조직 재생 유도 구조물이 필수적으로 필요한 고도로 분화된 다양한 조직들 (골, 신경, 인대/건 등)의 재생에 매우 효과적으로 사용할 수 있다고 판단된다.

Claims

비대칭 구조를 가지는 다공성 막, 헤파린 및 생리활성물질을 포함하는 조직 재생 유도 구조물.
제1항에 있어서,
상기 비대칭 구조를 가지는 다공성 막은 시트 형태 및 튜브 형태인 것을 특징으로 하는 조직 재생 유도 구조물.
제2항에 있어서,
상기 비대칭 구조를 가지는 다공성 막은 기공 크기가 서로 상이한 2층 이상의 층을 포함하는 것을 특징으로 하는 조직 재생 유도 구조물.
제2항에 있어서,
상기 비대칭 구조를 가지는 다공성 막은 생분해성 고분자와 친수성 고분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 조직 재생 유도 구조물.
제4항에 있어서,
상기 생분해성 고분자는 폴리락틱산, 폴리글리콜산, 폴리락틱산-글리콜산 공중합체, 폴리다이옥산온, 폴리카프로락톤, 폴리락틱산-카프로락톤 공중합체, 폴리다이옥산온-카프로락톤 공중합체, 폴리하이드록시부티릭산-하이드록시발러릭산 공중합체 및 폴리포스포에스터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 조직 재생 유도 구조물.
제4항에 있어서,
상기 친수성 고분자는 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드공중합체, 폴리에틸렌옥사이드-폴리락틱산 공중합체, 폴리에틸렌옥사이드-폴리락틱글리콜산 공중합체, 폴리에틸렌옥사이드-폴리카프로락톤 공중합체, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리비닐알콜, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르류, 폴리옥시에틸렌 케스터 오일 유도체류, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스터류 및 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 조직 재생 유도 구조물.
제4항에 있어서,
상기 친수성 고분자는 상기 생분해성 고분자 100 중량부에 대하여 0.1 내지 20 중량부로 포함되는 것을 특징으로 하는 조직 재생 유도 구조물.
제2항에 있어서,
상기 튜브 형태의 다공성 막은 상기 비대칭 구조를 가지는 시트 형태의 다공성막을 튜브 형태로 권취시킨 것을 특징으로 하는 조직 재생 유도 구조물.
제1항에 있어서,
상기 헤파린은 상기 비대칭 구조를 가지는 다공성 막에 포함된 친수성 고분자의 에테르(-O-) 그룹과 상기 헤파린의 카르복실산(-COOH) 그룹 간의 수소 결합을 형성하여 포함되는 것을 특징으로 하는 조직 재생 유도 구조물.
제1항에 있어서,
상기 생리활성물질은 상기 헤파린의 카르복실산(-COOH) 그룹과 생리활성물질의 양이온 간의 이온 결합을 형성하여 포함되는 것을 특징으로 하는 조직 재생 유도 구조물.
제1항에 있어서,
상기 생리활성물질은 fibroblast growth factors(FGFs), vascular endothelial growth factor(VEGF), nerve growth factor(NGF), brain-derived neurotrophic factor(BDNF), transforming growth factors(TGFs), bone morphogenetic proteins(BMPs), epidermal growth factor(EGF), insulin-like growth factor(IGF), 및 platelet-derived growth factor(PDGF)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 조직 재생 유도 구조물.