CN109675089A - 促进皮肤创伤愈合的生物支架材料及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及促进皮肤创伤愈合的生物支架材料及其制备方法和用途，属于医学材料领域。本发明提供了促进皮肤创伤愈合的生物支架材料，它是包含海藻酸或其盐、明胶、+2价钙离子和纳米纤维素的原料制备而成的。本发明还提供了所述生物支架材料的制备方法和用途。本发明生物支架材料不仅具有良好的三维空间结构，同时具有优良的吸水性能、力学强度、生物相容性，可以有效地促进皮肤伤口的愈合，是一种极具潜力的皮肤组织工程支架材料。

Description

促进皮肤创伤愈合的生物支架材料及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及促进皮肤创伤愈合的生物支架材料及其制备方法和用途，属于医学材料领域。
背景技术
近年来，由于烧伤、手术、外伤和糖尿病溃疡等引起的皮肤缺损问题越来越常见。目前用于皮肤修复的传统治疗方法包括自体移植、同种异体移植和外源性皮肤移植等，但缺乏供体和易出现免疫排斥反应等缺点限制了其应用。因此，近年来提出了开发一种在结构、机械性能和生物功能等方面类似于健康皮肤的组织工程支架材料来促进伤口愈合的新的治疗策略。
海藻酸钠与明胶因其优良的亲水性、生物可降解性和生物相容性而被广泛应用于组织工程领域。将海藻酸盐与明胶混合制备得到的复合材料不仅结合了两种材料的优势，同时克服了它们降解速率过快、吸水性过强等缺点，因而得到了越来越多的关注。但上述复合材料仍存在机械强度不足和结构松散等局限性。
因此，开发具备更优良的空间结构、机械强度和生物学性能的组织工程支架材料，并将其应用于皮肤创伤的修复，具有重要意义。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供促进皮肤创伤愈合的生物支架材料，本发明的目的还在于提供该生物支架材料的制备方法和用途。
本发明提供了促进皮肤创伤愈合的生物支架材料，它是包含海藻酸或其盐、明胶、+2价钙离子和纳米纤维素的原料制备而成的。
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：本发明以包含海藻酸或其盐、明胶、+2价钙离子和纳米纤维素的原料制备生物支架材料，其中，海藻酸(或其盐)中的羧基和明胶中的氨基通过静电吸引相互结合从而形成第一层网状支架结构；+2价钙离子的加入能够交联海藻酸(或其盐)分子，从而形成第二层网状结构，由此得到具有良好三维空间结构的组织工程支架材料。在此基础上，发明人创造性地将纳米纤维素引入到上述生物支架中。纳米纤维素是一种碳纳米颗粒，具有低毒性、良好的表面可修饰性和生物相容性等优点。本发明通过在生物支架中引入纳米纤维素，使之与海藻酸(或其盐)结合从而使支架的连接更加紧密，得以进一步促进支架结构的形成、改善材料的力学性能，由此得到具备良好空间结构、吸水性能、力学强度和生物相容性的支架材料。
进一步地，所述原料的重量配比为：海藻酸或其盐0.9～2.16份、明胶0.54～1.8份、+2价钙离子0.14份、纳米纤维素0.005～0.05份。
优选地，所述原料的重量配比为：海藻酸或其盐1.2份、明胶0.6份、+2价钙离子0.14份、纳米纤维素0.005～0.05份。
优选地，所述原料的重量配比为：海藻酸或其盐1.2份、明胶0.6份、+2价钙离子0.14份、纳米纤维素0.025份或0.05份。
进一步地，所述海藻酸或其盐满足以下至少一项：
所述海藻酸或其盐由褐藻制备得到；
所述海藻酸或其盐为直链型；
所述海藻酸或其盐中β-D-甘露糖醛酸单元/α-L-古洛糖醛酸单元摩尔比＝1.56；
所述海藻酸盐为海藻酸钠。
进一步地，所述明胶满足以下至少一项：
所述明胶由猪皮制备得到；
所述明胶为B型明胶；
所述明胶的分子量为50000～100000Da；
所述明胶的bloom值为280～320。
进一步地，所述+2价钙离子以氯化钙、硫酸钙、碳酸钙、醋酸钙中一种或两种以上混合物的形式添加。
优选地，所述+2价钙离子以氯化钙的形式添加。
进一步地，所述纳米纤维素满足以下至少一项：
所述纳米纤维素由棉浆制备得到；
所述纳米纤维素由硫酸水解制备得到；
所述纳米纤维素的长度为150～200nm；
所述纳米纤维素的直径为4～7nm；
所述纳米纤维素的结晶度为90.3％；
所述纳米纤维素的磺酸基含量为0.657mmol/g；
所述纳米纤维素的zeta电位为-64.3mV。
进一步地，所述的生物支架材料由下述方法制备得到：取各重量配比的海藻酸或其盐、明胶和纳米纤维素，分散于溶剂中，混合均匀，成膜，干燥，将所得材料用+2价钙离子溶液交联，即得。
优选地，分别将海藻酸或其盐、明胶、纳米纤维素各自分散于溶剂中，再混合均匀。
进一步地，所述方法满足以下至少一项：
将海藻酸或其盐分散于溶剂中，制备成浓度为3wt％的溶液；
将明胶分散于溶剂中，制备成浓度为3wt％的溶液；
于60℃将明胶分散于溶剂中；
将纳米纤维素分散于溶剂中，制备成浓度为0.1～1wt％的溶液；
所述溶剂为水；
于常温下混合均匀；
混合溶液用超声处理1小时；
所述成膜采用倾倒成膜的方式；
所述干燥的条件为：于45℃烘箱中干燥2天；
所述+2价钙离子溶液为水溶液；
所述+2价钙离子溶液的浓度为2wt％；
将所得材料用+2价钙离子溶液浸泡交联30分钟；
将浸泡后所得材料干燥直恒重，即得所述生物支架材料。
根据本发明的一些实施例，生物支架由下述方法制备得到：分别配制浓度为3wt％的海藻酸钠水溶液、浓度为3wt％的明胶水溶液和浓度为0.1～1wt％的纳米纤维素溶液，将三种溶液成比例混合，倾倒成膜，干燥，经2wt％的CaCl2溶液交联，干燥，即得。发明人经过考察原料浓度发现，在上述浓度范围内成膜，成膜效果较好。
本发明提供了所述生物支架材料的制备方法，包括如下步骤：取各重量配比的海藻酸或其盐、明胶和纳米纤维素，分散于溶剂中，混合均匀，成膜，干燥，将所得材料用+2价钙离子溶液交联，即得。
优选地，分别将海藻酸或其盐、明胶、纳米纤维素各自分散于溶剂中，再混合均匀。
进一步地，所述的制备方法满足以下至少一项：
将海藻酸或其盐分散于溶剂中，制备成浓度为3wt％的溶液；
将明胶分散于溶剂中，制备成浓度为3wt％的溶液；
于60℃将明胶分散于溶剂中；
将纳米纤维素分散于溶剂中，制备成浓度为0.1～1wt％的溶液；
所述溶剂为水；
于常温下混合均匀；
混合溶液用超声处理1小时；
所述成膜采用倾倒成膜的方式；
所述干燥的条件为：于45℃烘箱中干燥2天；
所述+2价钙离子溶液为水溶液；
所述+2价钙离子溶液的浓度为2wt％；
将所得材料用+2价钙离子溶液浸泡交联30分钟；
将浸泡后所得材料干燥直恒重，即得所述生物支架材料。
本发明提供了所述生物支架材料在制备促进皮肤创伤愈合的敷料或药品中的用途。
优选地，所述皮肤创伤为割伤。
本发明提供的生物支架材料，不仅具有良好的三维空间结构，同时具有优良的吸水性能、力学强度、生物相容性，可以有效地促进皮肤伤口的愈合，是一种极具潜力的皮肤组织工程支架材料。
附图说明
图1为试验例1中生物支架材料的扫描电镜结果图；
图2为试验例2中生物支架材料的吸水性能图；
图3为试验例3中生物支架材料的力学强度性能图；
图4为试验例4中小鼠胚胎成纤维细胞共培养结果图；
图5为试验例5中大鼠皮肤修复实验结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
以下使用的海藻酸钠(SA)和明胶(Ge)由美国Sigma-Aldrich公司提供。纳米纤维素(CNC)由中国天津浩加生物科技有限公司提供。海藻酸钠由褐藻制备得到，为直链型，其结构中β-D-甘露糖醛酸单元/α-L-古洛糖醛酸单元摩尔比＝1.56。明胶由猪皮制备得到，为B型明胶，分子量为50000～100000Da，其bloom值为280～320。纳米纤维素由棉浆通过硫酸水解制备得到，长度为150～200nm，直径为4～7nm，结晶度为90.3％，磺酸基含量为0.657mmol/g，zeta电位为-64.3mV，所用纳米纤维素为固含量为1.2％左右的悬浮液。
实施例1海藻酸钠/明胶生物支架材料的制备
将一定量的海藻酸钠溶于去离子水中，得到3wt％浓度的SA溶液。将一定量的明胶溶于去离子水中，在60℃下持续搅拌得到3wt％浓度的Ge溶液。将海藻酸钠与明胶溶液成分按照下表所示比例混合，常温下持续搅拌直至得到均质溶液。经超声处理、倾倒成膜、烘箱干燥后，将所形成的膜用20ml的CaCl2溶液(2wt％)浸泡30分钟，继而用去离子水洗涤三次以除去多余的游离试剂。最后，将制备得到的材料再次干燥，即可形成海藻酸钠/明胶膜。
表1采用不同原料配比制备海藻酸钠/明胶生物支架材料
SA/Ge 3％SA溶液剂量(mL) 3％Ge溶液剂量(ml)
1:2 30 60
1:1 45 45
2:1 60 30
4:1 72 18
实施例2海藻酸钠/明胶/纳米纤维素生物支架材料的制备
将一定量的海藻酸钠溶于去离子水中，得到3wt％浓度的SA溶液。将一定量的明胶溶于去离子水中，在60℃下持续搅拌得到3wt％浓度的Ge溶液。将1wt％浓度的CNC溶液稀释，分别获得0.1wt％和0.5wt％终浓度的CNC溶液。将三种成分(40mlSA,20mlGe,5mlCNC)混合，常温下持续搅拌直至得到均质溶液。超声处理1小时后，将混合溶液倒入培养皿(d＝90mm)中成膜，并置于45℃的烘箱中干燥2天。然后，将所得材料用20ml的CaCl2溶液(2wt％)浸泡30分钟，以实现海藻酸钠与Ca2+的交联。用去离子水洗涤三次以除去多余的游离试剂。最后，将制备得到的支架材料再次放入烘箱中干燥直至重量不变，即可形成本发明生物支架材料。
表2采用不同原料配比制备生物支架材料
以下通过试验例证明本发明的有益效果。其中，实验动物为SD大鼠，4-6周龄，由中国成都达硕实验动物有限公司提供；实验使用的本发明生物支架材料均根据上文实施例2记载的方法制备。
试验例1本发明生物支架材料的形态学表征
本试验的目的是对支架材料进行形态学的表征，进而观察材料的三维空间结构。将冻干后的生物支架用扫描电子显微镜(SEM)在15kV的加速电压下进行表征，观察横截面形态。同时，应用软件Smile-View计算材料的平均孔径和尺寸偏差。结果可见图1，其中，图1a显示不含CNC的SA/Ge支架的SEM图像；图1b显示含5ml浓度为0.1wt％CNC的SA/Ge/CNC支架的SEM图像；图1c显示含5ml浓度为0.5wt％CNC的SA/Ge/CNC支架的SEM图像；图1d显示含5ml浓度为1wt％CNC的SA/Ge/CNC支架的SEM图像。
扫描电镜图像显示了本发明生物支架多孔有序的网络结构。随着CNC的浓度从0增加到1wt％，孔径大小从239.59±51.25μm缩小到120.83±16.21μm。0.1％CNC组和0.5％CNC组的孔径分别为201.38±27.55μm和183.03±31.47μm。
以上实验结果表明，本发明生物支架材料为多孔有序的网络结构，而且，通过引入CNC，可以显著增加空间结构中孔的数目并减小孔径大小，从而形成更致密的网状结构。其中，CNC的添加量优选为0.005～0.05份(其余主要原料的相应重量份数为：海藻酸钠1.2份、明胶0.6份、+2价钙离子0.14份)。
本发明生物支架材料网状结构中的孔隙能够提供细胞粘附与增殖的空间，促进细胞的再生；孔隙也为再生组织提供了输送营养物质和废料的通道；较小的孔径利于携载小分子的药物。
试验例2本发明生物支架材料的吸水性能
将干燥的支架材料裁剪成1cm×3cm的长条形并称量记录其重量。然后将样本浸入PBS缓冲液(pH＝7.4)中，在规定的时间间隔(t＝5分钟，30分钟，1小时，2小时，6小时和24小时)取出吸水后的样本并用滤纸擦去表面上多余的水。称重后，将样品再次放回PBS溶液中。按照如下公式计算材料的吸水性：吸水性＝(W2-W1)/W1×100％，其中W1和W2分别代表样本吸水前和吸水后的重量。结果见图2。
从图2可见，不含CNC的SA/Ge支架最快实现吸水平衡。随着CNC浓度的增加，材料的吸水性能逐渐下降。不含CNC的支架材料的的吸水率为626.65％，而含0.1wt％，0.5wt％，1wt％CNC的支架材料的吸水率分别降低至467.95％，255.63％和206.56％。
以上实验结果表明，CNC的加入能够显著降低材料的吸水性能，从而解决支架材料由于吸水性过强导致伤口脱水、延缓愈合的问题。
试验例3本发明生物支架材料的力学强度
将支架材料裁剪成1cm×3cm的长方形并用游标卡尺测量计算每个样本的平均厚度。使用机械测试仪在拉伸模式下测量样本的拉伸强度。在1mm/min的加载速度下，拉伸样本直至达到其断裂点。根据公式计算材料的拉伸强度：拉伸强度＝断裂时的最大载荷力/拉伸位移。结果见图3。
从图3可见，随着CNC浓度的增加(0,0.1,0.5,1wt％)，力学强度分别上升至18.00MPa，20.50MPa，45.14MPa和43.98MPa。
以上实验结果表明，通过引入CNC，显著提高了本发明生物支架材料的力学强度。
试验例4体外小鼠胚胎成纤维细胞共培养实验
将NIH 3T3细胞(小鼠胚胎成纤维细胞)接种在96孔板中孵育。将灭菌后的本发明支架材料(原料：40ml浓度为3wt％的SA溶液，20ml浓度为3wt％的Ge溶液，5ml浓度为0.5wt％的CNC溶液，20ml浓度为2wt％的CaCl2溶液)浸入DMEM溶液中24小时,以提取浸出液。将获得的浸出液按照浓度梯度进行稀释(0.78,1.56,3.13,6.25,12.5,25,50,75,100mg/mL)。不添加浸出液的组(0mg/mL)作为对照。将各个浓度的稀释液分别加入96孔板中，各组剂量均为100μL。与细胞进行共培养1天后用MTT法测定细胞活性。将3T3细胞接种到本发明支架材料上，孵育3天后，用2.5％的戊二醛溶液固定2小时，然后用PBS溶液(PH＝7.4)冲洗至少3次。最后，通过扫描电镜观察支架材料上的细胞形态。结果见图4。
从图4可见，实验组(支架浸出液的浓度＝0.78,1.56,3.13,6.25,12.5,25,50,75和100mg/mL)的O.D值均高于对照组(支架浸出液的浓度＝0mg/mL)。这表明实验组的支架浸出液中细胞数量多于对照组。扫描电镜图像显示3T3细胞粘附于支架上，呈现聚集生长的状态。
上述实验结果表明，本发明SA/Ge/CNC生物支架材料是无毒的，并且具有促进细胞增殖的能力。
试验例5体内大鼠皮肤修复实验
取12只健康的8周龄SD大鼠。用手术剪在每只大鼠背部的左右两侧各制造一个正方形的伤口(1.5cm×1.5cm)。左侧伤口设为对照组，未用任何材料进行处理。右侧伤口设为实验组，将SA/Ge/CNC支架(原料：40ml浓度为3wt％的SA溶液，20ml浓度为3wt％的Ge溶液，5ml浓度为0.5wt％的CNC溶液，20ml浓度为2wt％的CaCl2溶液)用可吸收缝线缝合在右侧缺损处。每两天监测一次伤口愈合情况。结果见图5。
从图5可见，与对照侧相比，实验侧在第7天和第14天表现出了更快的伤口愈合速率和更好的皮肤恢复情况。第14天时实验侧几乎已经完成了伤口的闭合，而同时对照侧的大部分伤口仍未完全闭合。根据伤口的愈合面积计算伤口闭合百分比可知，在第14天，实验侧的伤口闭合率达到95％，对照组伤口闭合率仅为80％。
以上实验结果表明，本发明SA/Ge/CNC支架材料可以有效地促进皮肤创伤的愈合。

Claims (10)

1.促进皮肤创伤愈合的生物支架材料，其特征是：它是包含海藻酸或其盐、明胶、+2价钙离子和纳米纤维素的原料制备而成的。
2.如权利要求1所述的生物支架材料，其特征是：所述原料的重量配比为：海藻酸或其盐0.9～2.16份、明胶0.54～1.8份、+2价钙离子0.14份、纳米纤维素0.005～0.05份；优选地，所述原料的重量配比为：海藻酸或其盐1.2份、明胶0.6份、+2价钙离子0.14份、纳米纤维素0.005～0.05份；优选地，所述原料的重量配比为：海藻酸或其盐1.2份、明胶0.6份、+2价钙离子0.14份、纳米纤维素0.025份或0.05份。
3.如权利要求1或2所述的生物支架材料，其特征是：所述海藻酸或其盐满足以下至少一项：
所述海藻酸或其盐由褐藻制备得到；
所述海藻酸或其盐为直链型；
所述海藻酸或其盐中β-D-甘露糖醛酸单元/α-L-古洛糖醛酸单元摩尔比＝1.56；
所述海藻酸盐为海藻酸钠。
4.如权利要求1或2所述的生物支架材料，其特征是：所述明胶满足以下至少一项：
所述明胶由猪皮制备得到；
所述明胶为B型明胶；
所述明胶的分子量为50000～100000Da；
所述明胶的bloom值为280～320。
5.如权利要求1或2所述的生物支架材料，其特征是：所述+2价钙离子以氯化钙、硫酸钙、碳酸钙、醋酸钙中一种或两种以上混合物的形式添加；优选地，所述+2价钙离子以氯化钙的形式添加。
6.如权利要求1或2所述的生物支架材料，其特征是：所述纳米纤维素满足以下至少一项：
所述纳米纤维素由棉浆制备得到；
所述纳米纤维素由硫酸水解制备得到；
所述纳米纤维素的长度为150～200nm；
所述纳米纤维素的直径为4～7nm；
所述纳米纤维素的结晶度为90.3％；
所述纳米纤维素的磺酸基含量为0.657mmol/g；
所述纳米纤维素的zeta电位为-64.3mV。
7.如权利要求1～6任意一项所述的生物支架材料，其特征是：由下述方法制备得到：取各重量配比的海藻酸或其盐、明胶和纳米纤维素，分散于溶剂中，混合均匀，成膜，干燥，将所得材料用+2价钙离子溶液交联，即得；优选地，分别将海藻酸或其盐、明胶、纳米纤维素各自分散于溶剂中，再混合均匀。
8.如权利要求7所述的生物支架材料，其特征是：所述方法满足以下至少一项：
将海藻酸或其盐分散于溶剂中，制备成浓度为3wt％的溶液；
将明胶分散于溶剂中，制备成浓度为3wt％的溶液；
于60℃将明胶分散于溶剂中；
将纳米纤维素分散于溶剂中，制备成浓度为0.1～1wt％的溶液；
所述溶剂为水；
于常温下混合均匀；
混合溶液用超声处理1小时；
所述成膜采用倾倒成膜的方式；
所述干燥的条件为：于45℃烘箱中干燥2天；
所述+2价钙离子溶液为水溶液；
所述+2价钙离子溶液的浓度为2wt％；
将所得材料用+2价钙离子溶液浸泡交联30分钟；
将浸泡后所得材料干燥直恒重，即得所述生物支架材料。
9.权利要求1～8任意一项所述生物支架材料的制备方法，其特征是：包括如下步骤：取各重量配比的海藻酸或其盐、明胶和纳米纤维素，分散于溶剂中，混合均匀，成膜，干燥，将所得材料用+2价钙离子溶液交联，即得；优选地，分别将海藻酸或其盐、明胶、纳米纤维素各自分散于溶剂中，再混合均匀。
10.权利要求1～8任意一项所述生物支架材料在制备促进皮肤创伤愈合的敷料或药品中的用途；优选地，所述皮肤创伤为割伤。
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