CN108578767B - 一种具有仿生表面的取向多孔复合电纺纤维支架及其制备方法和应用 - Google Patents

一种具有仿生表面的取向多孔复合电纺纤维支架及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物材料领域，具体涉及一种具有仿生表面的取向多孔复合电纺纤维支架，由单一取向排列的表面分布有纳米孔的复合纤维构成，其内分布有介孔，所述复合纤维为以单一取向排列的表面分布有纳米孔的左旋聚乳酸电纺纤维为基体，基体表面修饰聚多巴胺，或基体表面修饰的聚多巴胺接枝促软骨修复药物。本发明复合电纺纤维支架采用静电纺丝技术制备，工艺简单易控。本发明复合电纺纤维支架的取向及多孔物理结构与生物活性聚多巴胺及促软骨修复药物产生协同作用，能够促进软骨细胞和骨髓间质干细胞的粘附、增殖、成软骨分化基因表达及软骨细胞外基质的生成，加快体内软骨缺损的愈合，尤其是关节软骨缺损的愈合，可用作新型的软骨再生材料。

Description

一种具有仿生表面的取向多孔复合电纺纤维支架及其制备方 法和应用
技术领域
本发明属于生物材料领域，涉及一种具有仿生表面的取向多孔复合电纺纤维支架及其制备方法和应用。
背景技术
创伤、新陈代谢疾病和关节感染等引起的关节软骨缺损已成为临床常见疾病之一。成熟的软骨组织内部无血管结构且细胞活性低，这些均限制了其自我修复能力。目前用于治疗关节软骨缺损的传统方法如关节镜技术、软骨移植和软骨细胞移植等都存在一些弊端，例如，关节镜技术在治疗大面积的软骨缺损时效果较差，软骨移植存在自体供体有限、异体移植存在免疫排斥等缺陷，软骨细胞移植则治疗周期较长、会引起骨膜增生、免疫排斥等。因此，寻求可靠、安全和有效的修复软骨缺损的方法具有重要的意义。
由于软骨组织由大量的细胞外基质(ECM)和少量软骨细胞组成，因此，加快缺损区域ECM的形成是促进软骨组织再生的关键。目前，快速发展的软骨组织工程为解决这一问题提供了有效方法。通过静电纺丝技术制备出的纳米纤维能较好地模拟天然软骨ECM的结构和生物学功能。电纺纳米纤维具有较高的比表面积、高孔隙率和高体积比，这些优点均有利于细胞交流、细胞粘附和营养转运。除此之外，还可以通过调控电纺过程中的实验参数，实现具有可控微纳米结构的电纺纤维材料的制备。由于天然关节软骨结构中的软骨细胞和ECM呈取向分布，因此，制备具有取向结构的电纺纤维材料能够更好地仿生天然软骨细胞外基质的结构，模拟软骨细胞生长的物理微环境，促进软骨细胞等种子细胞的取向排布、生长和分化行为，从而加快软骨缺损的修复。除此之外，研究人员发现电纺纤维在微观和纳米尺度上的改变能够影响细胞粘附和增殖行为。一系列研究表明电纺纳米纤维表面的纳米孔结构，可以进一步提高纤维表面的粗糙度和比表面积，从而显著增加蛋白质吸附以及细胞粘附位点，对细胞粘附、铺展和增殖具有较好的促进作用。因此，在取向电纺纳米纤维的表面上引入纳米孔，这种具有多级纳米结构的电纺纤维可以从结构上多重诱导软骨细胞生长，从而进一步促进软骨组织的再生。
除了提供有利的物理结构支撑与引导，软骨组织工程支架表面的生物活性成分也在软骨组织再生中起到重要作用。硫酸软骨素(CS)是一种糖胺聚糖(GAG)，是软骨ECM的重要成分。CS参与大蛋白聚糖如聚集蛋白聚糖的聚集，并且其高负电荷可以产生电荷梯度，使软骨膨胀并增强组织维持负荷的能力。因此，如果在软骨组织工程支架的表面修饰一层CS，可以进一步在成分上模拟天然软骨组织微环境，有效地诱导软骨组织的形成。
生物粘附分子表面改性是一种很有发展潜力的改性技术。多巴胺是一种贻贝黏附蛋白，含有丰富的乙氨基和儿茶酚活性官能团，几乎能粘附在任何机体的表面，该反应过程简单，无毒无害，而且多巴胺本身具有很好的细胞相容性，能够较好地改善基体材料的细胞相容性和粘附性，可以进一步提高支架的生物活性。在本研究中，利用多巴胺表面涂覆技术在多孔取向的电纺纤维支架表面进行改性，接枝一层CS大分子，从结构和成分上模拟天然软骨组织微环境，协同促进软骨组织的再生。
发明内容
本发明旨在提供一种具有仿生表面的取向多孔复合电纺纤维支架，该材料可以有效地促进软骨细胞和骨髓间质干细胞的粘附、增殖及软骨生成相关基因的表达，促进软骨缺损区域软骨细胞粘附、增殖及软骨细胞外基质(ECM)的生成，促进软骨缺损的快速愈合。
本发明还提供该具有仿生表面的取向多孔复合电纺纤维支架的制备方法及应用。
本发明的技术方案为：一种具有仿生表面的取向多孔复合电纺纤维支架，由单一取向排列的表面分布有纳米孔的复合电纺纤维构成，其内分布有介孔，所述复合电纺纤维为：以单一取向排列的表面分布有纳米孔的左旋聚乳酸电纺纤维为基体，基体表面修饰聚多巴胺，或基体表面修饰的聚多巴胺接枝促软骨修复药物。左旋聚乳酸电纺纤维表面修饰的聚多巴胺或者接枝促软骨修复药物的聚多巴胺形成复合电纺纤维及复合电纺纤维支架的仿生表面。
左旋聚乳酸电纺纤维的直径为3～8μm，左旋聚乳酸电纺纤维的平均直径为4～5.8μm，作为本发明的一个优选方案，平均直径为4.92μm；左旋聚乳酸表面修饰聚多巴胺的复合电纺纤维的直径为3～8μm，左旋聚乳酸表面修饰聚多巴胺的复合电纺纤维的平均直径为4.2～6μm，作为本发明的一个优选方案，平均直径为4.95μm；左旋聚乳酸表面修饰接枝有促软骨修复药物的聚多巴胺的复合电纺纤维的直径为3～8.5μm，左旋聚乳酸表面修饰接枝有促软骨修复药物的聚多巴胺的复合电纺纤维的平均直径为4.5～6.5μm，作为本发明的一个优选方案，平均直径为5.14μm。
上述具有仿生表面的取向多孔复合电纺纤维支架的制备方法，包括以下步骤：
(1)将左旋聚乳酸溶于有机溶剂中，在常温、相对湿度40％～60％条件下，用静电纺丝法制备左旋聚乳酸电纺纤维；
(2)将步骤(1)制备的左旋聚乳酸电纺纤维避光、恒温浸入含有碱性缓冲剂的多巴胺溶液中，在左旋聚乳酸电纺纤维表面修饰聚多巴胺。
或者，制备方法还包括步骤(3)：
(3)将步骤(2)制备的表面修饰有聚多巴胺的左旋聚乳酸电纺纤维恒温浸入促软骨修复药物溶液中，在聚多巴胺上接枝药物；
步骤(1)中，静电纺丝法的参数为：施加的电压为8～12kV，溶液推进速率为0.01～0.03ml/min，喷丝头和滚筒之间的距离为8～12cm，滚筒的转速为500～800r/min。
步骤(1)中，左旋聚乳酸的重均分子量10万～100万，优选为20万～50万；有机溶剂一般有二氯甲烷、三氯甲烷、三氟乙醇等，优选为二氯甲烷；左旋聚乳酸与有机溶剂的质量比为1：5～20，优选为1：10。
步骤(1)制备的左旋聚乳酸电纺纤维还需干燥处理，用以除去残余溶剂，干燥处理的方法为真空干燥8～48小时。
步骤(1)制备的左旋聚乳酸电纺纤维为单一取向且表面分布有纳米孔的取向纤维，优选地，左旋聚乳酸电纺纤维间呈单一取向平行排列。
步骤(2)中，多巴胺溶液的pH值为8～10，优选为8.5；多巴胺的浓度为1～10mg/mL，优选为2～6mg/mL，更优选为6mg/mL；碱性缓冲剂的浓度为8～12mmol/L，优选为10mmol/L；碱性缓冲剂为三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸。
步骤(2)中，浸入温度为25℃～40℃，优选为30℃～40℃，更有选为35℃～37℃。浸入时间为2～48小时，优选为12～36小时，作为本发明的一个优选方案，为24小时。
步骤(2)中，在左旋聚乳酸电纺纤维表面修饰聚多巴胺后，还进行洗涤、干燥。洗涤溶剂为水，尤其是去离子水；干燥为真空干燥。
步骤(3)中，所述促软骨修复药物溶液为水溶液，促软骨修复药物溶液中促软骨修复药物的浓度为1～20mg/mL，优选为10mg/mL；所述促软骨修复药物包括硫酸软骨素、氨糖软骨素或者透明质酸等，优选为硫酸软骨素。
步骤(3)中，浸入温度为25℃～40℃，优选为30℃～40℃，更有选为35℃～37℃。浸入时间为1～7天，优选为3天。
步骤(3)中，在聚多巴胺上接枝药物后，还进行洗涤、干燥。洗涤溶剂为水，尤其是去离子水；干燥为真空干燥。
作为本发明的一个优选方案，(1)将左旋聚乳酸溶于二氯甲烷中，左旋聚乳酸与二氯甲烷的质量比为1：10，在常温、相对湿度50％条件下，用静电纺丝法制备左旋聚乳酸电纺纤维，并干燥；
静电纺丝法的参数为：施加的电压为10kV，溶液推进速率为0.025mL/min，喷丝头和滚筒之间的距离为10cm，滚筒的转速为600r/min；
(2)将步骤(1)制备的左旋聚乳酸电纺纤维在避光、37℃条件下，浸入含有三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸、pH＝8.5的多巴胺溶液中，放置24小时，在左旋聚乳酸电纺纤维表面修饰聚多巴胺，并洗涤、干燥；多巴胺溶液中，多巴胺的浓度为6mg/mL，三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸的浓度为10mmol/L；
(3)将步骤(2)制备的表面修饰有聚多巴胺的左旋聚乳酸电纺纤维在37℃条件下，浸入10mg/mL的硫酸软骨素水溶液中，放置3天，在聚多巴胺上接枝硫酸软骨素，并洗涤、干燥。
本发明利用静电纺丝技术制备的左旋聚乳酸电纺纤维支架，其内分布介孔，单根左旋聚乳酸电纺纤维表面分布有椭圆形纳米孔，左旋聚乳酸电纺纤维间呈单一取向排列，尤其是单一取向平行排列。通过在左旋聚乳酸电纺纤维表面修饰聚多巴胺，以及在聚多巴胺上接枝促软骨修复药物，制备具有仿生表面的取向多孔复合电纺纤维支架，其内同样分布介孔结构；构成该具有仿生表面的取向多孔复合电纺纤维支架的单根复合电纺纤维的表面同样分布有椭圆形纳米孔，复合电纺纤维间同样呈单一取向排列，尤其是单一取向平行排列。电纺纤维支架内的介孔结构及单根电纺纤维表面的纳米孔结构构成电纺纤维支架的多级纳米孔结构。
本发明通过静电纺丝法制备的取向多孔复合电纺纤维支架，其单一取向、纤维支架内介孔及单根复合电纺纤维上的纳米孔结构，提高其比表面积、孔隙率、体积比和粗糙度，仿生天然软骨细胞外基质(ECM)结构及其生物学功能；聚多巴胺(PDA)良好的生物粘附性和生物相容性，促进取向多孔复合电纺纤维支架的粘附固定，及软骨组织细胞的粘附生长；聚多巴胺表面接枝的促软骨修复药物能持续释放，保持药物有效性和安全性，如接枝药物硫酸软骨素，参与大蛋白聚糖如聚集蛋白聚糖的聚集，并产生电荷梯度，使软骨膨胀增强其维持负荷的能力，促进软骨细胞外基质的生成；多级纳米孔结构、聚多巴胺改性层及接枝药物硫酸软骨素产生的协同作用，促进软骨缺损部位的软骨再生，加快软骨缺损愈合速度。
且实验证明，本发明具有仿生表面的取向多孔复合电纺纤维支架有效地促进软骨细胞的粘附和增殖、骨髓间质干细胞的粘附和增殖、骨髓间质干细胞成软骨分化基因表达、及软骨细胞外基质(ECM)的生成，促进软骨再生，提高再生软骨质量，加快软骨缺损愈合，可用作软骨缺损修复材料，尤其是关节软骨缺损修复材料。
相对于现有技术，本发明的有益效果在于：
(1)本发明通过静电纺丝技术制备了具有仿生表面的取向多孔复合电纺纤维支架，其单一取向、多级纳米孔结构，仿生表面良好的理化和生物活性、药物和离子释放性能，用作软骨修复材料，促进软骨再生，提高软骨缺损愈合质量。
(2)本发明采用的静电纺丝技术，具有工艺简单、操作条件易于控制等优点。
附图说明
图1为PL纤维支架(A1、A2)、PL/PDA复合纤维支架(B1、B2)和PL/PDA/CS复合纤维支架(C1、C2)的扫描电镜图。
图2为构成PL纤维支架(A)、PL/PDA复合纤维支架(B)和PL/PDA/CS复合纤维支架(C)的单根纤维的直径分布图。
图3为PL纤维支架(A)、PL/PDA复合纤维支架(B)和PL/PDA/CS复合纤维支架(C)的小角X射线衍射图(SAXRD)。
图4为PL纤维支架(A1、A2、A3、A4)、PL/PDA复合纤维支架(B1、B2、B3、B4)和PL/PDA/CS复合纤维支架(C1、C2、C3、C4)的能谱图(EDS)。
图5为PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架的拉曼光谱图(A)和X射线光电子能谱图(B、C、D)。
图6为0、5、10、15分钟时PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架的水接触角(WCA)测量图。
图7为PL/PDA/CS复合纤维支架的硫酸软骨素累积释放曲线图。
图8为软骨细胞在PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架上的细胞活力(A1、A3和A5)荧光显微图、细胞粘附(A2、A4和A6)扫描电镜图和细胞增殖(B)形态分析图。
图9为骨髓间质干细胞(rBMSCs)在PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架上的细胞活力(A1、A3和A5)荧光显微图、细胞粘附(A2、A4和A6)扫描电镜图和细胞增殖(B)形态分析图。
图10为骨髓间质干细胞(rBMSCs)在PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架上分别培养7天后软骨形成相关基因(Aggrecan基因、Sox-9基因、Col-I基因和Col-II基因)表达图。
图11为术后4、8、16周，模型对照组、PL纤维支架组、PL/PDA复合纤维支架组和PL/PDA/CS复合纤维支架组的软骨缺损宏观图。
图12为术后4、8、16周，模型对照组、PL纤维支架组、PL/PDA复合纤维支架组和PL/PDA/CS复合纤维支架组的软骨修复面积分析图。
图13为术后4、8、16周，模型对照组、PL纤维支架组、PL/PDA复合纤维支架组和PL/PDA/CS复合纤维支架组的标准化GAG含量分析图。
图14为术后4、8、16周，模型对照组、PL纤维支架组、PL/PDA复合纤维支架组和PL/PDA/CS复合纤维支架组的ICRS评分图。
图15为术后4、8和16周，模型对照组(A1、A2、A3、A4、A5、A6)、PL纤维支架组(B1、B2、B3、B4、B5、B6)、PL/PDA复合纤维支架组(C1、C2、C3、C4、C5、C6)和PL/PDA/CS复合纤维支架组(D1、D2、D3、D4、D5、D6)的软骨缺损区的组织学分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但它们并不是对本发明作任何限制。
实施例1具有仿生表面的取向多孔复合电纺纤维支架的制备及其形态表征
1.1具有仿生表面的取向多孔复合电纺纤维支架的制备
制备左旋聚乳酸电纺纤维支架：在连续搅拌下将重均分子量30万的左旋聚乳酸(该文中以PL或PLLA代指左旋聚乳酸)加入到二氯甲烷中，左旋聚乳酸与二氯甲烷的质量比为1:10，用静电纺丝法制备取向多孔的左旋聚乳酸电纺纤维支架(PL纤维支架)。
静电纺丝法参数：施加的电压为10kV，溶液推进速率为0.025mL/min，喷丝头和滚筒之间的距离为10cm，滚筒的转速为600r/min，每张纤维支架纺丝时间为3小时。实验在室温下进行，相对湿度约为50％RH。为了完全除去残余溶剂将所有制备好的电纺纤维支架真空干燥24小时。
制备表面修饰聚多巴胺(PDA)的左旋聚乳酸复合电纺纤维支架：在37℃下将左旋聚乳酸电纺纤维支架浸入含有三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、pH＝8.5的多巴胺溶液中24小时，多巴胺的浓度为6mg/mL，三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸的浓度为10mmol/L；然后用去离子水洗涤，并真空干燥，得深褐色的PL/PDA复合电纺纤维支架(PL/PDA复合纤维支架)。
聚多巴胺表面接枝有硫酸软骨素(CS)的PL/PDA/CS复合电纺纤维支架的制备：将上述PL/PDA复合电纺纤维支架于37℃下浸入10mg/mL的硫酸软骨素水溶液中，3天后用去离子水洗涤并真空干燥，得PL/PDA/CS复合电纺纤维支架(PL/PDA/CS复合纤维支架)。
采用扫描电镜(SEM)、小角X射线衍射(SAXRD)、X射线光电子能谱(XPS)、拉曼光谱和接触角(WCA)等对制备的具有仿生表面的取向多孔复合电纺纤维支架的物相组成和表面微观结构进行分析与表征。通过Image J软件测量纤维直径，从SEM图像中至少测量100根纤维计算其平均纤维直径。
1.2排列多孔复合电纺纤维支架的形貌表征
PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架的电镜扫描图如图1所示。图1中，A1为PL纤维支架的电镜扫描图，A2为A1中PL纤维支架的D部位放大电镜扫描图，B1为PL/PDA纤维支架的电镜扫描图，B2为B1中PL/PDA纤维支架的D部位放大电镜扫描图，C1为PL/PDA/CS纤维支架的电镜扫描图，C2为C1中PL/PDA/CS纤维支架的D部位放大电镜扫描图。
由图1可以看出，构成PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架的单根纳米纤维间呈单一取向并几近平行排列，彼此间偶有连接，构成PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架的单根纳米纤维的表面分布有椭圆形纳米孔，并沿纤维延伸方向分布。
构成PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架的单根纤维的直径分布图如图2所示。图2中，A为构成PL纤维支架的单根纤维的直径分布图，B为构成PL/PDA纤维支架的单根纤维的直径分布图；C为构成PL/PDA/CS纤维支架的单根纤维的直径分布图。
由图2可知，构成PL纤维支架的单根纤维的直径分布为3.5～8μm，平均直径为4.92±0.72μm；构成PL/PDA复合纤维支架的单根纤维的直径分布为3～8μm，平均直径为4.95±0.86μm；构成PL/PDA/CS复合纤维支架的单根纤维的直径分布为3.5～7μm，平均直径为5.14±0.75μm；构成PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架的单根纤维的直径无明显差异。
PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架的小角X射线衍射图(SAXRD)如图3所示。图3中，A为PL纤维支架的小角X射线衍射图，B为PL/PDA纤维支架的小角X射线衍射图，C为PL/PDA/CS纤维支架的小角X射线衍射图。
由图3可以看出，PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架，均在2θ<2.0°处有明显的衍射峰，表明PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架在支架内部均存在有序的介孔结构。
PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架的能谱图(EDS)如图4所示。A1为PL纤维支架的C元素能谱图，A2为PL纤维支架的O元素能谱图，A3为PL纤维支架的N元素能谱图，A4为PL纤维支架的S元素能谱图；B1为PL/PDA复合纤维支架的C元素能谱图，B2为PL/PDA复合纤维支架的O元素能谱图，B3为PL/PDA复合纤维支架的N元素能谱图，B4为PL/PDA复合纤维支架的S元素能谱图；C1为PL/PDA/CS复合纤维支架的C元素能谱图，C2为PL/PDA/CS复合纤维支架的O元素能谱图，C3为PL/PDA/CS复合纤维支架的N元素能谱图，C4为PL/PDA/CS复合纤维支架的S元素能谱图。
由图4中A1、A2、A3、A4观察可知，PL纤维支架中只检测到C和O元素；由图4中B1、B2、B3、B4观察可知，PL/PDA复合纤维支架中有明显的C、O和N元素信号，说明聚多巴胺成功修饰在左旋聚乳酸纤维表面；由图4中C1、C2、C3、C4观察可知，PL/PDA/CS复合纤维支架中有明显的C、O、N和S元素信号，说明聚多巴胺表面成功接枝硫酸软骨素。
1.3复合电纺纤维支架的表面特性
PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架的拉曼光谱图和X射线光电子能谱图(XPS)如图5所示。图5中，A为PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架的拉曼光谱图，B为PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架的X射线光电子能谱图，C为PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架的X射线光电子能谱高分辨率氮峰图，D为PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架的X射线光电子能谱高分辨率硫峰图。
由图5中A可知，PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架均在875cm-1(C-COO)、1727cm-1(C＝O)和1452cm-1(CH2)处出峰，与已知左旋聚乳酸(PL)的出峰位置相符。PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架在1335cm-1和1568cm-1处出现与聚多巴胺(PDA)中芳族基团相对应的峰。
如图5中B、C、D可知，PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架均显示碳(C 1s，284.5eV)和氧(O 1s，531.0eV)的存在；PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架显示的高分辨率氮峰(N 1s，399.8eV)与现有记载一致；PL/PDA/CS复合纤维支架显示的高分辨率硫峰(S 2p,168.56eV)，证实了CS的存在。
图6为0、5、10、15分钟时PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架的水接触角(WCA)测量图。
通过静态水接触角测量来研究PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架的表面亲疏水性能，结果如图6所示，0分钟时，PL/PDA/CS复合纤维支架因表面接枝CS，亲水性最佳，水滴立即被吸收到纤维网络中，水接触角为零；PL/PDA复合纤维支架因表面修饰有PDA，其亲水性明显提高，15分钟后PL/PDA复合纤维支架的水接触角(WCA)值为22.75°；PL纤维支架的亲水性最差。
1.4取向多孔PL/PDA/CS复合电纺纤维支架的CS累积释放
PL/PDA/CS复合纤维支架的CS累积释放结果如图7所示，PL/PDA/CS复合纤维支架在前48h迅速释放CS，累积释放浓度为1.51±0.12mg/ml。之后，释放速率减慢，18天后，PL/PDA/CS复合纤维支架中释放CS的浓度达到平衡，其值高达3.12±0.01mg/ml。
实施例2
实施例1所制备具有仿生表面的取向多孔复合电纺纤维支架对软骨细胞和骨髓间质干细胞的粘附、增殖以及软骨生成相关基因表达的影响。
2.1取向多孔复合电纺纤维支架对体外细胞粘附和增殖的影响
本研究中使用的兔骨髓间充质干细胞(rBMSCs)和软骨细胞从兔子(新西兰)获得，并且由低葡萄糖DMEM、MEM、10％FBS和1％PS组成的生长培养基在标准培养条件下(37℃，5％CO2和95％湿度)使用。将PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架用70％乙醇在紫外光下灭菌3小时，然后用PBS洗涤三次。
采用活/死细胞试剂盒检测细胞在支架上的生长活性。将软骨细胞和rBMSCs分别在PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架上培养3天后，洗掉培养基，用PBS洗2遍，然后加入钙黄绿素-AM和PI的混合溶液至浸没支架。加入两种荧光染液后，将培养板放置在细胞培养箱里45分钟，然后吸掉荧光染液，PBS洗一遍。将支架取出后在倒置荧光显微镜下在绿色荧光绿片下观察并拍照，如图8中A1、A3、A5和图9中A1、A3、A5所示。
为了观察PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架上的细胞粘附形态，将软骨细胞和rBMSCs接种在24孔板中的复合支架上，密度为2×104个细胞/孔，并在培养箱中培养5天。然后，用1％戊二醛处理30分钟，在4％甲醛中处理3小时。随后样品通过一系列梯度酒精溶液(50％～100％)脱水，最后用六甲基二硅氮烷处理15分钟并风干过夜。用SEM分别观察软骨细胞和rBMSCs在支架上的粘附形态，如图8中A2、A4、A6和图9中A2、A4、A6所示。
用CCK-8法分析软骨细胞和rBMSCs在取向多孔复合纤维膜上的增殖情况。将密度为1×104个细胞/孔的软骨细胞和rBMSCs分别接种在48孔培养板中PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架的表面上培养1、3和7天。在每个时间点向每个孔中加入20μL CCK-8溶液，然后将体系培养4小时。使用酶标仪在450nm下测量样品的吸光度值。结果如图8中B和图9中B所示。
软骨细胞在PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架上的生长活性如图8中A1、A3和A5所示，rBMSCs在PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架上的生长活性如图9中A1、A3和A5所示。
由图8中A1、A3和A5可知，软骨细胞在PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架上生长时具有很好的活性，且细胞均沿着纤维方向生长，PL/PDA和PL/PDA/CS复合纤维支架上的活细胞数量比纯PL支架上的多，说明三种支架均具有良好的生物相容性，且PDA和CS促进软骨细胞生长。由图9中A1、A3和A5可知，rBMSCs在三种支架上的活性和软骨细胞相似。
软骨细胞在PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架上的粘附形态如图8中A2、A4和A6所示，rBMSCs在PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架上的粘附形态如图9中A2、A4和A6所示。
由图8中A2、A4和A6可知，软骨细胞在PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架上都呈现出长条状且饱满的细胞形态，表明细胞生长状态良好。其中软骨细胞在PL/PDA和PL/PDA/CS复合纤维支架上比纯PL支架上粘附得更好，说明PDA和CS促进软骨细胞的粘附。由图9中A2、A4和A6可知，rBMSCs在三种支架上的粘附性能和软骨细胞相似。
软骨细胞在PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架上的增殖行为如图8中B所示，培养1天、3天、7天的柱形图，从左至右依次为软骨细胞在PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架上的增殖情况；rBMSCs在PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架上的增殖行为如图9中B所示，培养1天、3天、7天的柱形图，从左至右依次为rBMSCs在PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架上的增殖情况。
由图8中B和图9中B可知，随着培养时间的延长，PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架均支持软骨细胞和rBMSCs的生长。3天后，PL/PDA/CS复合纤维支架上软骨细胞的数量显著高于PL纤维支架和PL/PDA复合纤维支架，说明CS对软骨细胞增殖具有明显刺激作用。3天后，PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架上接种的rBMSCs数量明显高于PL纤维支架，说明PDA和CS对rBMSCs增殖具有刺激作用。
2.2取向多孔复合电纺纤维支架对体外培养的rBMSCs成软骨基因表达的影响
实时定量聚合酶链式反应(Q-RT-PCR)进一步评估rBMSCs的软骨分化。在PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架上培养密度为2×104的rBMSCs。体外培养7天后，根据说明书提取总RNA。通过使用cDNA合成试剂盒(Takara)和MyCycler PCR(BioRad)将RNA逆转录以合成cDNA。之后，根据说明书，通过Applied Biosystems 7500实时PCR系统进行实时PCR。通过ΔΔCT方法计算相对基因表达。
PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架对共培养7天后rBMSCs软骨形成基因表达的影响如图10所示，图10的A、B、C、D四幅柱形图表中，从左至右依次为对照组(CTR)、PL纤维支架(PL)、PL/PDA复合纤维支架(PL/PDA)和PL/PDA/CS复合纤维支架(PL/PDA/CS)。在PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架上培养的rBMSCs的Aggrecan基因、Sox-9基因、Col-I基因和Col-II基因均呈现表达活性，在PL/PDA/CS复合纤维支架上培养的rBMSCs的Aggrecan基因、Sox-9基因、Col-I基因和Col-II基因的表达活性显著高于在PL纤维支架和PL/PDA复合纤维支架上培养的rBMSCs细胞。
实施例3
本实施例研究具有仿生表面的取向多孔复合电纺纤维支架对兔子关节软骨缺损修复质量的影响。
3.1取向多孔复合电纺纤维支架加速软骨缺损修复
使用6周龄的兔(新西兰)评估电纺支架对体内软骨形成的影响。所有的动物程序均按照南京医科大学动物管理与使用委员会(IACUC)批准的方案进行。手术前，用甲苯噻嗪(20mg/kg)和Zoletil(60mg/kg)麻醉兔子。使用合适的手术环钻，在膝盖两侧的股骨髁中间产生4mm大小的软骨缺损。然后用针在缺陷处产生微裂纹。再分别用PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架覆盖缺陷形成PL纤维支架组、PL/PDA复合纤维支架组和PL/PDA/CS复合纤维支架组，及没有植入任何支架的模型对照组(CTR)。手术部位缝合并用聚维酮碘治疗。
通过PicoGreendsDNA定量测定来确定每个样品裂解物中的DNA含量。然后将GAG含量标准化为DNA含量。
国际软骨修复协会(ICRS)评分用于评价软骨缺损修复效果。ICRS评分主要涉及细胞形态、番红O染色、结构完整性、软骨下骨再生和软骨-软骨下骨的完整性。得分由两个不同的实验者以双盲模式评估。
术后4周(4w)、8周(8w)和16周(16w)各组的软骨缺损宏观图如图11所示，观察术后16周各组的软骨修复情况，模型对照组仍然有较明显的缺损，而PL纤维支架组和PL/PDA复合纤维支架组的缺损处已被组织填充，但组织不光滑，仍然可观察到缺损处和正常组织的界限；PL/PDA/CS复合纤维支架组的缺损已被组织填满，且组织光滑，呈现与周围软骨组织相同的白色，基本观察不到修复边界。
术后4周(4w)、8周(8w)和16周(16w)各组的软骨修复面积如图12所示，PL/PDA/CS复合纤维支架组的软骨修复面积显着高于模型对照组(CTR)、PL纤维支架组和PL/PDA复合纤维支架组。
术后4周(4w)、8周(8w)和16周(16w)各组的标准化细胞糖胺多糖(GAG)含量如图13所示，PL纤维支架组、PL/PDA复合纤维支架组和PL/PDA/CS复合纤维支架组的GAG含量高于模型对照组(CTR)，且PL/PDA/CS复合纤维支架组的GAG含量高于其他三组。
术后4周(4w)、8周(8w)和16周(16w)各组的ICRS评分如图14所示，PL/PDA/CS复合纤维支架组在术后第4周、8周和16周的平均得分显著高于模型对照组(CTR)、PL纤维支架组和PL/PDA复合纤维支架组。
3.2组织学结果
对于组织学分析，将软骨浸泡在4％的多聚甲醛溶液中48小时。随后用10％的甲酸脱钙3周。然后用梯度乙醇(50％、70％、80％、90％、95％和100％)按从低到高的浓度顺序进行脱水。石蜡包埋，切片，厚度约为5μm。将切片脱蜡，然后用梯度乙醇(100％、95％、90％、80％、70％和50％)按从高到低的浓度顺序进行复水。然后用番红固绿(Safranin-O fastgreen)染色。在光学显微镜下观察切片并拍照，评估软骨的形成。
通过番红O染色的组织学评价模型对照组(CTR)、PL纤维支架、PL/PDA复合纤维支架和PL/PDA/CS复合纤维支架对软骨缺损修复的疗效，如图15所示，图像中的软骨缺损用箭头标记。
图15中，A1为术后4周时模型对照组的软骨缺损修复光学显微镜图，A2为A1中E部位放大光学显微镜图；B1为术后4周时PL纤维支架组的软骨缺损修复光学显微镜图，B2为B1中E部位放大光学显微镜图；C1术后4周时PL/PDA复合纤维支架组的软骨缺损修复光学显微镜图，C2为C1中E部位放大光学显微镜图；D1为术后4周时PL/PDA/CS复合纤维支架组的软骨缺损修复光学显微镜图，D2为D1中E部位放大光学显微镜图；A3为术后8周时模型对照组的软骨缺损修复光学显微镜图，A4为A3中E部位放大光学显微镜图；B3为术后8周时PL纤维支架组的软骨缺损修复光学显微镜图，B4为B3中E部位放大光学显微镜图；C3为术后8周时PL/PDA复合纤维支架组的软骨缺损修复光学显微镜图，；C4为C3中E部位放大光学显微镜图；D3为术后8周时PL/PDA/CS复合纤维支架组的软骨缺损修复光学显微镜图，D4为D3中E部位放大光学显微镜图；A5为术后16周时模型对照组的软骨缺损修复光学显微镜图，A6为A5中E部位放大光学显微镜图；B5为术后16周时PL纤维支架组的软骨缺损修复光学显微镜图，B6为B5中E部位放大光学显微镜图；C5为术后16周时PL/PDA复合纤维支架组的软骨缺损修复光学显微镜图，C6为C5中E部位放大光学显微镜图；D5为术后16周时PL/PDA/CS复合纤维支架组的软骨缺损修复光学显微镜图，D6为D5中E部位放大光学显微镜图。
术后4周时，模型对照组(CTR)和PL纤维支架组缺损的关节面没有填充纤维组织，在PL/PDA复合纤维支架组和PL/PDA/CS复合纤维支架组发现一点纤维组织。
术后8周时，模型对照组(CTR)几乎没有形成纤维组织，而PL纤维支架组和PL/PDA复合纤维支架组的缺损被松散的纤维组织覆盖，PL/PDA/CS复合纤维支架组的缺损变小，充满致密的纤维组织。
术后16周时，再生软骨组织与原始软骨组织良好融合，模型对照组、PL纤维支架组、PL/PDA复合纤维支架组和PL/PDA/CS复合纤维支架组在整个修复区均可见细胞，尤其是PL/PDA/CS复合纤维支架组几乎被再生的软骨组织和软骨细胞覆盖，与模型对照组、PL纤维支架组和PL/PDA复合纤维支架组相比，PL/PDA/CS复合纤维支架组表现出最好的软骨再生性。

Claims (8)

1.一种软骨缺损修复材料，其特征在于，包括具有仿生表面的取向多孔复合电纺纤维支架；
所述具有仿生表面的取向多孔复合电纺纤维支架是由单一取向排列的表面分布有纳米孔的复合纤维构成，其内分布有介孔，所述复合纤维为：以单一取向排列的表面分布有纳米孔的左旋聚乳酸电纺纤维为基体，基体表面修饰聚多巴胺，或基体表面修饰的聚多巴胺接枝促软骨修复药物。
2.权利要求1所述的软骨缺损修复材料，其特征在于，具有仿生表面的取向多孔复合电纺纤维支架用作促进软骨细胞粘附和/或增殖活性成分、和/或促进骨髓间质干细胞粘附和/或增殖活性成分、和/或促进骨髓间质干细胞成软骨分化基因表达活性成分、和/或促进软骨细胞外基质生成活性成分。
3.根据权利要求2所述的软骨缺损修复材料，其特征在于，所述骨髓间质干细胞成软骨分化基因包括Aggrecan基因、Sox-9基因、Col-I基因和Col-II基因。
4.根据权利要求1所述的软骨缺损修复材料，其特征在于，具有仿生表面的取向多孔复合电纺纤维支架的制备方法，包括以下步骤：
(1)将左旋聚乳酸溶于有机溶剂中，在常温、相对湿度40％～60％条件下，用静电纺丝法制备左旋聚乳酸电纺纤维；
(2)将步骤(1)制备的左旋聚乳酸电纺纤维避光、恒温浸入含有碱性缓冲剂的多巴胺溶液中，在左旋聚乳酸电纺纤维表面修饰聚多巴胺；
步骤(1)中，静电纺丝法的参数为：施加的电压为8～12kV，溶液推进速率为0.01～0.03ml/min，喷丝头和滚筒之间的距离为8～12cm，滚筒的转速为500～800r/min。
5.根据权利要求1所述的软骨缺损修复材料，其特征在于，具有仿生表面的取向多孔复合电纺纤维支架的制备方法，包括以下步骤：
(1)将左旋聚乳酸溶于有机溶剂中，在常温、相对湿度40％～60％条件下，用静电纺丝法制备左旋聚乳酸电纺纤维；
(2)将步骤(1)制备的左旋聚乳酸电纺纤维避光、恒温浸入含有碱性缓冲剂的多巴胺溶液中，在左旋聚乳酸电纺纤维表面修饰聚多巴胺；
(3)将步骤(2)制备的表面修饰有聚多巴胺的左旋聚乳酸电纺纤维恒温浸入促软骨修复药物溶液中，在聚多巴胺上接枝药物；
步骤(1)中，静电纺丝法的参数为：施加的电压为8～12kV，溶液推进速率为0.01～0.03ml/min，喷丝头和滚筒之间的距离为8～12cm，滚筒的转速为500～800r/min。
6.根据权利要求4或5所述的软骨缺损修复材料，其特征在于，步骤(1)中，左旋聚乳酸的重均分子量10万～100万，左旋聚乳酸与有机溶剂的质量比为1：5～20，有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷或三氟乙醇。
7.根据权利要求4或5所述的软骨缺损修复材料，步骤(2)中，多巴胺溶液的pH值为8～10，多巴胺的浓度为1～10mg/mL。
8.根据权利要求5所述的软骨缺损修复材料，其特征在于，步骤(3)中，所述促软骨修复药物溶液为水溶液，促软骨修复药物溶液中促软骨修复药物的浓度为1～20mg/mL，促软骨修复药物为硫酸软骨素、氨糖软骨素或透明质酸。
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