KR101856016B1

KR101856016B1 - 생리활성인자의 조절된 방출 특성을 가지는 다공성 고분자 매트릭스 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101856016B1
Application number: KR1020160123129A
Authority: KR
Inventors: 김호용; 변준호; 이진호; 오세행
Original assignee: 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2016-09-26
Filing date: 2016-09-26
Publication date: 2018-05-09
Also published as: KR20180033768A

Abstract

본 발명은 표면과 내부에 생리활성인자가 결합되어 있는 다공성 고분자 재료 내부에 물에 대한 용해도가 조절된 하이드로겔을 포함하여 이루어지며, 상기 하이드로겔의 조절된 용해도에 따라 상기 생리활성인자가 소정의 원하는 시점에서 방출되도록 조절 가능한 것을 특징으로 하는 다공성 고분자 매트릭스와 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 표면과 내부에 생리활성인자를 결합시킨 독특한 구조를 가지는 다공성 고분자 재료 안에 친수성이 조절된 온도감응성 하이드로겔을 충진하여 이들의 용해 시간 조절을 통한, 특정 시간의 원하는 시점에서 생리활성인자 방출을 유도할 수 있는 다공성 고분자 매트릭스를 제공할 수 있다. 또한, 상기 특정 시점에서 방출된 생리활성인자는 방출이 시작된 후에는 지속적으로 방출되는 효과를 가진다.

Description

생리활성인자의 조절된 방출 특성을 가지는 다공성 고분자 매트릭스 및 이의 제조방법{Porous polymer matrix having controlled release properties of bioactive substance, and method for preparing thereof}

본 발명은 생리활성인자의 조절된 방출 특성을 가지는 다공성 고분자 매트릭스 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

인체를 이루고 있는 조직이나 기관들은 여러 기능을 하는 만큼 다양한 세포, 세포외기질 (extracellular matrix, ECM) 등으로 복잡하게 이루어져 있다. 즉 체내 조직이나 기관들이 복잡한 만큼 인체 내의 항상성 유지나 상처 수복, 조직 재생 등의 과정에 관여하는 성장인자, 사이토카인, 호르몬 등의 생리활성인자들은 복합적이고 유기적으로 작용되고 있다.

최근 조직공학 분야에서 여러 생리활성인자를 사용하여 치료적 효능을 높이거나 조직의 재생을 유도시키는 시도가 증가하고 있다. 조직공학적으로 여러 생리활성인자를 이용하여 재생 효과를 증진시키기 위하여 고려해야 할 중요한 사항으로는 생리활성인자의 적용량과 작용시간을 고려해야 한다. 즉, 체내 조직 재생이 진행될 때 각 재생 단계별로 작용하는 생리활성인자가 다르므로 생리활성인자의 적절한 방출 기간 및 방출량 조절이 필수적이다.

여러 조직 재생 중 골 재생 과정 또한 다양한 생리활성인자들의 방출/작용기간이 서로 다르다고 알려져 있다.

예를 들어, 골 손상이 일어난 직후에는 platelet-derived growth factor (PDGF), bone morphogenetic protein-2/-7 (BMP-2/-7), fibroblast growth factor (FGF), insulin-like growth factor-1 (IGF-1), interleukin-10 (IL-10), IL-8, tumor necrosis factor-α (TNF-α)와 같은 생리활성인자들이 초기 염증 반응에 관여한다.

또한, 섬유조직 형성 및 가골 형성 과정 동안은 angiopoietin 1, BMP-2/-7, FGF, IGF-1 와 같은 생리활성인자들이 관여한다.

마지막으로, 골 손상 후기의 골 재생과정에서는 vescular endothelial growth factor (VEGF), BMP-2/-7, FGF, IGF-1 와 같은 생리활성인자들이 관여하여 혈관과 골 재생이 본격적으로 이루어진다.

여러 조직공학자들은 이러한 체내의 생리활성인자 환경을 체외에서 모사하고자 하였고, 다양한 생리활성인자를 처리하여 골 재생을 유도하고자 하였다.

그러나 조직공학적으로 골 재생 관련 생리활성인자의 작용을 모사하려는 연구의 대부분은 생리활성인자의 서방형 방출을 고려하지 않거나 (세포배양액에 2~3일에 한번씩 넣어줌. 생리활성인자의 bioactivity가 짧은 시간 내에 사라지므로 생리활성인자의 명확한 작용을 확인하기 힘듦), 생리활성인자를 서방형으로 전달하기 위한 물리/화학적 처리 과정에서 불가피하게 사용되는 독성 화학물질로 인한 세포/조직 독성 및 면역반응 유발가능성으로 인해 실제 인체에 적용은 요원한 것으로 알려져 있다.

또한, Kim et al (비특허문헌 0001)을 비롯한 다양한 연구자들의 심도 깊은 연구를 통해, 체내의 손상 골이 재생하는 과정에서 PDGF는 골 손상 초기부터 3일까지 방출되고, VEGF는 14일까지 방출이 없다가 그 이후부터 방출되며, BMP-2는 손상골의 재생 과정 동안 지속적으로 방출된다고 보고되었으며, 이러한 생리활성인자의 방출 거동 모사를 통해 보다 효율적인 뼈 재생이 가능할 것이라고 제안하고 있다 (도 1 참조).

즉, 각 생리활성인자는 상기 언급한 시점에서 세포로부터 방출되어 원하는 역할을 수행하는 것이 가장 바람직하나, 손상골의 범위가 큰 경우 체내에서 방출되는 상기 생리활성인자는 그 양이 너무 적어 뼈를 재생시키는 데 한계가 있다.

따라서, 고분자 물질과 같은 매트릭스에 생리활성인자를 주입시킨 다음, 이를 손상된 뼈에 인위적으로 주입시켜 부족한 생리활성인자의 역할을 보충하여 보다 효과적으로 뼈를 재생시키고자하는 연구들이 진행되고 있다.

이를 위한 다양한 연구자들의 연구에 생리활성인자의 초기 burst 방출 매트릭스 시스템 및 서방형/지속형 방출 매트릭스 시스템의 복합화 연구가 일부 진행되고 있다 (PDGF의 초기방출 및 BMP-2의 지속방출 모사가능).

그러나, 일정기간 방출이 없다가 필요한 시점에서 특정 생리활성인자를 방출시키는 매트릭스 시스템에 대한 연구는 거의 전무한 실정이다. 즉, 체내의 뼈재생 과정 동안의 생리활성인자의 방출거동을 보다 정밀하게 모사하는 매트릭스 시스템에 대한 연구는 매우 미미한 실정이다.

예를 들어, 상기 비특허문헌 0001에 언급된 생리활성인자인 VEGF는 골손상 후 주변 세포들로부터 14일 동안 방출이 없다가 그 이후부터 방출되는 특성을 가지는데, 상기 VEGF가 뼈 재생 초기에 방출되면 오히려 뼈 재생을 억제시키는 것으로 알려져 있다. 따라서 적절한 시점에 생리활성인자가 방출되어 각 시점에서 각 생리활성인자가 소정의 역할을 수행하여 뼈 재생을 원활히 수행하는 것이 중요하다.

한국 등록 특허 제10-1293209호 한국 출원 특허 제10-2015-0014179호

Dual-controlled release system of drugs for bone regeneration (Advanced Drug Delivery Reviews, 94, 2015, 28-40) Fracture healing as a post-natal developmental process: Molecular, spatial, and temporal aspects of its regulation (Journal of Cellular Biochemistry, 88, 2003, 873-884) Binary mixture micellar systems of F127 and P123 for griseofulvin solubilisation (Polimeros, 25, 2015, 433-439)

이에 본 발명에서는 기존 생리활성인자들을 이용하여 뼈 재생 과정에서 서방형 방출을 위한 매트릭스 시스템의 임상 적용 한계 극복 및 뼈 재생 과정에서 일어나는 생리활성인자 방출 거동을 정밀하게 모사하기 위한 것으로서,

본 발명의 목적은 생리활성인자가 탑재되는 고분자 매트릭스 자체의 독특한 구조만으로 생리활성인자를 원하는 시점에서 방출시킬 수 있는 생리활성인자의 조절된 방출 특성을 가지는 다공성 고분자 매트릭스를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 특성을 가지는 다공성 고분자 매트릭스의 제조방법을 제공하는 데도 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 생리활성인자의 조절된 방출 특성을 가지는 다공성 고분자 매트릭스는 표면과 내부에 생리활성인자가 결합되어 있는 다공성 고분자 재료 내부에 물에 대한 용해도가 조절된 하이드로겔을 포함하여 이루어지며, 상기 하이드로겔의 조절된 용해도에 따라 상기 생리활성인자가 소정의 원하는 시점에서 방출되도록 조절 가능한 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 다공성 고분자 재료는 고분자 표면과 내부 전체에 걸쳐 다공성 구조를 가지며, 상기 내부의 다공성 구조는 다수의 다공들이 서로 연결되어 다발 형태를 이루고, 상기 다발들이 다시 치밀한 구조로 연결되어 그물 형태의 구조를 가지며, 상기 고분자 표면과 내부의 치밀한 다공들에는 생리활성인자가 결합되어 있는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 다공성 고분자 재료는 폴리카프로락톤 [poly(ε-caprolactone)], 폴리디옥사논 (polydioxanone), 폴리락틱산 [poly(lactic acid)], 폴리글리콜산 [poly(glycolicacid)], 폴리락틱산-글리콜산 공중합체 [poly(lactic acid-co-glycolic acid)], 폴리하이드로시부티레이트 ([poly(β-hydroxybutyrate)]와 폴리하이드록시부티릭산-하이드록시발러릭산 공중합체 (polyhydroxybutyric acid-cohydroxyvalericacid), 폴리(γ-에틸 글루타메이트) [poly(γ-ethyl glutamate)], 및 폴리안하이드라이드 공중합체 (polyanhydrides)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 하이드로겔은 친수성 그룹을 60중량% 이상 포함하여 친수성을 가지는 공중합체와 친수성 그룹을 40중량% 미만 포함하여 소수성을 가지는 공중합체를 포함하며, 상기 친수성을 가지는 공중합체와 소수성을 가지는 공중합체의 함량 조절을 통하여 조절된 용해도를 가지는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 하이드로겔에서 상기 친수성을 가지는 공중합체와 상기 소수성을 가지는 공중합체는 각각 5~50 중량%로 포함되는 것이 바람직하다.

또한, 상기 하이드로겔은 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드 공중합체, 폴리에틸렌옥사이드-폴리락틱산 공중합체, 폴리에틸렌옥사이드-글리콜산 공중합체, 폴리에틸렌옥사이드-폴리락틱글리콜산 공중합체, 폴리에틸렌옥사이드-폴리카프로락톤 공중합체, 및 폴리에틸렌옥사이드-폴리다이옥산온 공중합체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상이 바람직하다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 생리활성인자는 fibroblast growth factors (FGFs), vascular endothelial growth factor (VEGF), nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), transforming growth factors (TGFs), bone morphogenetic proteins (BMPs), epidermal growth factor (EGF), insulin-like growth factor (IGF), 및 platelet-derived growth factor (PDGF) 중에서 선택되는 1종 이상의 성장인자 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

또한, 상기 생리활성인자는 상기 고분자 매트릭스를 체내 주입 후 하이드로겔이 용해되어 상기 다공성 고분자 매트릭스로부터 빠져나간 이후부터 유효농도로 방출되기 시작하며, 상기 생리활성인자의 방출은 서방형으로 지속되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 다공성 고분자 매트릭스의 제조방법은 고분자 표면과 내부 전체에 걸쳐 다공성 구조를 가지며, 상기 내부의 다공성 구조는 다수의 다공들이 서로 연결되어 다발 형태를 이루고, 상기 다발들이 다시 치밀한 구조로 연결되어 그물 형태의 구조를 가지는 다공성 고분자 입자를 제조하는 단계, 상기 고분자 입자 내부의 다공들 속으로 생리활성인자를 주입시키는 단계, 상기 고분자 표면에 생리활성인자를 흡착시키는 단계, 및 상기 생리활성인자가 흡착된 다공성 고분자 입자 내부에 물에 대한 용해도가 조절된 하이드로겔을 주입시키는 단계를 포함하며, 상기 생리활성인자가 소정의 원하는 시점에서 방출되도록 조절 가능한 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 표면과 내부에 생리활성인자를 결합시킨 독특한 구조를 가지는 다공성 고분자 재료 안에 친수성이 조절된 온도감응성 하이드로겔을 충진하여 이들의 용해 시간 조절을 통한, 특정 시간의 원하는 시점에서 생리활성인자 방출을 유도할 수 있는 다공성 고분자 매트릭스를 제공할 수 있다.

또한, 상기 특정 시점에서 방출된 생리활성인자는 방출이 시작된 후에는 지속적으로 방출되는 효과를 가진다.

특별히 본 발명에 따른 다공성 고분자 매트릭스는 골 손상 후기의 골 재생과정에서 작용하는 생리활성인자들의 발출 시점을 조절함으로써 혈관과 골 재생이 인체와 동일한 재생과정을 통해 이루어질 수 있을 것으로 기대할 수 있다.

도 1은 특허문헌 0001에 제시된 체내에서 손상된 골의 재생과정에서 일어나는 생리활성인자의 방출 거동 모사를 나타낸 것이고,
도 2는 실시예 1에 따라 제조된 표면과 내부 구조가 상이한 PCL 다공성 고분자 입자의 표면과 내부의 주사전자현미경 사진을 나타낸 것이고,
도 3은 비교예 1에 따라 제조된 표면과 내부 구조가 동일한 PCL 다공성 고분자 입자의 표면과 내부의 주사전자현미경 사진을 나타낸 것이고,
도 4는 비교예 1~2, 및 실시예 1에 따라 제조된 다공성 고분자 재료의 생리활성인자의 방출 특성을 실험한 결과이다.

이하에서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시예를 설명하기 위하여 사용되며, 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 다른 경우를 분명히 지적하는 것이 아니라면, 복수의 형태를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 경우 "포함한다(comprise)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급한 형상들, 숫자, 단계, 동작, 부재, 요소 및/또는 이들 그룹의 존재를 특정하는 것이며, 하나 이상의 다른 형상, 숫자, 동작, 부재, 요소 및/또는 그룹들의 존재 또는 부가를 배제하는 것이 아니다.

본 발명은 생리활성인자를 원하는 시점에서 방출되도록 생리활성인자의 방출 특성을 조절할 수 있는 구조를 가지는 다공성 고분자 매트릭스와 이의 제조방법에 관한 것이다.

이러한 본 발명에 따른 다공성 고분자 매트릭스는 표면과 내부에 생리활성인자가 결합되어 있는 다공성 고분자 재료 내부에 물에 대한 용해도가 조절된 하이드로겔을 포함하여 이루어지며, 상기 하이드로겔의 조절된 용해도에 따라 상기 생리활성인자가 소정의 원하는 시점에서 방출되도록 조절 가능한 것을 특징으로 한다.

즉, 본 발명에 따른 다공성 고분자 매트릭스는 표면과 내부가 전체적으로 다공성 구조를 가지되, 그 내부는 보다 복잡한 구조로 다공들이 서로 연결되어 있어 마치 그물 구조와 같은 다공성 구조를 가지는 고분자 재료를 제조하고, 여기에 생리활성인자를 그 내부와 표면에 흡착시킨 다음, 상기 다공성 고분자 재료의 복잡한 내부 다공에 물에 대한 용해도가 조절된 하이드로겔을 갇히게 한 구조를 가진다.

따라서, 상기 다공성 고분자 매트릭스를 체내에 주입하게 되면, 상기 복잡한 내부에 갇힌 하이드로겔이 서서히 용해되기 시작하고, 특정 시점 즉, 상기 생리활성인자의 역할이 필요한 시점에서부터 유효농도로 생리활성인자를 방출하게 되는, 상기 하이드로겔이 일정량 용해되어 고분자 재료로부터 빠져나간 후부터 상기 다공성 고분자 재료의 표면 및 내부에 흡착된 생리활성인자가 유효농도로 방출되도록 한 것이다.

상기 “유효농도”란 생리활성인자가 그 역할을 수행할 수 있는 정도의 농도를 의미하며, 이러한 용어는 이 분야의 통상의 기술자들에게는 자명한 정도이다.

본 발명의 일 실시예에 따른 상기 다공성 고분자 재료는 고분자 표면과 내부 전체에 걸쳐 다공성 구조를 가지며, 상기 내부의 다공성 구조는 다수의 다공들이 서로 연결되어 다발 형태를 이루고, 상기 다발들이 다시 치밀한 구조로 연결되어 그물 형태의 구조를 가지며, 상기 고분자 표면과 내부의 치밀한 다공들에는 생리활성인자가 결합되어 있는 것을 특징으로 한다.

그러나 본 발명에 따른 다공성 고분자 재료의 구조는 표면과 내부 전체에 걸쳐 다공성 구조를 가지되, 내부는 상기 하이드로겔을 적절하게 가둘 수 있도록 복잡한 형태를 가져야 한다.

만일, 표면과 같이 단순히 다공성(porous) 구조만을 가질 경우 상기 하이드로겔을 효과적으로 가두지 못하고 상기 다공 구조 사이로 하이드로겔이 쉽게 용해되기 때문에 본 발명에서 원하는 효과를 거둘 수 없다.

뿐만 아니라, 다공성 고분자 재료의 내부 구조가 다공성 구조를 가지지만, 컬럼 형태의 다공성 구조를 가지는 경우에도 상기 컬럼 형태의 다공들 사이로 하이드로겔이 쉽게 용해되어 빠져나올 수 있기 때문에 바람직하지 못하다.

따라서, 표면과 내부에 전체적인 다공성 구조를 가짐은 물론, 그 내부 구조는 본 발명과 같이 복잡하게 다공들이 연결되어 있는 경우에만 본 발명과 같이 그 내부에 포함된 하이드로겔이 특정 시점에서 용해되도록 할 수 있기 때문에 바람직하다고 할 수 있다.

구체적으로는 본 출원인의 기 출원 특허인 (특허문헌 0002)의 한국 출원 특허 제10-2015-0014179호에서 기재된 것과 동일한 구조를 가지며, 상기 특허의 내용은 본 발명에 그대로 포함된다. 또한, 그 제조방법도 상기 특허의 내용을 참조한 것으로, 그 구체 설명은 생략한다.

상기 다공성 고분자 재료는 폴리카프로락톤 [poly(ε-caprolactone)], 폴리디옥사논 (polydioxanone), 폴리락틱산 [poly(lactic acid)], 폴리글리콜산 [poly(glycolicacid)], 폴리락틱산-글리콜산 공중합체 [poly(lactic acid-co-glycolic acid)], 폴리하이드로시부티레이트 ([poly(β-hydroxybutyrate)]와 폴리하이드록시부티릭산-하이드록시발러릭산 공중합체 (polyhydroxybutyric acid-cohydroxyvalericacid), 폴리(γ-에틸 글루타메이트) [poly(γ-ethyl glutamate)], 및 폴리안하이드라이드 공중합체 (polyanhydrides)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상으로서, 폴리에스터계 고분자가 바람직하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 다공성 고분자 재료는 독특한 다공성 구조 형성을 가지나, 이를 위해 어떠한 표면 개질이나, 별도의 첨가제를 사용하지 않고도, 매우 간단한 방법으로 다공성 구조를 제조될 수 있어 공정이 단순하고 제조 단가를 절감시킬 수 있는 효과를 가진다.

본 발명에 따른 상기 다공성 고분자 재료의 표면과 내부 다공들에는 다양한 생리활성인자가 흡착될 수 있다.

상기 생리활성인자는 fibroblast growth factors (FGFs), vascular endothelial growth factor (VEGF), nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), transforming growth factors (TGFs), bone morphogenetic proteins (BMPs), epidermal growth factor (EGF), insulin-like growth factor (IGF), interleukin-10 (IL-10), IL-8, tumor necrosis factor-α (TNF-α), 및 platelet-derived growth factor (PDGF) 중에서 선택되는 1종 이상의 성장인자가 바람직하게 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

특별히 본 발명에 따른 상기 생리활성인자는 뼈 재생에 바람직하게 작용할 수 있는 성장인자들로서, 예를 들어, platelet-derived growth factor (PDGF), bone morphogenetic protein-2/-7 (BMP-2/-7), fibroblast growth factor (FGF), insulin-like growth factor-1 (IGF-1), interleukin-10 (IL-10), IL-8, tumor necrosis factor-α (TNF-α)와 같은 생리활성인자들은 골 손상이 일어난 직후에는 초기 염증 반응에 관여한다.

특별히 뼈 재생 초기와 형성 과정 동안 관여하는 생리활성인자들에 대한 연구는 비교적 활발히 진행되어 있으나, 골 재생 후기의 특정 시점에서 관여하는 생리활성인자를 방출시킬 수 있는 연구들은 전무한 상태라 본 발명은 여기에 초점을 맞춘 것이다.

상기 생리활성인자의 다공성 고분자 재료로의 흡착은 일정한 농도로 생리활성인자 수용액을 제조하고, 상기 제조된 다공성 고분자 재료를 주사기에 넣고 상기 주사기에 양압과 음압을 번갈아 가하면서 다공성 PCL 입자 내부로 상기 생리활성인자 용액이 완전히 침투하도록 하여 내부의 복잡한 다공들로 생리활성인자를 주입시킨다.

그 다음 상기 생리활성인자 수용액을 가한 주사기를 3시간 동안 4℃에서 냉장 보관하고, 주사기에 남은 과량의 생리활성인자 용액을 제거/세척 후, 동결 건조시키면 다공성 고분자 재료의 표면과 내부에 생리활성인자가 흡착된 다공성 고분자 재료를 얻을 수 있다.

본 발명에서는 상기와 같이 생리활성인자가 흡착된 다공성 고분자 내부에 물에 대한 용해도가 조절된 하이드로겔을 포함시킨다.

상기 “물에 대한 용해도가 조절된 하이드로겔”이라는 의미는 친수성 그룹을 60중량% 이상 포함하여 친수성을 가지는 공중합체와 친수성 그룹을 40중량% 미만 포함하여 소수성을 가지는 공중합체를 포함하며, 상기 친수성을 가지는 공중합체와 소수성을 가지는 공중합체의 함량 조절을 통하여 물에 대하여 용해도를 원하는 수준으로 조절할 수 있다는 것을 포함하는 것이다. 또한, 상기 “용해도”는 하이드로겔 상에서 용액 상으로 변환되는 정도를 의미한다.

구체적으로는 본 발명에 따른 하이드로겔은 상기 친수성을 가지는 공중합체와 상기 소수성을 가지는 공중합체를 각각 5~50 중량%로 포함되는데, 그 함량을 다르게 하여 물에 대한 용해도를 조절하는 것이다. 하이드로겔 내에서 상기 각 공중합체의 함량을 의미하며, 나머지는 물이 포함되어 전체 하이드로겔은 100중량%를 이루는 것이다.

즉, 물에 대한 용해도를 높이고자 하는 경우에는 친수성을 가지는 공중합체의 함량을 상기 범위 내에서 높이고, 물에 대한 용해도를 낮추고자 하는 경우에는 소수성을 가지는 공중합체의 함량을 상기 범위 내에서 높임으로서 수행될 수 있다.

따라서, 상기와 같이 다공성 고분자 재료 내부에 포함되는 하이드로겔이 생리활성인자가 가장 효과적으로 작용할 수 있는 시점에서 생리활성인자가 유효농도로 방출되도록 그 용해도를 조절함으로써 생리활성인자의 방출 특성까지 조절할 수 있는 것이다.

이러한 본 발명에 따른 상기 하이드로겔은 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드 공중합체, 폴리에틸렌옥사이드-폴리락틱산 공중합체, 폴리에틸렌옥사이드-글리콜산 공중합체, 폴리에틸렌옥사이드-폴리락틱글리콜산 공중합체, 폴리에틸렌옥사이드-폴리카프로락톤 공중합체, 및 폴리에틸렌옥사이드-폴리다이옥산온 공중합체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하다.

따라서, 본 발명에 따른 다공성 고분자 재료에 흡착된 상기 생리활성인자는 상기 고분자 매트릭스를 체내 주입 후 하이드로겔이 용해되어 상기 다공성 고분자 매트릭스로부터 빠져나간 이후부터 유효농도로 방출되기 시작하며, 상기 생리활성인자의 방출은 서방형으로 지속되는 데 특징이 있다.

즉, 물에 대한 조절된 용해도를 가지는 하이드로겔이 용해되어 다공성 고분자 재료로부터 일정량 빠져나간 후 생리활성인자가 유효농도로 방출되는데, 그 방출이 초기에 완전히 이루어지는 것이 아니라 후기 뼈 재생에 효과적인 시간 동안 지속적으로 방출되는 효과를 가지는 것이다.

또한, 본 발명의 물에 대한 조절된 용해도를 가지는 하이드로겔만을 사용하여, 그 내부 또는 표면에 생리활성인자를 도입시켜 사용하는 경우에는 본 발명과 같이 원하는 시점까지 하이드로겔이 유지하지 못하고 그대로 용해되어 생리활성인자와 함께 초기 방출되어 본 발명에서 원하는 효과를 얻을 수 없다.

따라서, 본 발명과 같은 다공성 구조를 가지는 고분자 재료에 생리활성인자를 흡착시키고, 그 내부에 하이드로겔을 주입시킨 구조의 다공성 고분자 매트릭스를 사용할 때 특정 시점에서 생리활성인자의 지속적인 방출을 유도할 수 있다.

이러한 본 발명에 따른 다공성 고분자 매트릭스의 제조방법은 고분자 표면과 내부 전체에 걸쳐 다공성 구조를 가지며, 상기 내부의 다공성 구조는 다수의 다공들이 서로 연결되어 다발 형태를 이루고, 상기 다발들이 다시 치밀한 구조로 연결되어 그물 형태의 구조를 가지는 다공성 고분자 입자를 제조하는 단계,

상기 고분자 입자 내부의 다공들 속으로 생리활성인자를 주입시키는 단계,

상기 고분자 표면에 생리활성인자를 흡착시키는 단계, 및

상기 생리활성인자가 흡착된 다공성 고분자 입자 내부에 물에 대한 용해도가 조절된 하이드로겔을 주입시키는 단계를 포함하여, 생리활성인자가 소정의 원하는 시점에서 방출되도록 조절 가능한 것을 특징으로 한다.

다공성 고분자 입자의 제조 과정은 본 출원인의 특허문헌 0001에 상세히 기술되어 있다.

또한, 상기 생리활성인자를 다공성 고분자 재료 내부로 주입시키는 단계는 일정한 농도로 생리활성인자 수용액을 제조하고, 상기 제조된 다공성 고분자 재료를 주사기에 넣고 상기 주사기에 양압과 음압을 번갈아 가하면서 다공성 PCL 입자 내부로 상기 생리활성인자 용액이 완전히 침투하도록 하여 내부의 복잡한 다공들로 생리활성인자를 주입시킨다.

그 다음 상기 생리활성인자 수용액을 가한 주사기를 3시간 동안 4℃에서 냉장 보관하고, 주사기에 남은 과량의 생리활성인자 용액을 제거하고, 세척 후, 동결 건조시키면 다공성 고분자 재료의 표면과 내부에 생리활성인자가 흡착된 다공성 고분자를 얻을 수 있다.

상기 동결 건조 과정은 다공성 고분자 재료의 표면과 내부에 흡착된 생리활성인자를 잘 보존시키기 위한 목적과 함께, 차후 하이드로겔을 주입할 수 있는 공간을 확보하기 위한 과정이다. 즉, 다공성 고분자 재료의 내부 안에 물(생리활성인자 수용액의)이 가득 차 있으면 하이드로겔이 들어갈 자리가 없기 때문에 상기 동결 건조 과정을 통하여 다공성 고분자 재료 내부에 있는 물을 제거하여 공간을 확보하기 위함이다.

마지막으로, 생리활성인자가 흡착된 다공성 고분자 재료 내부에 하이드로겔을 주입하는 단계는 먼저 친수성 그룹을 60중량% 이상 포함하여 친수성을 가지는 공중합체와 친수성 그룹을 40중량% 미만 포함하여 소수성을 가지는 공중합체 수용액을 적절한 농도인 5~50중량%로 제조한다.

그 다음, 상기 각 공중합체 수용액을 각각 5~50중량%의 함량 범위 내에서 혼합하여 하이드로겔 혼합액을 제조한다.

그 다음, 상기 제조된 생리활성인자가 탑재된 다공성 고분자 재료를 주사기에 넣고, 여기에 상기 하이드로겔 혼합액을 넣고 4℃에서 양압과 음압을 번갈아 가하면서 상기 하이드로겔 혼합액을 미세입자 내부로 침투시킨다.

상기 하이드로겔 혼합액이 미세입자 내부로 효과적으로 침투되어 미세입자가 전부 주사기의 밑면으로 가라앉은 것이 관찰되면 과량의 하이드로겔 혼합액을 제거한 뒤, 4℃에서 PBS로 세 번 세척해주어 표면에 남은 하이드로겔 혼합액을 제거하여 하이드로겔 혼합액이 내부에 포함된 다공성 고분자 매트릭스를 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 다공성 고분자 매트릭스는 특별히 뼈 재생의 특정 시점에서 부족한 생리활성인자를 제공하여 혈관과 골 재생이 본격적으로 이루어질 수 있도록 작용하는 데 효과적으로 사용될 수 있다.

이하에서 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 이하의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 또한, 이하의 실시예에서는 특정 화합물을 이용하여 예시하였으나, 이들의 균등물을 사용한 경우에 있어서도 동등 유사한 정도의 효과를 발휘할 수 있음은 당업자에게 자명하다.

실시예 1 : 다공성 고분자 매트릭스 제조

1)다공성 미세입자 제조

한국 특허 출원 특허 제10-2015-0014179호의 실시예 1과 동일한 방법에 따라 PCL 다공성 고분자 입자를 제조하였다.

상기 제조된 PCL 다공성 고분자 입자의 표면 및 단면 구조를 전자주사전자현미경(SEM)을 통해 관찰한 결과를 나타낸 다음 도 2를 참조하면, 상기 PCL 다공성 고분자 입자의 표면은 마이크로 크기의 다공으로 이루어져 있고, 입자 내부는 표면으로부터 일정한 거리의 안쪽까지 기둥 형태의 다공성 구조가 형성되어 있고, 그 이후부터는 다수의 다공들이 서로 연결되어 다발 형태를 이루고, 상기 다발들이 다시 치밀한 구조로 연결되어 그물 구조와 같이 형성되어 있음을 확인할 수 있었다.

2)생리활성인자 탑재

1㎍/mL 농도를 가지는 BMP-2 혹은 VEGF 생리활성인자 수용액을 각각 제조하였다.

상기 1)에서 제조된 PCL 다공성 고분자를 주사기에 넣고, 상기 주사기에 상기 생리활성인자 수용액을 넣은 뒤, 주사기에 양압과 음압을 번갈아 가하면서 다공성 PCL 입자 내부로 상기 생리활성인자 용액이 완전히 침투하도록 하였다.

그 다음 상기 생리활성인자 수용액을 가한 주사기를 3시간 동안 4℃에서 냉장 보관하여 다공성 PCL 입자 표면에 BMP-2, VEGF 각각의 생리활성인자가 고정되도록 유도하였으며, 3시간 뒤 주사기에 남은 과량의 생리활성인자 용액을 제거하고 PBS를 넣어 mild shaking을 총 3번을 반복하여 세척을 진행하였다. 세척 후 과량의 PBS를 제거한 뒤 동결 건조하여 최종적으로 VEGF가 탑재된 다공성 미세입자를 얻었다.

3)생리활성인자가 탑재된 다공성 미세입자에 하이드로겔의 주입

Pluronic F127(친수성 그룹인 PEO를 70 중량% 포함하는 친수성 공중합체) 10중량%와 Pluronic P123(친수성 그룹인 PEO를 30 중량% 포함하는 소수성 공중합체)이 25 wt%로 용해되어 있는 하이드로겔 혼합액(10 : 25, w/w)을 제조하였다.

상기 2)에서 제조된 생리활성인자가 탑재된 PCL 다공성 입자를 주사기에 넣고, 여기에 상기 하이드로겔 혼합액을 넣고 4℃에서 양압과 음압을 번갈아 가하면서 상기 하이드로겔 혼합액을 미세입자 내부로 침투시켰다.

상기 하이드로겔 혼합액이 미세입자 내부로 효과적으로 침투되어 미세입자가 전부 주사기의 밑면으로 가라앉은 것이 관찰되면 과량의 하이드로겔 혼합액을 제거한 뒤, 4℃에서 PBS로 세 번 세척해주어 표면에 남은 하이드로겔 혼합액을 제거하여 하이드로겔 혼합액이 담지된 BMP-2 혹은 VEGF 탑재 PCL 다공성 미세입자를 얻었다.

비교예 1 : 마이크로 다공성 미세입자에 생리활성인자 탑재

본 발명에 따른 구조를 가지는 다공성 고분자 입자와 비교하기 위하여 본 발명의 출원인이 기 출원한 한국 등록 특허 제 10-0979628에 제시된 방법에 따라 제조된 PCL 다공성 입자를 이용하였다.

상기 PCL 다공성 입자는 입자 표면과 내부 구조가 모두 다공 크기 25 ~ 53 ㎛의 마이크로 다공성 구조를 가지는 것으로, 제조된 PCL 다공성 입자의 주사전자현미경 사진은 다음 도 3에 나타내었다.

다음 도 3의 사진을 참조하면, 상기 제조된 다공성 고분자는 표면과 내부가 동일한 구조를 가지고 있는 것을 알 수 있다.

상기 구조를 가지는 다공성 고분자에 상기 실시예 1에서와 동일한 과정으로 생리활성인자(PDGF-BB)와 하이드로겔을 주입시켜 고분자 구조에 따른 생리활성인자의 방출 거동을 조사하였다.

비교예 2

상기 실시예 1에서 하이드로겔을 주입시키지 않고 다공성 고분자 재료의 표면과 내부에 생리활성인자(BMP-2)를 탑재시킨 다공성 고분자 재료를 본 발명과 비교하였다.

실험예 1 : 생리활성인자 탑재된 다공성 미세입자의 방출거동 측정

실시예 1과 비교예 1에서 다공성 고분자 매트릭스를 1% 소혈청알부민 (bovine serum albumin, BSA)이 첨가된 PBS 1 mL에 각각 넣고 37℃, 50rpm의 인큐베이터에서 보관하였다. 매일 1% BSA가 첨가된 PBS 1 mL을 정량 채취한 뒤, 새로운 1% BSA가 첨가된 PBS 1 mL을 넣어주었으며, 채취한 1% BSA가 첨가된 PBS는 샌드위치 효소면역반응측정법 (sandwith Enzyme-Linked Immunospecific Assay, sandwich ELISA)으로 방출된 생리활성인자의 양을 확인하였다.

다음 도 4에서와 같이, 비교예 1과 같이 마이크로 다공성 미세입자에 탑재된 PDGF-BB는 3일 동안, 비교예 2와 같이 하이드로겔을 포함하지 않는 다공성 고분자 재료에 탑재된 BMP-2는 35일 동안 지속적으로 방출되었다.

또한, 본 발명 실시예 1에 따른 다공성 고분자 매트릭스에서는 탑재된 생리활성인자인 VEGF가 14일까지는 유효농도 아래로 방출되다가 14일이후부터 유효농도 이상으로 방출되는, 즉 뼈 재생 동안 체내에서 방출되는 생리활성인자의 방출거동과 거의 일치하는 방출거동을 가짐을 확인할 수 있었다.

이러한 결과로부터 본 발명에 따른 다공성 고분자 매트릭스는 표면과 내부에 생리활성인자를 결합시킨 독특한 구조를 가지는 다공성 고분자 재료 안에 친수성이 조절된 온도감응성 하이드로겔을 충진하여 이들의 용해 시간 조절을 통한, 특정 시간의 원하는 시점에서 생리활성인자 방출을 유도할 수 있으며, 상기 특정 시점에서 방출된 생리활성인자는 방출이 시작된 후에는 지속적으로 방출되는 효과를 가짐을 확인하였다.

Claims

고분자 표면과 내부 전체에 걸쳐 다공성 구조를 가지며, 상기 내부의 다공성 구조는 다수의 다공들이 서로 연결되어 다발 형태를 이루고, 상기 다발들이 다시 치밀한 구조로 연결되어 그물 형태의 구조를 가지는 다공성 고분자 재료의 표면과 내부의 다공들에 생리활성인자가 흡착되어 있는 다공성 고분자 재료 내부의 다공에,
친수성 그룹인 폴리에틸렌옥사이드를 60중량% 이상 포함하여 친수성을 가지는 공중합체 5~50중량%와 친수성 그룹인 폴리에틸렌옥사이드를 40중량% 미만 포함하여 소수성을 가지는 공중합체 5~50중량%를 각각 포함하는 하이드로겔이 흡착되어 갇힌 구조로 포함되는 다공성 고분자 매트릭스로서,
상기 하이드로겔은 상기 친수성을 가지는 공중합체와 소수성을 가지는 공중합체의 함량 조절을 통하여 물에 대한 조절된 용해도를 가지며,
상기 하이드로겔의 조절된 용해도에 따라 상기 생리활성인자가 소정의 원하는 시점에서 방출되도록 조절 가능한 것을 특징으로 하는 다공성 고분자 매트릭스.
삭제
제1항에 있어서,
상기 다공성 고분자 재료는 폴리카프로락톤 [poly(ε-caprolactone)], 폴리디옥사논 (polydioxanone), 폴리락틱산 [poly(lactic acid)], 폴리글리콜산 [poly(glycolicacid)], 폴리락틱산-글리콜산 공중합체 [poly(lactic acid-co-glycolic acid)], 폴리하이드로시부티레이트 ([poly(β-hydroxybutyrate)]와 폴리하이드록시부티릭산-하이드록시발러릭산 공중합체 (polyhydroxybutyric acid-cohydroxyvalericacid), 폴리(γ-에틸 글루타메이트) [poly(γ-ethyl glutamate)], 및 폴리안하이드라이드 공중합체 (polyanhydrides)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상인 다공성 고분자 매트릭스.
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 하이드로겔은 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드 공중합체, 폴리에틸렌옥사이드-폴리락틱산 공중합체, 폴리에틸렌옥사이드-글리콜산 공중합체, 폴리에틸렌옥사이드-폴리락틱글리콜산 공중합체, 폴리에틸렌옥사이드-폴리카프로락톤 공중합체, 및 폴리에틸렌옥사이드-폴리다이옥산온 공중합체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상인 것인 다공성 고분자 매트릭스.
제1항에 있어서,
상기 생리활성인자는 fibroblast growth factors (FGFs), vascular endothelial growth factor (VEGF), nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), transforming growth factors (TGFs), bone morphogenetic proteins (BMPs), epidermal growth factor (EGF), insulin-like growth factor (IGF), 및 platelet-derived growth factor (PDGF) 중에서 선택되는 1종 이상의 성장인자 중에서 선택되는 어느 하나인 다공성 고분자 매트릭스.
제1항에 있어서,
상기 생리활성인자는 상기 고분자 매트릭스를 체내 주입 후 하이드로겔이 용해되어 상기 다공성 고분자 매트릭스로부터 빠져나간 이후부터 유효농도로 방출되기 시작하며,
상기 생리활성인자의 방출은 서방형으로 지속되는 것인 다공성 고분자 매트릭스.
고분자 표면과 내부 전체에 걸쳐 다공성 구조를 가지며, 상기 내부의 다공성 구조는 다수의 다공들이 서로 연결되어 다발 형태를 이루고, 상기 다발들이 다시 치밀한 구조로 연결되어 그물 형태의 구조를 가지는 다공성 고분자 입자를 제조하는 단계,
상기 고분자 입자 내부의 다공들 속으로 생리활성인자를 주입시키는 단계,
상기 고분자 표면에 생리활성인자를 흡착시키는 단계, 및
상기 생리활성인자가 흡착된 다공성 고분자 입자 내부에 친수성 그룹인 폴리에틸렌옥사이드를 60중량% 이상 포함하여 친수성을 가지는 공중합체 5~50중량%와 친수성 그룹인 폴리에틸렌옥사이드를 40중량% 미만 포함하여 소수성을 가지는 공중합체 5~50중량%를 각각 포함하며, 상기 친수성을 가지는 공중합체와 소수성을 가지는 공중합체의 함량 조절을 통하여 물에 대한 조절된 용해도를 가지는 하이드로겔을 주입시키는 단계를 포함하는 생리활성인자가 소정의 원하는 시점에서 방출되도록 조절 가능한 것을 특징으로 하는 다공성 고분자 매트릭스의 제조방법.