CN107551311A - 一种可控药物释放的取向多孔复合电纺纤维膜及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物材料领域,公开了一种可控药物释放的取向多孔复合电纺纤维膜,以左旋聚乳酸为基质,具有单一取向结构,并且在纤维表面分布纳米孔,负载药物的介孔二氧化硅纳米粒子分布在纤维内部。所述纤维膜通过混合静电纺丝技术制备,工艺简单易控。多级纳米结构与可控释放的药物以及Si离子产生协同作用,能够促进创伤区域血管新生从而加快了糖尿病伤口的愈合,可用作新型的创面修复敷料。
Description
技术领域
本发明属于生物材料领域,涉及一种可控药物释放的取向多孔复合电纺纤维 膜及其制备方法和应用。
背景技术
慢性溃疡是糖尿病最严重的并发症之一,糖尿病患者的脚部皮肤一旦发生创 伤,就会面临着截肢的风险,从而导致医疗成本增加,病人生活质量差。正常的 皮肤伤口能够及时而有序地愈合,与之相比,糖尿病性伤口的典型特征为血管新 生不足和伤口愈合缓慢,这是由于血液中葡萄糖长期处于较高水平,从而显著降 低血管生成因子的分泌,并减少角质细胞的迁移和增殖以及伤口的再上皮化[1]。
近些年来兴起的组织工程为皮肤创面修复提供了一种新方法。这种方法的核 心是制备人工合成的支架材料,再结合生长因子、药物或无机颗粒等来构建组织 工程化皮肤,有效治疗和修复皮肤损伤。电纺纳米纤维膜具有较多的结构上的优 势,如其纳米级纤维结构与细胞外基质结构相类似,多孔互连的3D网络结构, 高的比表面积和孔隙率,所以在近年来其作为皮肤组织工程支架受到研究者们的 广泛重视。在先前的研究中,为了快速有效地促进创伤区域的血管生成,通常会 将血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子(EGF)等外源性的生长因子掺 入伤口敷料材料中。然而这种方法存在一些缺陷,比如会引发并发症,而且生长 因子存在半衰期短、蛋白质不稳定、成本高等弊端。因此,如果我们能设计一种 电纺纤维支架,其自身的物理或化学信号能够有效地促进伤口区域血管新生从而 加速慢性创伤的愈合,它将在皮肤组织工程中具有巨大的应用前景。
一系列研究表明,电纺纤维的取向结构可以精确控制细胞排列并能促进内皮 细胞成血管分化。除此之外,纳米孔作为一种单根电纺纳米纤维表面的二级纳米 结构,研究表明其可以显著增加蛋白质吸附位点,并且对细胞附着、增殖和分化 具有较好的促进作用。因此,如果在取向的电纺丝纳米纤维的表面上引入纳米孔, 则这种构建的多级纳米结构可以从结构上多重诱导内皮细胞成血管化行为,从而 进一步加快糖尿病伤口的愈合过程。
除了结构诱导以外,皮肤组织工程支架上的生物活性成分也在糖尿病伤口愈 合中起重要作用。二甲基草酰甘氨酸(DMOG)作为生长因子的替代物,其可诱 导缺氧微环境并稳定缺氧诱导因子1α(HIF-1α)。然而,过量使用DMOG存在 副作用,例如促进大量血管生成从而导致肿瘤的形成以及增加红细胞生成等。因 此,临床上需要一种可以在糖尿病伤口愈合过程中长时间持续递送适当剂量 DMOG药物的控释系统。介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs)具有高比表面积和大 孔体积,是一种有效的可控药物释放载体。除此之外,在生物应用过程中,Si 离子还可以从可降解的MSNs中释放出来,并且已经有研究证明Si离子对内皮 细胞的成血管化起积极调控作用。
发明内容
本发明旨在提供一种可控制药物释放的取向多孔复合电纺纤维膜及制备方 法。
本发明还将上述可控药物释放的取向多孔电纺纤维膜用于制备生物材料,尤 其是创面修复敷料。
技术方案为,一种可控药物释放的取向多孔复合电纺纤维膜,以左旋聚乳酸 为基质具有单一取向结构,并且在纤维表面分布纳米孔,负载药物的介孔二氧化 硅纳米粒子分布在纤维内部。以左旋聚乳酸为基准,负载药物的介孔二氧化硅纳 米粒子的含量为0.001%~35%,优选为0.1%~20%。
所述的药物为促进创面愈合的药物,尤其是二甲基草酰甘氨酸(DMOG)。
所述的介孔二氧化硅纳米粒子的平均粒径为50~500nm,优选为100~ 200nm。载药前介孔二氧化硅纳米粒子的比表面积260~350m2/g,孔径2~5nm, 孔体积0.2~0.4cm3/g。载药后,介孔二氧化硅的比表面积150~200m2/g,孔径 2~5nm,孔体积0.1~0.25cm3/g。以介孔二氧化硅重量计,载药量为5~20mg/g, 优选为10~15mg/g。
上述可控药物释放的取向多孔复合电纺纤维膜的制备方法包括以下步骤:
将负载药物的介孔二氧化硅纳米粒子分散于溶剂中,搅拌下加入左旋聚乳 酸;用静电纺丝法制备可控药物释放的取向多孔复合电纺纤维膜。
所述的溶剂为二氯甲烷(DCM),左旋聚乳酸与溶剂的质量比为5~20:100; 左旋聚乳酸重均分子量10万~100万,优选为20万~50万;静电纺丝参数为: 施加的电压为8-12kV,溶液推进速率为0.01-0.03ml/min,喷丝头和滚筒之间的 距离为8-12cm,滚筒的转速为500-800r/min;在常温、相对湿度40~60%RH条 件下反应,在此条件下能够形成取向结构。制备后的电纺纤维膜真空干燥以去除 残余溶剂,真空干燥时间为8~48小时。
通过以下方法制备负载药物的介孔二氧化硅纳米粒子:介孔二氧化硅纳米粒 子在含有药物的溶液中浸泡12~120小时,优选为24~96小时;离心洗涤并干 燥。干燥条件优选为真空干燥。所述含有药物的溶液优选为含有2~50mg/ml药 物的磷酸缓冲液,pH=7.3~7.5,更优选的,pH=7.4。
所述介孔二氧化硅纳米粒子(载药前)的平均粒径为50~500nm,优选为 100~200nm。载药前介孔二氧化硅纳米粒子的比表面积260~350m2/g,孔径2~ 5nm,孔体积0.2~0.4cm3/g。
优选的,所述的制备方法,通过以下方法
所述介孔二氧化硅纳米粒子可采用以下方法制备:
(A)在60~90℃下,将硅源滴加到含有模板剂和刻蚀剂的水溶液中,继续 反应1~3hr;
(B)产物静置6~16hr,取上层混合液离心并洗涤;
(C)沉淀物在500~800℃下煅烧2~6hr。
硅元素与模板剂、刻蚀剂的摩尔比为1:0.05~0.25:1~4,优选为1:0.1~ 0.2:1.5~2.5;硅元素与水的用量比为50~100mmol:1L。
优选的模板剂为CTAB。所获得的介孔二氧化硅纳米粒子平均粒径为100~ 200nm,比表面积260~350m2/g,孔径2~5nm,孔体积0.2~0.4cm3/g。
所述的硅源为正硅酸乙酯或正硅酸丁酯;模板剂可选用十六烷基三甲基溴化 铵(CTAB),刻蚀剂为氟化铵。
本发明的一个优选方案中,采用二甲基草酰甘氨酸(DMOG)、介孔二氧化 硅纳米粒子(MSNs)和左旋聚乳酸(PLLA)为原材料,将DMOG装载入MSNs 中获取载药的MSNs(该体系简称为DS),利用静电纺丝将DS与PLLA混纺, 制备了具有可控药物释放的取向多孔复合电纺纤维膜(简称DS-PL)。这种纤维 膜,具有单一取向结构,并且单根纤维表面分布有椭圆形纳米孔,载药的介孔二 氧化硅纳米颗粒均匀分布在纳米纤维内部。
结果显示,所负载的药物如二甲基草酰甘氨酸(DMOG)分子等和Si离子 能在复合膜降解过程中持续释放出来。DMOG先从介孔二氧化硅纳米颗粒中释 放到多孔纤维膜中,再继续释放到环境中,起到缓释和控释的效果。Si离子还可 以从可降解的MSNs中释放出来,对内皮细胞的成血管化起积极调控作用。取向 多孔的多级纳米结构与可控释放的DMOG以及Si离子产生协同作用,能够促进 创面区域的血管新生,加快创面愈合速度。体外细胞实验结果证明这种取向多孔 DS-PL膜可以有效地促进人脐静脉血管内皮细胞的增殖、粘附、迁移和血管生成 相关基因表达。进一步采用糖尿病鼠体内伤口愈合实验证明了制备的DS-PL膜 显著改善了伤口区域的血管新生、再上皮化和胶原沉积以及炎症反应抑制情况, 最终促进了糖尿病伤口的快速愈合。
因此,这种可控药物释放的取向多孔复合电纺纤维膜能促进创面区域的血管 新生,抑制炎症基因的表达,加快创面愈合速度,提高创面修复质量,可用作创 面修复材料,尤其是糖尿病的创口愈合。这种纤维膜可控释放如DMOG等药物 和Si离子,对于糖尿病伤口区域的血管再生以及糖尿病伤口愈合效率提高具有 积极促进作用,在组织工程和伤口愈合应用中具有很高的研究价值,具有很强的 实用意义。
本发明采用混合静电纺丝的方法制备出多级纳米结构的复合电纺纤维膜,促 进创伤区域血管新生从而加快了糖尿病伤口的愈合。取向多孔的多级纳米结构与 可控释放的DMOG以及Si离子产生协同作用,能够促进创面区域的血管新生, 加快创面愈合速度。因此,本发明具有很强的实用意义。
本发明的有益效果在于:
(1)本发明通过混合静电纺丝技术制备了具有可控药物释放的取向多孔电 纺纤维膜;这种纤维膜具有良好的表面理化性质、药物和离子可控释放性能、成 血管化能力以及促创面愈合质量;取向多孔的多级纳米结构与可控释放的 DMOG等药物以及Si离子产生协同作用,能够促进创伤区域血管新生从而加快 了糖尿病伤口的愈合,可用作新型的创面修复敷料。
(2)本发明采用混合静电纺丝的技术,具有工艺简单,操作条件易于控制 等优点。
附图说明
图1为MSNs的表征图,其中(A)MSNs扫描电镜图像,(B)MSNs透射电镜 图像;(C)MSNs的大小分布图;(D)MSNs和DS的XRD小角衍射图;(E) MSNs和DS的孔径分布图;(F)MSNs和DS的氮等温吸脱附曲线。
图2为取向多孔的(A1、A2)PL、(B1-B2)5DS-PL、(C1-C2)10DS-PL和(D1-D2) 15DS-PL电纺膜的扫描电镜图(A1-D1)和透射电镜图(A2-D2);
图3为取向多孔PL(A3)、5DS-PL(B3)、10DS-PL(C3)、15DS-PL电纺膜(D3) 的相应孔径分布图。
图4为取向多孔的PL和DS-PL电纺膜的接触角图片。
图5为取向多孔的5DS-PL、10DS-PL和15DS-PL电纺膜的DMOG(A)和Si 离子(B)释放曲线图。
图6为取向多孔的PL、5DS-PL、10DS-PL和15DS-PL电纺膜的蛋白吸附图。 图7为实施例2中,取向多孔的PL、5DS-PL、10DS-PL和15DS-PL电纺膜对 HUVECs粘附、增殖和迁移的图像,(1)为在HUVECs表面的粘附图,(2)为 HUVECs的transwell迁移测定的典型图像,(3)为培养12小时后HUVECs体外 伤口愈合测定的典型图像。
图8为实施例2中,取向多孔的PL、5DS-PL、10DS-PL和15DS-PL电纺膜对 HUVECs粘附、增殖和迁移的定量分析,A:在1,3和7天对不同膜上培养的 HUVECs的增殖定量分析,B:在不同组中培养12小时后迁移的HUVECs的定量 分析,C:不同组HUVEC相对迁移百分比的定量分析。
图9为实施例2中,6小时后用不同膜(PL、5DS-PL、10DS-PL和15DS-PL) 培养的HUVECs的体外血管生成测定图像。
图10为实施例2中,6小时后培养板中管长(A)和节点数(B)的定量分析。 图11在PL、5DS-PL、10DS-PL和15DS-PL上分别培养3天和7天的HUVECs 的血管生成相关基因表达,A:HIF-1α、B:VEGF、C:KDR、D:Flt-1。
图12为实施例3手术后0、7、11、13和15天三组(对照组、PL和10DS-PL) 糖尿病小鼠背部皮肤大切口伤口图。A为大小变化图片;B为每个治疗组体内伤 口闭合痕迹,浅色区域显示在0天伤口面积,中间的深色区域表示伤口在n(n=7、 11、13和15)天的面积。
图13为实施例3中,糖尿病小鼠手术后各组伤口面积统计学分析。
图14为3组糖尿病组(对照组、PL组和10DS-PL组)血管新生结果,为手术 后第7天和第15天CD31在伤口床上的免疫荧光染色图,其中A为血管的CD31 的正面积;B为细胞核染色结果;C为血管化情况,其中箭头所指的为血管化区 域;比例尺=100μm。
图15为7天和15天后糖尿病伤口CD31阳性血管的定量分析。
图16为实施例3中,三组糖尿病组(对照组、PL组和10DS-PL组)胶原沉积 Q-PCR表达结果,A、B为术后7天I型胶原和III型胶原表达结果,C、D为 术后15天I型胶原和III型胶原表达结果
图17在实施例3中,术后7天(A)和15天(B)时,对照组、PL和10DS-PL 处理组的三色染色伤口组织切片的典型图像。
图18手术后7天(F)和15天(H)三组胶原阳性像素的量化分析。
图19为对照组、PL组和10DS-PL组的伤口组织中促炎细胞因子的基因表达。 在7天和15天下,IL-1β(A、D)、IL-6(B、E)和NF-κB(C、F)的基因表 达水平。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明,但它们并不是对本发明作任何限制。
实施例1具有可控药物释放的取向多孔电纺纤维膜的制备
(一)介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs)和装载DMOG的MSNs的制备及其形态表 征
制备介孔二氧化硅纳米粒子的方法如下
(A)将装有500mL去离子水的Duran试剂瓶放入80℃恒温水浴锅中,接着 将1.82g(约5mmol)十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和3.0g(约81mmol)氟 化铵(NH4F)刻蚀剂依次加入到瓶中。待整个反应体系温度稳定1h后,再将9mL 正硅酸乙酯(TEOS,约40mmol)用注射器逐滴缓慢滴入上述溶液中,滴加完TEOS 后再反应2h实验结束。
(B)将所得的产物放置过夜,将上层混合液转移到烧杯中,并利用高速离 心机在10000rpm下离心15min,接着用无水乙醇和去离子水反复洗涤离心产物。
(C)干燥后,在600℃下煅烧得到介孔二氧化硅纳米粒子。其电镜图如图 1的A和B所示。
制备的介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs)进一步制成载药的DS,步骤如下:
37℃时,将1g MSNs在含有75mg DMOG的5ml磷酸盐缓冲溶液(PBS, pH=7.4)中浸泡3天。经离心、洗涤后,将载有DMOG的MSNs在37℃下真 空干燥24小时。
MSNs和装载DMOG的MSNs(即DS)的形态和结构如图1所示。从图1A 中的SEM图像和图1B中相应的TEM图像可以看出,介孔二氧化硅纳米粒子 (MSNs)球体是相当均匀的,可以清楚地观察到球体内的蠕虫状孔结构;负载 DMOG后,载药的介孔二氧化硅纳米粒子SEM和TEM没有变化。图1C中的 定量结果进一步显示MSNs球体的平均直径约为137nm。图1D中的SAXRD图 谱显示,在MSNs和装载DMOG的MSNs(即DS)样品中,在2θ=1.5-2.0°处 存在不同的衍射峰,表明纳米小球存在有序介孔结构。然而,与纯MSNs相比, 装载有DMOG的MSNs的衍射强度变弱。如图1E和F所示,MSNs和载药的 DS都显示出典型的IV型等温曲线,并具有明显的毛细管冷凝步骤以及较窄的孔 径分布。这些结果进一步证实了MSNs中均匀的介孔通道结构的存在。从表1 中的N2吸脱附分析表明,MSNs的比表面积、孔径和孔体积分别为294.83m2/g, 3.61nm和0.26cm3/g。然而装载DMOG后,MSNs的比表面积、孔径和孔体积 都明显降低,载药量为13.7mg/g(1g MSNs能装载13.7mg的DMOG),装载 效率为24.4wt%。结果如表1所示。
表1.MSNs和DS的结构参数以及MSNs对DMOG的装载效率
(二)取向多孔DS-PL复合电纺纤维膜的制备及其形态和亲疏水性能表征
采用静电纺丝法制备DS含量分别为0、5%、10%和15%(以聚左旋乳酸重 量为基准)的取向多孔PLLA纳米纤维膜,用PL、5DS-PL、10DS-PL、15DS-PL 表示。分别将不同含量的DS超声分散在DCM中。然后,在连续搅拌下将重均 分子量30万的左旋聚乳酸(PLLA)加入到相应的悬浮液中(PLLA与DCM的 质量比为8:100),用静电纺丝法制备取向多孔复合电纺纤维膜。
纺丝参数:施加的电压为10kV,溶液推进速率为0.025ml/min,喷丝头和 滚筒之间的距离为10cm,滚筒的转速为600r/min,每张复合纤维膜纺丝时间为 3小时。实验在室温下进行,相对湿度约为50%RH。为了完全除去残余溶剂将 所有制备好的电纺纤维膜真空干燥24小时。
采用扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)和接触角(WCA)等对制备出的 具有可控药物释放的取向多孔电纺纤维膜的物相组成和表面微观结构进行分析 与表征。通过Image J软件测量纤维直径和孔径。从SEM图像中至少测量100 根纤维计算其平均纤维直径。选取SEM图像中20μm2作为单位面积,每组纳米 纤维的孔隙率(p)定义如下:
其中si为每个纳米孔的面积,n是规定区域内纤维表面纳米孔的总数,S是 规定区域内所有纤维的总表面积。各组纤维膜的孔径分布及孔隙率结果如图3 所示。PL、5DS-PL、10DS-PL、15DS-PL的孔隙率分别为32.21%、31.00%、29.55%、 26.17%。
PL和DS-PL电纺纤维膜的形态如图2所示。如图2A1-D1所示,所有纤维膜 都表现出良好的拓扑结构,纳米纤维以平行的方式排列,单根纤维的表面有许多 椭圆形纳米孔,并且沿着纤维方向分布。从图2A2-D2所示的TEM图像中可以清 楚地看出,在纯PLLA电纺纤维的内部没有纳米颗粒,而复合DS-PL电纺纤维 的内部分布有纳米颗粒并且其表面变得粗糙,表明DS已经掺入到复合纳米纤维 膜中。
通过接触角测量研究了PL和DS-PL电纺纤维膜的表面亲疏水性能。图4所 示的结果表明,在纳米纤维中加入DS后,复合膜的亲水性显著提高。
(三)复合纤维膜在体外对药物和离子的释放行为以及对蛋白的吸附行为
将复合电纺纤维膜剪成面积为2.0×2.0cm2的正方形样品,编号后并记录它 们的重量。37℃下将每个样品在摇床中浸入20ml PBS(pH=7.4)中,摇床振荡 速度为100r/min。在每个时间点收集4ml释放后的介质用于检测,并倒入等体 积的新鲜PBS。使用UV-vis分光光度计在230nm处测定收集溶液中释放的 DMOG的量。通过感应耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)测定复合膜中 释放的Si离子的浓度。结果如图5。
选择牛血清白蛋白(BSA)为模型蛋白,用来研究取向多孔DS-PL电纺纤 维膜(5DS-PL、10DS-PL和15DS-PL)的蛋白质吸附性能。在37℃下每个样 品取40mg在摇床中浸泡在2.5ml具有不同BSA浓度(250、500、1000、1500 和2000μg/ml)的PBS(pH=7.4)中。12小时后,将上述膜用PBS洗涤,并在 真空烘箱中干燥。通过UV-vis分光光度计测量PBS中残留BSA的浓度,获得每 个样品吸收的BSA的量。结果如图6。
从图5A中可以看出DMOG在前48h迅速释放,累积释放浓度为0.027mg/ml (5DS-PL)、0.068mg/ml(10DS-PL)和0.089mg/ml(15DS-PL)。然后,释放 速度减慢,360小时后,三组释放的DMOG浓度达到平衡,最高达0.045mg/ml (5DS-PL)、0.11mg/ml(10DS-PL)和0.14mg/ml(15DS-PL)。结果显示,从 15DS-PL和10DS-PL膜释放的DMOG的浓度显著高于5DS-PL膜的浓度。
研究了5DS-PL、10DS-PL和15DS-PL复合膜在3天,7天和15天累积释 放的Si离子浓度,结果如图5B所示。随着释放时间的增加,三组复合膜释放的 Si离子浓度增加。15天后,5DS-PL、10DS-PL和15DS-PL组中释放的Si离子 浓度为1.45μg/ml、2.11μg/ml和2.90μg/ml。结果表明,随着复合膜中掺入的DS 量的增加,释放出的Si离子浓度增加,并且与其他两组相比15DS-PL组的释放 出的Si离子浓度最高。
如图6所示,BSA对取向多孔复合膜的吸附能力随着BSA浓度的增加而增 加,最终达到吸附饱和度。与PL、5DS-PL和15DS-PL膜相比,10DS-PL吸附 能力最大,吸附量达92.9mg/g。
实施例2
实施例1所制备具有可控药物释放的取向多孔电纺纤维膜对HUVECs粘附、增 殖、迁移、成血管化和血管相关基因表达的影响:
2.1细胞粘附、增殖和迁移
HUVECs购自华东师范大学细胞库,并在补充了2.5%胎牛血清、1%内皮细 胞生长补充剂和1%青霉素-链霉素的内皮细胞培养基中培养。细胞在37℃/5% CO 2培养箱中培养,培养基每2天更换一次。在细胞实验之前,将所有的膜剪成 可以与培养板的大小完全吻合的圆形片,然后将样品用75%乙醇灭菌30分钟, 并用PBS洗涤三次。
用CCK-8法分析HUVECs在取向多孔复合纤维膜上的增殖情况。将密度为 1×104个细胞/孔的HUVECs接种在48孔培养板中DS-PL膜的表面上培养1、3 和7天。在每个时间点向每个孔中加入20μL CCK-8溶液,然后将体系培养4小 时。使用酶标仪在450nm下测量样品的吸光度值。
为了观察DS-PL膜上的细胞粘附形态,将HUVECs接种在24孔板中的 DS-PL膜上,密度为2×104个细胞/孔,并在培养箱中培养3天。然后,用4% (w/v)多聚甲醛固定细胞20分钟,用1%BSA封闭20分钟。在0.1%Triton-X10 中透化5分钟后,在室温下将样品在新鲜制备的FITC-鬼笔环肽中培养40分钟, 从而对细胞的肌动蛋白丝染色。最后,加入4,6-二脒基-2-苯基吲哚溶液(5mg/ml) 用于复染细胞核。通过共焦激光扫描显微镜观察共聚焦图像。图像结果如图7。
细胞培养3天后,观察了HUVECs在PL、5DS-PL、10DS-PL和15DS-PL 膜上的形态和粘附情况。如图7(1)所示,与PL膜相比DS-PL膜上的HUVECs 沿着纳米纤维的方向延伸,HUVECs在10DS-PL膜上粘附较好,并且附着在其 上的细胞数高于其他组。
HUVECs在DS含量不同的DS-PL电纺膜上的增殖行为如图8A所示。结果 表明,随着培养时间的延长,细胞在三组电纺纤维膜上均能生长。并且培养7 天后,在复合DS-PL膜上培养的HUVEs数量明显高于PL膜,表明DS的掺入 对HUVECs增殖具有促进作用。
使用伤口愈合迁移试验在体外评估DS-PL膜对HUVECs迁移的影响。将 HUVECs以密度为4×104个细胞/孔接种在24孔培养板中,并在培养箱中培养 24小时,直到达到约90%汇合,用无菌的100μL移液管枪头在中间产生“伤口”。 然后将含有不同电纺丝释放物的新鲜培养基加入相应的孔中。培养12小时后, 将细胞固定并拍照,伤口愈合测定的图像如图7(3),迁移细胞。
使用Transwell测定法来研究HUVECs入侵情况。将不同电纺纤维膜置于24 孔板中的下室,然后将200μL密度为1×104个细胞的HUVECs接种于上室。培 养12小时后,将入侵的细胞固定,用0.1%(w/v)结晶紫染色10分钟。用显微 镜拍摄入侵的细胞。
如图7(2)和图8B所示,HUVECs在复合DS-PL膜上迁移的数目多于纯PL 组。划线测试的结果如图7(3)和图8C,显示细胞迁移12h后,PL组细胞迁移率 约为50.1±3.8%,而5DS-PL、10DS-PL和15DS-PL组细胞迁移率约为62.2± 2.3%、72.7±0.7%和71.5±1.1%。与其他三组相比,10DS-PL组显著促进 HUVECs的侵袭和迁移。
2.2具有不同DS含量的取向多孔电纺膜对HUVECs成管和血管生成相关基因 表达的影响
将基质胶在4℃下解冻过夜,然后将24孔板的每个孔用100μL基质胶进行 包被,并在37℃下培养30分钟。将HUVECs(2×104个细胞)接种在每个孔中, 然后将浸在培养基中的不同电纺纤维膜置于Boyden室中。在37℃/5%CO2共培 养6小时后,用显微镜评估内皮细胞的成管能力。
伤口组织的RT-PCR检测:通过Trizol提取重新上皮化的皮肤组织的总 RNA。对于cDNA合成,使用Prime ScriptTM RT Master Mix将分离的RNA(1μg) 在37℃下反转30分钟和85℃10秒钟。使用SYBR Green检测试剂(进行Q-PCR 测试。使用肌动蛋白作为参照基因。主要检测相关成血管化基因(VEGF、KDR、 HIF-1α和Flt-1)。简要步骤如下:样本处理;细胞样品Total RNA的抽提;用逆 转录酶Reverse Transcriptase M-MLV(D2640A,Takara)进行逆转录合成cDNA; Real time PCR扩增体系和反应条件;数据分析。
如图9所示,6小时后,所有组上的HUVECs在Matrigel上均形成毛细管状 网络结构。然而,用不同膜培养的HUVECs表现出不同的成管行为。如图10所 示,与PL组相比,DS-PL组的管长较长,节点数较多,特别是10DS-PL组中管 长最长,节点数最多(图10A和B)。
研究HUVECs在取向多孔DS-PL电纺纤维膜上培养3、7天后对血管生成 相关基因表达的影响。如图11所示,在复合DS-PL膜上培养的HUVECs的 HIF-1α、VEGF、KDR和F1t-1的基因表达高于在纯PLLA膜上培养的细胞的基 因表达,其中10DS-PL组比其他3组的基因表达水平更高。
实施例3
本实施例研究具有可控药物释放的取向多孔电纺纤维膜对小鼠体内的创面 修复质量的影响。
3.1取向多孔复合DS-PL膜加速糖尿病伤口愈合
为了诱导糖尿病样症状,将6-8周C57BL/6小鼠连续5天腹腔注射链脲霉素 (每天50mg/kg体重)。在注射后10天使用葡萄糖计测量小鼠的血糖水平,如果 血糖高于20mM,则将此小鼠视为糖尿病鼠。根据葡萄糖水平,将小鼠(n=12/ 组)随机分配给对照组、PL和DS-PL组。
用吸入的异氟烷(5%)的方法将糖尿病小鼠(12-14周)麻醉,并刮掉小鼠 的背部毛发。在每只小鼠的背部形成直径为8mm的圆形皮肤伤口。用不同电纺 纤维膜(空白、PL和DS-PL)对伤口进行处理。将这些膜(直径8mm)用75% 乙醇溶液灭菌30分钟,然后用灭菌的PBS洗涤三次,然后植入伤口部位。空白 组只用透气膜处理。在第0、7、11、13和15天拍摄伤口图片,并由Image J计 算剩余伤口面积。结果如图12和图13。
如图12A和B所示,随着时间的推移,三组的伤口面积都变小。如图13所 示,与对照组(70%)不同,PL和10DS-PL膜的伤口愈合率在11天时分别为 76%和82%。术后15天,用PL和10DS-PL膜治疗的组伤口愈合率为94%和97%, 明显高于对照组(84%)。与PL和对照组相比,用10DS-PL膜处理的伤口愈合 率最高。
3.2取向多孔复合DS-PL膜刺激糖尿病创伤中的血管生成
采用CD31免疫荧光染色对糖尿病伤口区域的血管生成情况进行评估。将样 品在柠檬酸钠缓冲液中煮沸,然后在4℃下与CD31抗体(Abcam)一起温育过 夜。将切片与二次抗体在室温下培养2小时。
将DAPI溶液(5mg/ml)加入到组织切片中用于复染细胞核。最后,用光学 显微镜(徕卡共焦显微镜)拍照,结果如图14,A为血管的CD31的正面积;B 为细胞核染色结果;C为血管化情况,其中箭头所指的为血管化区域。与PL和 对照组相比,用10DS-PL膜处理的伤口区域CD31和血管化更为明显。
不管是治疗7天后还是15天后,与PL和对照组相比,用10DS-PL膜处理 的伤口区域CD31的量都显著增加(图15)。
3.3取向多孔复合DS-PL膜刺激糖尿病伤口中的胶原蛋白沉积。
将组织用4%多聚甲醛固定至少48小时,然后用不同浓度的乙醇(50%、 70%、80%、95%和100%)脱水并包埋在石蜡中。将石蜡包埋的组织切成厚度 为5μm的切片,并平铺在载玻片上。为观察术后第7和15天胶原沉积的情况, 用二甲苯脱蜡,用100%、95%、80%和70%乙醇再水合,然后用苏木精和伊红 (HE)和马尾三色染色。使用光学显微镜(Leica共焦显微镜)拍摄图像。
通过Q-PCR评估伤口组织中胶原I和III的表达。如图16所示,结果表明, 在治疗7天后PL和10DS-PL组的胶原I(图16A)和胶原III(图16B)的表达 水平均高于对照组,特别10DS-PL治疗组。15天后,如图16C和D所示,与 PL和对照组相比10DS-PL组胶原I的表达明显增加,但胶原III的表达水平较 低。在图17所示的三色染色图像中,治疗7天后,与对照组相比,在PL和10DS-PL 组中观察到更多的胶原纤维,并且胶原纤维相互交织并倾向于构建网络结构。图 18所示伤口部位沉积胶原蛋白的定量分析表明,10DS-PL治疗组胶原蛋白沉积明显高于PL组和对照组。在15天时,与PL和对照组相比,10DS-PL处理组的 伤口组织中的胶原纤维倾向于形成更密集和有序的结构(图17A和B)。
3.4取向多孔复合DS-PL膜抑制糖尿病损伤中促炎细胞因子的基因表达
过Trizol提取重新上皮化的皮肤组织的总RNA。对于cDNA合成,使用PrimeScriptTM RT Master Mix将分离的RNA(1μg)分别在37℃下反转30分钟和在 85℃下反转10秒钟。使用SYBR Green检测试剂进行Q-PCR测试,使用肌动蛋 白作为参照基因。
通过Q-RT-PCR研究了三组(对照组、PL组和10DS-PL组)在糖尿病损伤 愈合过程中伤口组织中促炎细胞因子IL-1β、IL-6和NF-κB的表达,术后7天、15天的表达量如图19所示。结果表明,术后第7天,PL和10DS-PL组与对照 组相比,能够显著下调IL-1β、IL-6和NF-κB的表达(图19A-C)。15天后,10DS-PL 组IL-1β、IL-6和NF-κB的表达明显低于其他两组(图19D-F)。
Claims (10)
1.一种可控药物释放的取向多孔复合电纺纤维膜,以左旋聚乳酸为基质,其特征在于,具有单一取向结构,并且在纤维表面分布纳米孔,负载药物的介孔二氧化硅纳米粒子分布在纤维内部;以左旋聚乳酸用量为基准,负载药物的介孔二氧化硅纳米粒子的含量为0.001%~35%。
2.权利要求1所述可控药物释放的取向多孔复合电纺纤维膜的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
将负载药物的介孔二氧化硅纳米粒子分散于溶剂中,搅拌下加入左旋聚乳酸;用静电纺丝法制备可控药物释放的取向多孔复合电纺纤维膜。
3.权利要求2所述的制备方法,其特征在于,静电纺丝法的参数为:施加的电压为8-12kV,溶液推进速率为0.01-0.03mL/min,喷丝头和滚筒之间的距离为8-12cm,滚筒的转速为500-800r/min。
4.权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述的左旋聚乳酸重均分子量为10万~100万。
5.权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述的溶剂为二氯甲烷,左旋聚乳酸与二氯甲烷的质量比为5~20:100。
6.权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述的负载药物的介孔二氧化硅纳米粒子通过以下方法制备:
介孔二氧化硅纳米粒子在含有药物的溶液中浸泡12~120小时,优选为24~96小时;离心洗涤并干燥;所述介孔二氧化硅纳米粒子的平均粒径为50~500nm,比表面积260~350m2/g,孔径2~5nm,孔体积0.2~0.4cm3/g。
7.权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述介孔二氧化硅纳米粒子通过以下方法制备:
(A)在60~90℃下,将硅源滴加到含有模板剂和氟化铵的水溶液中,继续反应1~3hr;硅元素与模板剂、刻蚀剂的摩尔比为1:0.05~0.25:1~4,硅元素与水的用量比为50~100mmol:1L;
(B)产物静置6~16hr,取上层混合液离心并洗涤;
(C)沉淀物在500~800℃下煅烧2~6hr。
8.权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述的硅源为正硅酸乙酯或正硅酸丁酯;模板剂可为十六烷基三甲基溴化铵,刻蚀剂为氟化铵。
9.权利要求1所述的可控药物释放的取向多孔复合电纺纤维膜用于制备创面修复材料。
10.权利要求1所述的可控药物释放的取向多孔复合电纺纤维膜用于制备促进糖尿病创口愈合的修复材料。
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