CN110269955A

CN110269955A - 一种柞蚕丝素蛋白/芦荟胶复合敷料的制备方法

Info

Publication number: CN110269955A
Application number: CN201910544504.2A
Authority: CN
Inventors: 张超; 王心如; 叶玮; 丁红燕
Original assignee: Huaiyin Institute of Technology
Current assignee: Huaiyin Institute of Technology
Priority date: 2019-06-21
Filing date: 2019-06-21
Publication date: 2019-09-24
Anticipated expiration: 2039-06-21
Also published as: CN110269955B

Abstract

本发明涉及生物医用材料领域，公开了一种柞蚕丝素蛋白/芦荟胶复合敷料的制备方法，包括：（1）柞蚕丝脱胶后溶解，制备再生柞蚕丝素蛋白水溶液；（2）将芦荟凝胶粉溶于水，配制成一定比例的芦荟胶溶液；（3）将芦荟胶溶液与柞蚕丝素蛋白水溶液共混，控制芦荟胶与柞蚕丝素蛋白质量比为1:10~1:100，混合溶液继续浓缩至柞蚕丝素蛋白达到一定浓度；（4）将所得混合溶液分别通过静电纺丝法和冷冻干燥法制备二维纤维支架和三维海绵状多孔支架；（5）利用乙醇水溶液对复合材料处理。与现有技术相比，本发明制备方法简单，易操作，成本低，可有效制备出一种柞蚕丝素蛋白/芦荟胶复合敷料，并可将其用于伤口敷料。

Description

一种柞蚕丝素蛋白/芦荟胶复合敷料的制备方法

技术领域

本发明涉及生物医用材料技术领域，特别涉及一种柞蚕丝素蛋白/芦荟胶复合敷料的制备方法。

背景技术

蚕丝是一种常见且价格便宜的生物材料，具有优良的柔韧性、透气性、生物可降解性和生物相容性。丝素蛋白约占蚕丝总质量的70~85%，因其对细胞和机体无毒，不会或较少引起炎症和免疫排斥反应，使得其在生物医学领域具有很大的应用价值。柞蚕丝含量丰富，我国每年柞蚕丝产量约占世界总产量的90%左右。柞蚕丝素蛋白含有独特的精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸（RGD）三肽序列，而RGD序列更有利于细胞的粘附和增殖，因而，相比家蚕丝素蛋白，柞蚕丝素蛋白的愈创效果更为显著。

芦荟胶是从草本植物芦荟中提取而出，纯度高，无毒副作用，对擦伤、割伤、伤口溃烂、手术疤痕等具有明显的愈合作用。芦荟多糖是芦荟胶的主要成分，约占芦荟胶干重的55%，具有良好的抑菌消炎，促进创面愈合等作用。研究表明，芦荟多糖可有效促进成人纤维细胞及表皮细胞的增殖，促进I、III型胶原的表达及I、III型胶原、羟脯氨酸、透明质酸的分泌，从而在创面愈合中发挥至关重要的作用。

理想的敷料应具有合适的孔隙率和孔径，使得皮肤保持一定的透气性，进而促进肉芽组织的正常生长和上皮细胞的再生。静电纺丝法可制备孔隙率大、具有天然细胞外基质结构和生物功能的二维纤维支架材料，而冷冻干燥法则可制备三维大孔海绵状支架材料。申请号为200610155970.4的中国专利以天然柞蚕丝为原料，采用静电纺丝方法得到柞蚕丝素蛋白纤维毡多孔材料，所得的纤维支架有望代替高成本的胶原等材料应用于生物医用领域，但是其对擦伤、割伤、伤口溃烂等的修复并没有太大的效用。申请号为201810344414.4的中国专利提出了采用冷冻干燥法制备一种负载BMSCs的胶原/柞蚕丝素蛋白复合支架的方法，所制备的支架具有良好的生物相容性和较大的孔径，且无炎症反应、免疫排斥反应等，细胞黏附力强，可促进皮肤创面修复，但是因为胶原蛋白的成本较高，而且BMSCs悬液的制备方法负责，导致复合支架的制备方法成本偏高，胶原蛋白对创伤修复的速度与效用也不如芦荟胶快速。由上可见，在生物医疗领域亟需一种成本低，制备方法简单，效用好的创伤修复复合敷料。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种柞蚕丝素蛋白/芦荟胶复合敷料的制备方法。

技术方案：本发明提供了一种柞蚕丝素蛋白/芦荟胶复合敷料的制备方法，包括如下步骤：

步骤1）用碳酸钠（Na₂CO₃）水溶液对柞蚕丝脱胶，然后用硫氰酸锂（LiSCN）水溶液将其溶解，并经过离心、抽滤、透析后，得到再生柞蚕丝素蛋白水溶液，浓缩再生柞蚕丝素蛋白水溶液至柞蚕丝素蛋白达到一定的质量百分数，记为溶液A；

步骤2）用粉碎机将芦荟凝胶破碎，并用冷冻干燥法制备得到芦荟胶凝粉，将芦荟凝胶粉溶于水，配制成一定质量百分数的芦荟胶水溶液；

步骤3）将步骤2）所述的芦荟胶水溶液与步骤1）所述的溶液A进行共混，并控制芦荟胶与柞蚕丝素蛋白质量比为1:10~1:100，将共混后的混合溶液分别浓缩至柞蚕丝素蛋白达到两种质量百分数，使其分别适用于静电纺丝法和冷冻干燥法，分别记为混合溶液B与混合溶液C；

步骤4）将所述步骤3）的混合溶液B与混合溶液C分别通过静电纺丝法和冷冻干燥法制备出两种柞蚕丝素蛋白/芦荟胶复合材料，记为复合材料B与复合材料C；

步骤5）将步骤4）所述的复合材料B与复合材料C分别浸入一定浓度的乙醇水溶液中，浸渍一段时间后，取出干燥，得到柞蚕丝素蛋白/芦荟胶二维纤维复合敷料和三维海绵状多孔复合敷料。

进一步地，所述步骤1）中，所述步骤1）中，Na₂CO₃水溶液的质量百分数为0.5~1%，所述LiSCN水溶液质量百分数为5~10%，溶液A的柞蚕丝素蛋白质量百分数为5~20%。

进一步地，所述步骤2）中所述的芦荟胶水溶液的质量百分数为1~10%。

进一步地，所述步骤3）中混合溶液B的柞蚕丝素蛋白质量百分数为27~35%，混合溶液C的柞蚕丝素蛋白质量百分数为5~15%。

进一步地，所述步骤2）与步骤4）中冷冻干燥法的条件为：冷冻温度为-80 ~ -20℃，冷冻时间为48 h。

进一步地，所述步骤4）中静电纺丝法的条件为：纺丝电压为14~20 kV，针头到接收器的接收距离为10~15 cm，微量注射泵的挤出速度为0.6~1.2 mL/h，环境温度为10~20 ℃，湿度为40~60 RH%。

进一步地，所述步骤5）中乙醇体积分数为70~90%，浸泡时间为30 ~ 45 min。

有益效果：

1．本发明中使用芦荟胶和柞蚕丝素蛋白共混，并通过静电纺丝法和冷冻干燥法制备而成的柞蚕丝素蛋白/芦荟胶复合敷料，在修复创伤方面可以起到更好的效果，柞蚕丝素蛋白由于具有独特的RGD三肽序列，可促进细胞粘附，而芦荟胶具有抗菌消炎、促进创口修复、加快新陈代谢的功能，将二者复合后，通过静电纺丝与冷冻干燥两种方法所制备的复合支架材料能更好地增强细胞粘附和生长，达到修复伤口的目的，此外，两种原料纯天然、易获得、工艺成本低，所得到的复合支架可作为伤口敷料，具有广阔的应用前景。

2．本发明中，芦荟胶与柞蚕丝素蛋白的质量比范围为1:10~1:100，芦荟胶在这个过程中对修复创伤起到很大作用，所以芦荟胶的比例不能过小，但是也不宜使用过多的芦荟胶，使用过多的芦荟胶会导致柞蚕丝素蛋白例偏小，会导致经过静电纺丝法和冷冻干燥法无法生产柞蚕丝素蛋白/芦荟胶二维纤维支架和三维海绵状多孔复合支架。

3．本发明中，将混合溶液分别浓缩至不同的柞蚕丝素蛋白质量百分数，使其分别适合静电纺丝法以及冷冻干燥法，使其可以制备出柞蚕丝素蛋白/芦荟胶二维纤维复合敷料和三维海绵状多孔复合敷料，在使用时可以根据不同的情况下使用不同的复合敷料，其中，静电纺丝法的混合溶液浓缩至柞蚕丝素蛋白质量百分数为27~35%，适合冷冻干燥法的混合溶液浓缩至柞蚕丝素蛋白质量百分数为5~15%。

4．本发明中步骤1）中的取再生柞蚕丝素蛋白水溶液的质量百分数为5~20%，其浓度不可过大，浓度过大的情况下，再生柞蚕丝素蛋白容易变质，且芦荟胶水溶液的质量百分比为1~10%，不宜过浓，浓度过大，不利于二者共混均匀，因此对两者的质量百分数都有一定的要求。

附图说明

图1.为雪旺细胞接种在静电纺丝法所制备的柞蚕丝素蛋白/芦荟胶（质量比100:1）复合材料和纯柞蚕丝素蛋白材料上3天的SEM对比图，其中a为雪旺细胞接种在静电纺丝法所制备的柞蚕丝素蛋白/芦荟胶（质量比100:1）复合材料上3天的SEM图，b为雪旺细胞接种在纯柞蚕丝素蛋白材料上3天的SEM图；

图2为雪旺细胞接种在冷冻干燥法所制备的柞蚕丝素蛋白/芦荟胶（质量比100:1）复合材料和纯柞蚕丝素蛋白材料上3天的SEM对比图，其中c为雪旺细胞接种在冷冻干燥法所制备的柞蚕丝素蛋白/芦荟胶（质量比100:1）复合材料上3天的SEM图，d为雪旺细胞接种在纯柞蚕丝素蛋白材料上3天的SEM图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1：

用0.5~1%的碳酸钠（Na₂CO₃）水溶液对柞蚕丝脱胶，然后用5~10% 硫氰酸锂（LiSCN）水溶液将其溶解，并经过离心、抽滤、透析后，得到再生柞蚕丝素蛋白水溶液，将得到的再生柞蚕丝素蛋白水溶液浓缩至柞蚕丝素蛋白质量百分数为5~20%，记为溶液A。

用粉碎机将芦荟凝胶破碎，并用冷冻干燥法制备得到芦荟胶凝粉，将芦荟凝胶粉溶于水，配制成1~10%的芦荟胶水溶液，冷冻干燥法的冷冻温度为-80 ~ -20℃，冷冻时间为48 h。

取柞蚕丝素蛋白质量百分数为20%的溶液A与质量分数为2%的芦荟胶水溶液进行共混搅拌，且控制芦荟胶与柞蚕丝素蛋白质量比为1:100，形成混合溶液B。

对于静电纺丝法，控制混合溶液B的柞蚕丝素蛋白质量百分数范围为27~35%，本实施例中，取混合溶液B的柞蚕丝素蛋白质量百分数为30%。将混合溶液B进行静电纺丝，静电纺丝法实验参数为：相对湿度为40±5%、温度为15±5℃，针头内径为0.6 mm，电压为20 kV，针头到接收器（铝箔）的接收距离为10 cm，微量注射泵的挤出速度为1.2 mL/h。最终制备出一种柞蚕丝素蛋白/芦荟胶复合材料，记为复合材料B。

对于冷冻干燥，取柞蚕丝素蛋白质量分数为5%的溶液A与质量分数为2%的芦荟胶水溶液进行共混搅拌，且控制芦荟胶与柞蚕丝素蛋白质量比为1:100，形成混合溶液C，对于冷冻干燥法，需要的混合溶液C的柞蚕丝素蛋白质量百分数范围为5~15%，在本实施例中取混合溶液C的柞蚕丝素蛋白质量百分数为10%，并将其置于-50℃下冷冻48 h后冻干，生成另一种柞蚕丝素蛋白/芦荟胶复合材料，记为复合材料C。

将两种方法制备得到的柞蚕丝素蛋白/芦荟胶复合材料（复合材料B与复合材料C）分别浸入乙醇体积分数为80%的乙醇水溶液中，30 min后取出，并于室温下干燥。采用静电纺丝法可得到孔隙率为85%，拉伸强度为1.0 MPa的二维纤维复合敷料；采用冷冻干燥法可得到孔隙率为82%，压缩强度为2.4 MPa的三维海绵状复合敷料。

实施例2：

实施例2与实施例1的不同之处为：实施例2控制芦荟胶与柞蚕丝素蛋白质量比为1:50，其他操作与实施例1一样，如下：

用0.5~1%的碳酸钠（Na₂CO₃）水溶液对柞蚕丝脱胶，然后用5~10% 硫氰酸锂（LiSCN）水溶液将其溶解，并经过离心、抽滤、透析后，得到再生柞蚕丝素蛋白水溶液，并将得到的再生柞蚕丝素蛋白水溶液浓缩至柞蚕丝素蛋白质量百分数为5~20%，记为溶液A。

取柞蚕丝素蛋白质量百分数为20%的溶液A与质量分数为2%的芦荟胶水溶液进行共混搅拌，且最终控制芦荟胶与柞蚕丝素蛋白质量比为1:50，形成混合溶液B。

对于静电纺丝法，需要的混合溶液B的柞蚕丝素蛋白质量百分数范围为27~35%，本实施例中，取混合溶液B的柞蚕丝素蛋白质量百分数为30%。将混合溶液B进行静电纺丝，静电纺丝法实验参数同实施例1，最终制备出一种柞蚕丝素蛋白/芦荟胶复合材料，记为复合材料B。

对于冷冻干燥，取柞蚕丝素蛋白质量分数为5%的溶液A与质量分数为2%的芦荟胶水溶液进行共混搅拌，且控制芦荟胶与柞蚕丝素蛋白质量比为1:50，形成混合溶液C，对于冷冻干燥法，需要的混合溶液C的柞蚕丝素蛋白质量百分数范围为5~15%，在本实施例中取混合溶液C的柞蚕丝素蛋白质量百分数为10%，并将其置于-50℃下冷冻48 h后冻干，生成另一种柞蚕丝素蛋白/芦荟胶复合材料，记为复合材料C。

将两种方法制备的柞蚕丝素蛋白/芦荟胶浸复合材料（复合材料B与复合材料C）分别浸入乙醇体积分数为80%的乙醇水溶液中，30 min后取出，于室温下干燥。采用静电纺丝法可得到孔隙率为87%，拉伸强度为0.8 MPa的二维纤维复合敷料；采用冷冻干燥法可得到孔隙率为85 %，压缩强度为2.1 MPa的三维海绵状复合敷料。

实施例3：

实施例3与实施例1、实施例2的不同之处为：实施例3控制芦荟胶与柞蚕丝素蛋白质量比为1:10，其他操作与实施例1、2一样，如下：

取柞蚕丝素蛋白质量百分数为20%的溶液A与质量分数为2%的芦荟胶水溶液进行共混搅拌，且最终控制芦荟胶与柞蚕丝素蛋白质量比为1:10，形成混合溶液B。

对于冷冻干燥，取柞蚕丝素蛋白质量分数为5%的溶液A与质量分数为2%的芦荟胶水溶液进行共混搅拌，且控制芦荟胶与柞蚕丝素蛋白质量比为1:10，形成混合溶液C，对于冷冻干燥法，需要的混合溶液C的柞蚕丝素蛋白质量百分数范围为5~15%，在本实施例中取混合溶液C的柞蚕丝素蛋白质量百分数为10%，并将其置于-50℃下冷冻48 h后冻干，生成另一种柞蚕丝素蛋白/芦荟胶复合材料，记为复合材料C。

将两种方法制备的柞蚕丝素蛋白/芦荟胶浸复合材料（复合材料B与复合材料C）分别浸入乙醇体积分数为80%的乙醇水溶液中，30 min后取出，于室温下干燥。用静电纺丝法可得到孔隙率为89%，拉伸强度为0.7 MPa的二维纤维复合敷料；采用冷冻干燥法可得到孔隙率为87 %，压缩强度为1.8 MPa的三维海绵状复合敷料。

实施例4：

实施例4与实施例1的不同之处为：实施例4控制混合溶液B的柞蚕丝素蛋白质量百分数为33%，混合溶液C的柞蚕丝素蛋白质量百分数为12%，而实施例1控制混合溶液B的柞蚕丝素蛋白质量百分数为30%，混合溶液C的柞蚕丝素蛋白质量百分数为10%，其他操作与实施例1、2一样，如下：

取柞蚕丝素蛋白质量分数为20%的溶液A与质量分数为2%的芦荟胶水溶液进行共混搅拌，且最终控制芦荟胶与柞蚕丝素蛋白质量比为1:100，形成混合溶液B。

对于静电纺丝法，需要的混合溶液B的柞蚕丝素蛋白质量百分数范围为27~35%，本实施例中，取混合溶液B的柞蚕丝素蛋白质量百分数为33%。将混合溶液B进行静电纺丝，静电纺丝法实验参数同实施例1，最终制备出一种柞蚕丝素蛋白/芦荟胶复合材料，记为复合材料B。

对于冷冻干燥，取柞蚕丝素蛋白质量分数为5%的溶液A与质量分数为2%的芦荟胶水溶液进行共混搅拌，且控制芦荟胶与柞蚕丝素蛋白质量比为1:100，形成混合溶液C，对于冷冻干燥法，需要的混合溶液C的柞蚕丝素蛋白质量百分数范围为5~15%，在本实施例中取混合溶液C的柞蚕丝素蛋白质量百分数为12%，并将其置于-50℃下冷冻48 h后冻干，生成另一种柞蚕丝素蛋白/芦荟胶复合材料，记为复合材料C。

将两种方法制备的柞蚕丝素蛋白/芦荟胶复合材料（复合材料B与复合材料C）分别浸入乙醇体积分数为80%的乙醇水溶液中，30 min后取出，于室温下干燥。采用静电纺丝法可得到孔隙率为81%，拉伸强度为1.3 MPa的二维纤维复合敷料；采用冷冻干燥法可得到孔隙率为79 %，压缩强度为2.6 MPa的三维海绵状复合敷料。

综上实施例1~实施例4参见下表1：针对实施例1~实施例4得到的柞蚕丝素蛋白/芦荟胶复合敷料对大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的抑菌率的测试结果，实施例1~实施例4分别就芦荟胶与柞蚕丝素蛋白质量比（1:10-1:100）、静电纺丝下柞蚕丝素蛋白质量百分数（30%、33%），冷冻干燥下柞蚕丝素蛋白质量百分数（10%、12%）进行试验其抑菌率。实施例1~实施例3是在静电纺丝下柞蚕丝素蛋白质量百分数为30%，冷冻干燥法下柞蚕丝素蛋白质量百分数为10%情况下不同芦荟胶与柞蚕丝素蛋白质量比下的抑菌率。实施例4是静电纺丝下柞蚕丝素蛋白质量百分数为33%，冷冻干燥法下柞蚕丝素蛋白质量百分数为12%，芦荟胶与柞蚕丝素蛋白质量比为1:100下的抑菌率。

表1. 本发明对实施例1~4得到的柞蚕丝素蛋白/芦荟胶复合敷料抑菌率测试结果

参见附图1与附图2，附图1为雪旺细胞接种在静电纺丝法所制备的柞蚕丝素蛋白/芦荟胶（质量比为100:1）的复合敷料与纯柞蚕丝素蛋白材料上3天的SEM对比图，其中a为雪旺细胞接种在静电纺丝法所制备的柞蚕丝素蛋白/芦荟胶（质量比100:1）复合材料上3天的SEM图，b为雪旺细胞接种在纯柞蚕丝素蛋白材料上3天的SEM图。附图2是雪旺细胞接种在冷冻干燥法所制备的柞蚕丝素蛋白/芦荟胶（质量比100:1）复合材料和纯柞蚕丝素蛋白材料上3天的SEM对比图，其中c为雪旺细胞接种在冷冻干燥法所制备的柞蚕丝素蛋白/芦荟胶（质量比100:1）复合材料上3天的SEM图，d为雪旺细胞接种在纯柞蚕丝素蛋白材料上3天的SEM图。从附图中可明显看出本发明柞蚕丝素蛋白/芦荟胶复合敷料可更好地增强细胞粘附和生长，达到修复伤口的目的。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种柞蚕丝素蛋白/芦荟胶复合敷料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1）用碳酸钠水溶液对柞蚕丝脱胶，然后用硫氰酸锂水溶液将其溶解，并经过离心、抽滤、透析后，得到再生柞蚕丝素蛋白水溶液，并浓缩再生柞蚕丝素蛋白水溶液至柞蚕丝素蛋白达到一定的质量百分数，记为溶液A；

2.根据权利要求1所述的一种柞蚕丝素蛋白/芦荟胶复合敷料的制备方法，其特征在于，所述步骤1）中，碳酸钠水溶液的浓度质量分数为0.5~1%，所述硫氰酸锂水溶液浓度质量分数为5~10%，溶液A的柞蚕丝素蛋白质量百分数为5~20%。

3.根据权利要求1所述的一种柞蚕丝素蛋白/芦荟胶复合敷料的制备方法，其特征在于，所述步骤2）中所述的芦荟胶水溶液的质量百分数为1~10%。

4.根据权利要求1所述的一种柞蚕丝素蛋白/芦荟胶复合敷料的制备方法，其特征在于，所述步骤3）中混合溶液B的柞蚕丝素蛋白质量百分数为27~35%，混合溶液C的柞蚕丝素蛋白质量百分数为5~15%。

5.根据权利要求1所述的一种柞蚕丝素蛋白/芦荟胶复合敷料的制备方法，其特征在于，所述步骤2）与步骤4）中冷冻干燥法的条件为：冷冻温度为-80 ~ -20℃，冷冻时间为48h。

6.根据权利要求1所述的一种柞蚕丝素蛋白/芦荟胶复合敷料的制备方法，其特征在于，所述步骤4）中静电纺丝法的条件为：纺丝电压为14~20 kV，针头到接收器的接收距离为10~15 cm，微量注射泵的挤出速度为0.6~1.2 mL/h，环境温度为10~20 ℃，湿度为40~60RH%。

7.根据权利要求1所述的一种柞蚕丝素蛋白/芦荟胶复合敷料的制备方法，其特征在于，所述步骤5）中乙醇体积分数为70~90%，浸泡时间为30 ~ 45 min。