CN113274553A - 一种生物材料诱导的外泌体三维支架及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种生物材料诱导的外泌体三维支架及其制备方法与应用。所述外泌体三维支架是利用可降解生物材料诱导细胞源分泌的外泌体并将其使用3D打印一体化成型得到的具有三维可控结构的外泌体支架；外泌体均匀分布于所述支架中；其中，外泌体在所述外泌体三维支架中的质量百分含量为0.003‑0.05%。所述支架通过外泌体的缓释作用可调节细胞的免疫响应，增强干细胞与内皮细胞的粘附、增殖、成骨与成血管化。此外，生物可降解材料能够调节细胞源外泌体的分泌与内容物表达，进而影响外泌体三维支架对组织细胞的旁分泌效应，可为组织再生生物材料的设计提供新方向。

Description

一种生物材料诱导的外泌体三维支架及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种生物材料诱导的外泌体三维支架及其制备方法与应用。
背景技术
组织工程支架是治疗组织缺损的一种有效策略。由于细胞支架存在细胞存活率低、免疫排斥、致瘤性等风险，以招募体内的内源性细胞来促进组织修复的无细胞支架发展为组织再生的一种新策略。外泌体是细胞分泌的一类包裹核酸、脂质、蛋白等生物活性物质的小细胞外囊泡(30-150nm)，在细胞通讯中发挥重要作用。研究表明，外泌体可调节组织的再生与修复，且相比活细胞和生长因子，具有免疫原性低、易保存、成本低、稳定性好等优点，为无细胞支架的发展提供了机遇。然而，目前报道的外泌体支架的制备方法主要基于成型支架负载和材料预混后交联两种方法：前者需将支架浸没于外泌体悬液或将外泌体注入支架中，仅部分外泌体以物理吸附的方式负载于支架上，导致支架载药效率低、浪费大且外泌体与支架结合弱、易逸出；后者不具有调控宏观三维多孔结构的能力，且仅依靠水凝胶的三维分子网络结构进行物质的扩散和交流，孔隙率低，不益于组织的长入和营养的传输。此外，外泌体所诱导的生物学效应决定于其亲体细胞的活性和状态，而生物材料在调控细胞的代谢与分化上已展现巨大的潜力。因此，如何从制备工艺和材料的角度增强外泌体的组织再生效果是目前外泌体应用要考虑的问题。综上，发展一种具有可控结构和缓释性能的生物材料诱导的外泌体组织工程支架以促进组织修复具有重要意义和应用价值。
发明内容
为实现上述目的，发明人进行了广泛而深入的研究。3D打印技术在制备组织工程支架方面具有快速成型、精准控制、可重复性高等优点，且生物材料对细胞的免疫响应、成骨/成血管具有重要调节作用。但是目前，3D打印的生物材料诱导的外泌体组织工程支架尚缺乏研究。
针对外泌体应用存在的不足之处，本发明的技术目的是提供一种具有三维可控结构的生物材料诱导的外泌体组织工程支架以用于细胞的免疫调控与成骨/成血管功能。发明人经锐意研究得出，上述问题可以由下面描述的发明来解决，由此，完成本发明。
第一方面，本发明提供一种生物材料诱导的外泌体三维支架。所述外泌体三维支架是利用可降解生物材料诱导细胞源分泌的外泌体并将其使用3D打印一体化成型得到的具有三维可控结构的外泌体支架。在该外泌体支架中，外泌体均匀分布在支架的各个部位。即、本发明是先通过生物材料诱导外泌体的分泌并调控外泌体的功能，再用于制备外泌体支架从而用于其他生物功能的响应。
其中，外泌体在所述外泌体三维支架中的质量百分含量为0.003-0.05％。
由于该外泌体支架是通过3D打印一体化成型制备而成，外泌体与支架的其他组分分布均匀，且外泌体均匀稳定地分布于支架各个部位。
较佳地，所述外泌体三维支架可以通过调节3D打印参数适应性调节支架的孔结构，如根角度、根数、层高、层间距等，也可适应性改变其贯通孔孔径、高度、孔间距等，还可灵活改变支架的三维形状。一些实施方式中，所述外泌体三维支架的孔隙率为30％-70％。
较佳地，所述孔洞(例如可为贯通孔)的孔径为0.2-0.6mm，孔深为0.8-5mm。
较佳地，所述孔洞(例如可为贯通孔)的间距为0.8-1.6mm。
较佳地，所述外泌体三维支架的储能模量为104-106Pa，损耗模量为103-105Pa。
较佳地，外泌体三维支架在基础培养基(例如ScienCell干细胞基础培养基)中释放一个月后外泌体的滞留率为50％-80％，支架降解率为15％-40％。
较佳地，所述可降解生物材料包括生物陶瓷、生物玻璃、生物金属材料、生物复合材料中的一种或多种的混合物。
较佳地，所述外泌体是免疫细胞源外泌体、干细胞源外泌体、内皮细胞源外泌体中的一种或多种的混合物。
所述支架通过外泌体的缓释作用可调节细胞的免疫响应，增强干细胞与内皮细胞的粘附、增殖、成骨与成血管化。此外，生物可降解材料能够调节细胞源外泌体的分泌与内容物表达，进而影响外泌体三维支架对组织细胞的旁分泌效应，可为组织再生生物材料的设计提供新方向。
第二方面，本发明还提供上述任一项所述的生物材料诱导的外泌体三维支架的制备方法。所述制备方法包括以下步骤：
(1)生物材料诱导的外泌体的提取：向含有生物材料的培养基中加入细胞，培养完成后，收集细胞上清液并分离纯化上清液中的外泌体；
(2)外泌体三维支架的制备：将包含生物材料诱导的外泌体和高分子材料的原料均匀混合于磷酸盐缓冲液或生理盐水溶液中以配制为生物墨水，并将该生物墨水通过3D打印技术成型后交联以得到所述外泌体三维支架。
通过选择不同的高分子材料可以控制支架的可控结构，从而对外泌体和生物材料的降解时间进行控制，达到更好的缓释控制效果。
较佳地，所述生物墨水中生物材料诱导的外泌体的浓度为50～400μg/mL。外泌体的浓度在200μg/mL左右对成骨、成血管等有较好的促进作用。
较佳地，所述交联是氯化钙交联、光交联或低温交联。
较佳地，所述生物墨水还包括生物陶瓷粉、可降解生物活性纳米颗粒、活性酶或生长因子中的一种或多种的混合物。
第三方面，本发明还提供上述任一项所述的生物材料诱导的外泌体三维支架在免疫调控、成骨、成血管、软修复、组织修复中的应用。
附图说明
图1表明生物陶瓷可促进细胞外泌体的分泌并改变其内miRNAs谱：(a)分别为BCA蛋白检测试剂盒和外泌体CD81ELISA试剂盒所测外泌体分泌量结果；(b)为miRNAs热图。
图2中的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)是不同3D打印参数制备的生物材料诱导的外泌体三维支架的实物图，(f)和(g)是对上述支架进行弯曲试验，表明该支架具有柔性和承重能力。
图3中的(a)和(b)分别为无外泌体支架(S)和生物材料诱导的外泌体三维支架(S+BC-Exos)的流变行为测试曲线，(c)是生物材料诱导的外泌体三维支架在生理盐水中的降解速率随时间的变化曲线；(d)表明在生理盐水中降解四周后纯支架仍能够保持其基本形貌；(e)表明在生理盐水中降解四周后外泌体支架仍能够保持其基本形貌；(f)是生物材料诱导的外泌体三维支架在基础培养基中外泌体的滞留率随时间的变化曲线；(g)分别为支架正面图(i)和支架深度扫描重构的三维图(ii)，表明外泌体在该支架中均匀分布。
图4中的(a)是巨噬细胞在β-TCP诱导的外泌体三维支架表面的粘附图；(b)是巨噬细胞在β-TCP诱导的外泌体三维支架表面的基因表达图。
图5中的(a)表明β-TCP诱导的外泌体三维支架促进了间充质干细胞的增殖；图5中的(b)表明β-TCP诱导的外泌体三维支架促进了间充质干细胞的粘附。
图6表明β-TCP诱导的外泌体三维支架促进了间充质干细胞的铺展。
图7表明β-TCP诱导的外泌体三维支架促进了间充质干细胞的成骨分化。
图8表明β-TCP诱导的外泌体三维支架促进了间充质干细胞的免疫抑制作用。
图9中的(a)表明β-TCP诱导的外泌体三维支架促进了内皮细胞的增殖；图9中的(b)表明β-TCP诱导的外泌体三维支架促进了内皮细胞的粘附；图9中的(c)表明β-TCP诱导的外泌体三维支架促进了内皮细胞的铺展。
图10表明β-TCP诱导的外泌体三维支架促进了内皮细胞的成血管分化。
图11是以挤出式3D打印制备外泌体三维支架的制备流程图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。在没有特殊说明的情况下，各百分含量指质量百分含量。
本公开提供一种外泌体组织工程支架，其利用生物可降解活性材料诱导细胞源分泌的外泌体，并将其使用3D打印一体化成型得到具有三维可控结构的外泌体支架。上述外泌体三维支架为内部均匀负载可降解生物材料诱导的细胞源外泌体的三维打印一体化支架。本公开的支架能够保证外泌体的高利用率，从而避免由于物理或者化学吸附导致的外泌体利用率低的缺陷。
所述支架利用其可控结构和缓释性能，以及材料作用条件对细胞源外泌体分泌的调控，如材料降解液的稀释倍数、材料作用细胞的时长，通过外泌体的长期缓释，能够显著提高细胞在支架表面的粘附，调控细胞的免疫响应，增强干细胞的成骨分化，促进内皮细胞的血管生成，是一种有潜力的诱导组织再生型材料，可为组织工程和再生医学提供新的策略。
所述支架通过调节支架的三维多孔结构及孔隙率，可实现外泌体的有效控释。具体而言，通过外泌体的控释可显著促进巨噬细胞、间充质干细胞及脐静脉内皮细胞在支架表面的粘附，并调控巨噬细胞的极化表型使之有利于组织修复，增强干细胞的成骨分化，提高内皮细胞的血管生成。
本发明的生物材料诱导的外泌体3D支架兼具免疫、成骨、成血管调控效应，较未经材料诱导的外泌体支架，具有更好的促细胞粘附、铺展、增殖和成骨/成血管分化效应，同时可调控细胞的免疫调节性能，促进组织再生。因而，可应用免疫调控、成骨、成血管、软修复、组织修复中。
本发明的制备方法是通过生物可降解活性材料诱导细胞源外泌体的分泌，并采用3D打印技术制备外泌体三维支架。具体地，利用生物材料刺激细胞分泌外泌体，即生物材料诱导的外泌体，将外泌体与一种或多种高分子材料混匀后，通过生物3D打印设备制备出具有一定形状、尺寸的外泌体支架，经交联得到生物材料诱导的外泌体三维支架。所述制备工艺简单易行，成本低且便于推广。
以下示例性地说明本发明所述生物材料诱导的外泌体三维支架的制备方法。
生物材料诱导的外泌体的提取。
向含有生物材料的培养基中加入细胞，培养完成后，收集细胞上清液并分离纯化上清液中的外泌体。
生物材料可以为生物陶瓷、生物玻璃、生物金属材料、生物复合材料中的一种或几种的混合物。生物玻璃(也可以称为“生物活性玻璃”)包括但不限于磷酸盐、硅酸盐等。生物金属材料(也可以称为“可降解生物材料”)包括但不限于镁基生物金属材料、铁基生物金属材料等。生物复合材料可为高分子材料、生物陶瓷、生物玻璃、生物金属中的两者及以上的复合物。
所述生物材料的形式包括但不限于粉体、粉体浸提液、薄膜、块体、支架或其降解液。即、生物陶瓷的形式可以为生物陶瓷粉体、生物陶瓷粉体浸提液、生物陶瓷片、生物陶瓷支架或其降解液；生物金属材料的形式可以为生物金属支架、生物金属块体或其降解液；生物复合材料的形式可以是生物复合材料薄膜/生物复合材料支架、生物复合材料块体或其降解液。其中，生物材料浸提液或降解液的制备是以粉体、块体或支架和基础培养基按质量比体积或面积比体积进行浸提或降解，离心过滤得到生物材料浸提原液或降解液。生物材料的浸提及降解产物可调控细胞的活性、增殖、分化及相关基因表达，影响外泌体的分泌、内容物组分及功能。含有生物材料的培养基可为生物材料完全培养基、生物材料浸提液完全培养基或者生物材料降解液完全培养基。将生物材料浸提原液或降解液用细胞基础培养基、去外泌体血清以及双抗梯度稀释为完全培养基。例如可以稀释为浓度100～25mg/mL的(浸提液)完全培养基。
上述生物材料在使用前需经过灭菌，例如通过高温高压或体积分数75％的酒精浸泡灭菌。
培养时间可为2～7天。在培养期间两天换取一次培养液。
所述细胞为免疫细胞或者具有组织修复功能的细胞。相应地，所述外泌体包括但不限于免疫细胞外泌体，例如巨噬细胞源外泌体，或者是干细胞、内皮细胞等分泌的外泌体。
所述外泌体的分离方法可以是差速离心、密度梯度离心、尺寸排阻色谱、聚合物沉淀、免疫分离或筛分分离法。分离后的外泌体可以使用PBS缓冲液重悬以纯化。分离纯化后的分泌体可在-80℃以下保存备用。
一些实施方式中，生物材料浸提原液用基础培养基、去外泌体血清及双抗梯度稀释成100～25mg/mL的浸提液完全培养基。细胞培养至80％融合后，PBS清洗，换浸提液完全培养基培养2～7天。收集细胞上清液后聚合物沉淀法分离外泌体，具体操作为：将细胞上清液离心10～20min后，0.2μm无菌过滤器过滤，向滤液中加入等体积的PEG/NaCl溶液(16％(w/v)PEG-6000，1M NaCl)，4℃沉淀过夜，并在低温条件下以10000转/分钟以上的转速离心至少60min，尽去上清，PBS重悬，得到生物材料诱导的外泌体。
所述生物材料可能促进细胞外泌体的分泌，并改变外泌体内容物成分，如脂质、蛋白、miRNAs等。
外泌体三维支架的制备。
将包含生物材料诱导的外泌体和高分子材料的原料均匀混合于磷酸盐缓冲液或生理盐水溶液中，配制为生物墨水(也可以称为“打印浆料”)，并通过3D打印技术成型并交联以得到生物材料诱导的外泌体3D支架。
所述高分子材料可为天然高分子和/或合成高分子。例如，所述高分子材料可为以下高分子材料中的一种或多种的组合：(1)多糖，包括海藻酸钠、葡聚糖、结冷胶、果胶、卡拉胶、壳聚糖及甲基纤维素等；(2)糖胺聚糖，包括硫酸软骨素、半乳糖胺、肝素及透明质酸等；(3)多肽/蛋白，包括胶原蛋白、纤维蛋白、明胶及丝蛋白等；(4)合成高分子，如聚乙二醇二丙烯酸酯、GelMA等。
所述生物墨水中生物材料诱导的外泌体的浓度为50～400μg/mL。
所述生物墨水的原料中还可以包含生物陶瓷粉、可降解生物活性纳米颗粒、活性酶或生长因子等。
该3D打印可以是挤出式3D打印、喷墨式3D打印、桌面立体光刻或投影式光固化3D打印。以挤出式3D打印为例，打印参数可以为：针头G20，半径5～10mm，高度0.5～3mm，层高0.09～0.15mm，层间错角度30～90°，根间距0.5～1.6mm，气压120～320Kpa，打印速率10～13mm/s。
所述交联采用本领域常用的交联方式即可。例如交联方式可为氯化钙交联、光交联或低温交联。
本发明制备工艺简单易行，成本低廉且不需要昂贵的设备，在普通的环境下就能完成，便于推广。而且，通过3D打印制备的生物材料诱导的外泌体三维支架具有均匀可控的三维多孔结构、稳定的形态和长期的外泌体缓释性能，有利于外泌体在组织局部的稳定和滞留，利于外泌体治疗效应的发挥。
下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。在下述实施例中，所使用到的试剂、材料以及仪器如没有特殊的说明，均为常规试剂、常规材料以及常规仪器，均可商购获得，其中所涉及的试剂也可通过常规合成方法合成获得。
在具体实施方式中，以海藻酸钠和透明质酸水凝胶体系为例，将外泌体与10～15％(w/v)海藻酸钠(高粘)和1～5％(w/v)低分子量透明质酸均匀混合于PBS溶液中，外泌体浓度为100～400μg/mL。打印参数设置为：针头G20，半径5～10mm，高度1～3mm，层高0.09～0.12mm，层间错角度45°～90°，根间距0.8～1.6mm，气压200～280Kpa，打印速率10～13mm/s。经BioScaffolder 3.2挤出式生物3D打印机制备，得到支架雏形，1～2％(w/v)CaCL2溶液(生理盐水配制)交联2～5min，得到生物材料诱导的外泌体三维支架。
实施例1
β-磷酸三钙生物陶瓷粉体诱导的外泌体三维支架的制备：用100mg/mL和25mg/mL的β-磷酸三钙(β-TCP)生物陶瓷粉体浸提液完全培养基作用RAW264.7巨噬细胞2天后，收集上清液，提取β-TCP生物陶瓷诱导的外泌体(BC-Exos)。将β-TCP生物陶瓷诱导的外泌体和其他材料制备成为生物墨水并进行3D打印。
对照样的制备：只将其他材料制备成为生物墨水并进行3D打印，得到不含外泌体的纯支架(S)。
检测生物陶瓷诱导的细胞外泌体分泌，结果如图1，与对照组相比(E-0T-2D)，生物陶瓷可明显促进细胞外泌体的总蛋白分泌量和CD81+外泌体数量。miRNAs测序结果表明，生物陶瓷诱导的外泌体(E-25T-2D)显著上调并下调外泌体中某些miRNAs的表达。
观察支架三维形态，结果如图2，生物陶瓷诱导的外泌体三维支架(S+BC-Exos)可打印为不同的根角度、根间距、半径、高度及复杂形状，且支架具有一定柔性，可弯曲，并可承受至少100g的重量。
采用流变仪检测支架的流变行为，结果如图3，与对照样(S)相比，外泌体支架具有较高的储能模量和损耗模量，且G′>G″，说明BC-Exos的加入提高了支架的粘弹性，这是由于外泌体的颗粒进入到支架的凝胶网络中从而起到增强作用。
检测支架的降解和外泌体缓释性能，结果如图3表明该实施例制备的外泌体三维支架具有优异的缓释性能。该支架在生理盐水中降解4周，支架质量损失约24％，但仍保持支架基本形貌。在基础培养基(ScienCell干细胞基础培养基)中连续释放一个月，仍有80％左右的外泌体滞留率。宏观三维多孔结构使支架可以得到充分交联，缩小分子间网络间隙，延缓外泌体的释放。BC-Exos在一天内有突释，之后逐渐进去缓释阶段。使用PKH67染料荧光标记BC-Exos，发现BC-Exos在支架中均匀分布。
考察β-TCP生物陶瓷诱导的外泌体三维支架的生物学性能，包括免疫调节性能、成骨性能、成血管性能和皮肤/骨修复性能。
研究外泌体三维支架对巨噬细胞的活性、极化。与对照组相比，25mg/mLβ-TCP浸提液诱导巨噬细胞2天分泌的外泌体三维支架(SE-25T-2D)可显著促进巨噬细胞在支架上的粘附，上调细胞抑炎基因IL-1ra和Arg1的表达，同时下调促炎基因iNOS2和TNF-α的表达(图4)。
研究生物材料诱导的外泌体三维支架对小鼠源骨髓间充质干细胞的粘附、增殖、分化。与S和SE-100T-2D组相比，SE-25T-2D可显著提高间充质干细胞的增殖、成骨相关基因(如Runx2，COL I，OPN，BSP及TGF-β1等)及免疫抑制相关基因(如GAL-1，TSG-6，IL-6及COX2)的表达；干细胞在外泌体支架上具有更好的粘附、增殖和铺展(图5-8)。
研究生物材料诱导的外泌体三维支架对人脐静脉内皮细胞的粘附、增殖、分化。比较内皮细胞的成血管活性，SE-25T-2D显著上调成血管相关基因VEGFA、VGEFR2、HIF-1α、vWF和eNOS3等的表达。这表明外泌体三维支架可促进内皮细胞的增殖、粘附和铺展(图9-10)。
采用兔颅骨缺损模型或裸鼠皮肤缺损模型，考察外泌体三维支架诱导缺损组织再生的能力。体内实验表明，SE-25T-2D可调控骨缺损处早期的炎症响应，促进新生血管的形成，加快骨的愈合。
以上结果表明，β-TCP生物陶瓷诱导的外泌体三维支架具有免疫调控、成骨和成血管功能，且β-TCP生物陶瓷诱导巨噬细胞外泌体分泌的条件影响外泌体支架的生物功能活性。
实施例2
镁黄长石生物陶瓷诱导的外泌体三维支架的制备。用镁黄长石(AKT)生物陶瓷浸提液完全培养基作用RAW264.7巨噬细胞3天后，收集上清液，提取外泌体。将镁黄长石生物陶瓷诱导的外泌体和其他材料制备成为生物墨水并进行3D打印。AKT诱导的外泌体三维支架可调控巨噬细胞的炎症响应，促进干细胞的成骨分化及成血管相关基因的表达，增强细胞在支架表面的增殖和粘附。体内骨缺损实验表明，AKT诱导的外泌体三维支架可降低植入点的炎症反应，促进巨噬细胞向M2型转变，增强血管与新骨的形成。
实施例3
硅酸钙生物陶瓷诱导的外泌体三维支架的制备。将硅酸钙陶瓷粉体压片(CS)，利用其降解液作用骨髓来源的间充质干细胞，七天后收集细胞上清液，提取CS诱导的干细胞源外泌体。将硅酸钙生物陶瓷诱导的外泌体和其他材料制备成为生物墨水并进行挤出式生物3D打印。结果发现，在外泌体三维支架中添加生物陶瓷纳米颗粒，可显著提高支架的力学强度与诱导干细胞成骨分化的能力。体内实验表明，CS诱导的外泌体/生物陶瓷复合三维支架可促进外泌体诱导骨缺损再生的能力。
实施例4
生物金属材料诱导的外泌体三维支架的制备。制备三维铁基支架(FS)，取其降解液作用于脐静脉内皮细胞，3天后收集细胞上清液，差速离心法提取FS诱导的内皮细胞源外泌体。将FS诱导的内皮细胞源外泌体和其他材料制备成为生物墨水并进行喷墨式生物3D打印。FS诱导的外泌体可提高内皮细胞的迁移和小管形成，促进内皮细胞在支架上的增殖与成血管相关基因的表达。体内实验表明FS诱导的外泌体三维支架可通过促进新生血管的形成，加快皮肤创伤的愈合。
实施例5
生物复合材料诱导的外泌体三维支架的制备。制备氧化锌/聚合物纳米纤维复合膜(ZP)，在其上培养巨噬细胞，3天后取巨噬细胞上清液，提取ZP诱导的巨噬细胞源外泌体。将ZP诱导的巨噬细胞源外泌体和其他材料制备成为生物墨水，并进行投影式光固化生物3D打印。ZP诱导的外泌体三维支架可通过表面的外泌体释放及作用调控巨噬细胞的极化及炎症因子的表达，促进内皮细胞在支架表面的粘附与成血管活性，从而促进皮肤创伤的愈合。

Claims (10)

1.一种生物材料诱导的外泌体三维支架，其特征在于，所述外泌体三维支架是利用可降解生物材料诱导细胞源分泌的外泌体并将其使用3D打印一体化成型得到的具有三维可控结构的外泌体支架；外泌体均匀分布于所述支架中；其中，外泌体在所述外泌体三维支架中的质量百分含量为0.003-0.05%。
2.根据权利要求1所述的生物材料诱导的外泌体三维支架，其特征在于，所述外泌体三维支架的孔结构根据3D打印参数的调节而适应性调整；优选地，所述外泌体三维支架的孔隙率为30%-70%；更优选地，所述支架的贯通孔孔径为0.2-0.6mm，孔深为0.8-5mm，孔间距为0.8-1.6mm。
3.根据权利要求1或2所述的生物材料诱导的外泌体三维支架，其特征在于，所述外泌体三维支架的储能模量为104-106Pa，损耗模量为103-105Pa。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的生物材料诱导的外泌体三维支架，其特征在于，所述外泌体三维支架在基础培养基中释放一个月后外泌体的滞留率为50%-80%，支架降解率为15%-40%。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的生物材料诱导的外泌体三维支架，其特征在于，所述可降解生物材料包括生物陶瓷、生物玻璃、生物金属材料、生物复合材料中的一种或多种的混合物；所述外泌体是免疫细胞源外泌体、干细胞源外泌体、内皮细胞源外泌体中的一种或多种的混合物。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的生物材料诱导的外泌体三维支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）生物材料诱导的外泌体的提取：向含有生物材料的培养基中加入细胞，培养完成后，收集细胞上清液并分离纯化上清液中的外泌体；
（2）外泌体三维支架的制备：将包含生物材料诱导的外泌体和高分子材料的原料均匀混合于磷酸盐缓冲液或生理盐水溶液中以配制为生物墨水，并将该生物墨水通过3D打印技术成型后交联以得到所述外泌体三维支架。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述生物墨水中生物材料诱导的外泌体的浓度为50~400 μg/mL。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述交联是氯化钙交联、光交联或者低温交联。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述生物墨水还包括生物陶瓷粉、可降解生物活性纳米颗粒、活性酶或生长因子中的一种或多种的混合物。
10.权利要求1至5中任一项所述的生物材料诱导的外泌体三维支架在免疫调控、成骨、成血管、软修复、组织修复中的应用。
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