CN105839407A - 一种医用高分子材料纳米纤维的表面生物功能化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种医用高分子材料纳米纤维的表面生物功能化的方法，采用静电纺丝技术制备壳聚糖纳米纤维，再利用多巴胺和角蛋白对纳米纤维进行功能化修饰，以提高材料的生物相容性，促进细胞的粘附和增殖。制备过程包括：1)静电纺丝获得壳聚糖纳米纤维；2)用多巴胺溶液浸泡上述纳米纤维，提高材料表面的蛋白粘附性；3)用角蛋白溶液继续浸泡纺丝材料，使其粘附于材料表面。经过实验证实修饰后的纳米纤维生物相容性良好，能显著促进细胞生长。该方法也适用于其它医用高分子材料纳米纤维，操作简便，成本低廉，在组织工程领域有广阔的应用前景。

Description

一种医用高分子材料纳米纤维的表面生物功能化方法
技术领域
本发明涉及一种医用高分子材料纳米纤维的表面生物功能化的方法，属于生物医用材料领域。
背景技术
壳聚糖是甲壳素的衍生物，具有良好的生物相容性、特殊的生物活性(广谱抗菌性、止血、促进伤口愈合、防止组织粘连、降脂、降血糖、免疫调节等作用)和来源广泛性。壳聚糖可以溶解在许多稀酸中，其实质是糖残基上的-NH2与H+形成阳离子-NH3 +配合物，使壳聚糖成为带正电荷的聚电解质，破坏了壳聚糖分子内与分子间的氢键，溶解性随之增强。静电纺丝技术是一种比较成熟的制备纳米纤维的方法。利用静电纺丝法生产的壳聚糖产品，其纤维直径小，形成的非织造布在力学性能、导电性、吸附性等方面表现出优良的性质，再配合壳聚糖本身独特的性能，使其在纳米纤维材料的复合、过滤、生物医学应用和防护服等领域得到很好的利用。角蛋白属于中间丝蛋白类，除了头发纤维、角和指甲，角蛋白已被证明存在于几乎所有已分化细胞的细胞核和细胞质中。角蛋白能增强细胞增殖和迁移，角蛋白本身及其降解产物能诱导细胞合成TGF等因子，如果能将角蛋白修饰到材料表面，能明显提高其生物相容性。
高分子纳米纤维材料越来越多的应用于生物组织工程领域，纳米材料的制备相对容易，但长期以来，材料表面的生物功能化仍不理想，这就影响纳米材料的生物相容性。
为了进一步提高壳聚糖电纺纳米纤维的生物相容性，就需要改变其表面特性，引入上述角蛋白分子，从而达到促进细胞粘附，增殖并增加细胞生存能力的目的。这种方法可同样应用于其它医用高分子材料的表面改性以提高生物相容性。
发明内容
发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种工艺简单，能够显著提高纳米纤维材料的生物相容性方法。
技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种医用高分子材料纳米纤维的表面生物功能化的方法，制备过程包括：
1)通过静电纺丝方法制备壳聚糖纳米纤维，采用的静电纺丝溶液为壳聚糖/聚氧化乙烯溶液；
2)所述壳聚糖纳米纤维进行去酸后处理；
3)步骤2)所得的所述壳聚糖纳米纤维的表面进行功能化修饰：先后用多巴胺和角蛋白溶液浸泡，再经孵育即得。
进一步的，在本发明中，所述壳聚糖/聚氧化乙烯溶液中壳聚糖和聚氧化乙烯的质量百分比为9:1。
进一步的，在本发明中，所述壳聚糖/聚氧化乙烯溶液溶于90％乙酸溶液中，其中壳聚糖的质量浓度为1.8％，聚氧化乙烯的质量浓度为0.2％。
进一步的，在本发明中，步骤1)的具体方法为：
1-1)所述静电纺丝溶液注入注射器中，排出气泡；
1-2)固定注射器在微量挤出泵上，注射器连接喷丝头；喷丝头连接有电源正极，电源负极连接接收装置；
1-3)开启微量挤出泵，调整挤出速率；
1-4)待溶液挤出后，打开电源，调节接收距离，收集样品。
进一步的，在本发明中，所述注射器的针头为平口，内径为0.5毫米；步骤1-3)所述挤出速率为1毫升/小时；步骤1-4)所述电源的电压为20千伏，所述接收距离为20厘米。
进一步的，在本发明中，所述步骤2)的具体方法为：
2-1)干燥：所述壳聚糖纳米纤维在40℃条件下真空干燥48h；
2-2)浸泡：在w/v％为0.5％NaOH溶液中浸泡10-20min；
2-3)加热：置于沸水中加热10-20min；
2-4)二次干燥：置于烘箱中40℃干燥，即得。
进一步的，在本发明中，所述多巴胺溶液是用pH8.5的10mM Tris缓冲液配置成2mg/mL溶液，所述角蛋白溶液是将角蛋白粉末溶于HEPES缓冲液配置成2-5mg/mL溶液。
进一步的，在本发明中，步骤3)具体方法为：先用所述多巴胺溶液浸泡1h，超纯水清洗；再用所述角蛋白溶液浸泡材料，在37℃培养箱孵育1h后，超纯水清洗，氮气吹干。
进一步的，在本发明中，将所述多巴胺和角蛋白溶液预先用0.22μm的滤膜进行过滤。
进一步的，在本发明中，将步骤3)所得到的壳聚糖纺丝纤维进行生物相容性验证， 包括接种BMSC细胞和H9c2细胞；所述BMSC细胞接种后进行CCK-8检测细胞活性；所述H9c2细胞接种后进行CCK-8检测，研究材料对细胞增殖的影响。
有益效果：本发明提供的医用高分子材料纳米纤维的表面生物功能化的方法，采用静电纺丝技术制备壳聚糖纳米纤维，再利用多巴胺和角蛋白对纳米纤维进行功能化修饰，以提高材料的生物相容性，促进细胞的粘附和增殖。
优点在于通过简便的方法在医用高分子材料壳聚糖的表面引入活性官能团，进而通过该官能团修饰上角蛋白分子，从而显著改善原材料的生物相容性。该方法操作方便、可重复性好，经过实验证实，该方法制得的纳米纤维相容性良好，能显著促进细胞的生长。该方法也适用于其它医用高分子材料纳米纤维，操作简便，成本低廉，在组织工程领域有广阔的应用前景。
附图说明
图1为壳聚糖静电纺丝材料SEM表征图；
图2为两种浓度角蛋白修饰前后壳聚糖纳米纤维材料BMSC细胞活性比较；
图3为角蛋白修饰前后壳聚糖纳米纤维材料接种H9c2细胞增殖比较。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作更进一步的说明。
以下实施例所用主要原材料：
壳聚糖(CS)：脱乙酰度85.60％，分子量25万；聚氧乙烯(PEO)；多巴胺：西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；角蛋白。
实施例1
一种医用高分子材料纳米纤维的表面生物功能化的方法，制备过程包括：1)将壳聚糖粉末溶解于乙酸溶液中；2)添加聚氧化乙烯(PEO)，完全溶解后进行静电纺丝获得纳米纤维；3)用多巴胺溶液浸泡上述纳米纤维，提高材料表面的蛋白粘附性；4)用角蛋白溶液继续浸泡纺丝材料，使其粘附于材料表面。经过实验证实修饰后的纳米纤维生物相容性良好，能显著促进细胞生长。具体的操作方法如下：
首先，静电纺丝制得壳聚糖纳米纤维：选取医用高分子材料壳聚糖，溶解在90％乙酸溶液中，通过静电纺丝方法制备纳米纤维，再添加聚氧乙烯(PEO)提高纺丝效果。优选的，按壳聚糖:聚氧乙烯PEO＝9:1(质量比)的最佳比例溶于90％乙酸中，其中壳聚糖的质量浓度为1.8％，聚氧化乙烯的质量浓度为0.2％。
壳聚糖静电纺丝方法为：取适量配制好的壳聚糖/PEO溶液注入注射器中，排出气 泡，注射器针头为平口，内径为0.5毫米；固定注射器在微量挤出泵上；以导管连接注射器和喷丝头；将高压电源正极夹在喷丝头上，负极接在接收装置上；打开微量挤出泵，选择合适的挤出速率。待溶液被缓慢挤出后，打开高压电源，选择合适的电压值。适当调节接收距离，收集装置处得到的样品。
优选的，微量挤出泵的推进速度为1毫升/小时，高压直流电源正极接注射器针头，负极连在接收装置上，电压为20千伏，收集距离为20厘米，3小时后将得到壳聚糖纳米纤维薄膜。图1所示为利用本发明提供的医用高分子材料纳米纤维的表面生物功能化方法获得的壳聚糖电纺纳米纤维SEM表征图，获得了出丝连续的纳米纤维材料，为细胞生长提供支架。
其次，对上述步骤得到的纺丝纤维进行去酸处理，以去除酸性环境对细胞的不良影响。从锡箔纸上剪下盖玻片，用壳聚糖纳米纤维将其裹好，在40℃真空干燥箱中干燥48h后，将纳米纤维材料浸在0.5％(w/v％)NaOH溶液中10-20分钟，处理所用溶剂：0.5％(w/v％)NaOH溶液，将所配溶液倒入培养皿中，没过纤维即可；然后用纯水洗三次，再将纤维置于沸水中约5min两次，后用纯水冲洗两次，置于烘箱中40℃干燥，放入干燥器中备用。
最后，将壳聚糖纳米纤维进行表面生物功能化修饰，方法为：将多巴胺溶解在浓度为2mg/ml的10mM Tris缓冲液(pH＝8.5)中；同时角蛋白溶解在2～5mg/ml HEPES溶液中，之后在超净台操作，用0.22μm的滤膜将多巴胺和角蛋白溶液过滤。先用多巴胺将要处理的材料浸泡约1小时，用超纯水清洗1遍，然后用角蛋白溶液浸泡所述修饰氨基后的壳聚糖纳米纤维材料，在37℃培养箱孵育1小时，后用超纯水清洗1次，氮气吹干保存于4度冰箱待用。
通过修饰多巴胺，在壳聚糖纺丝纤维上引入氨基，通过表面氨基进行后续反应；然后再在多巴胺处理的壳聚糖纳米纤维材料表面修饰上角蛋白分子，增加表面细胞活性，促进细胞粘附和细胞增殖，改善壳聚糖纳米纤维材料的生物相容性。
实施例2
对根据实施例1的医用高分子材料纳米纤维的表面生物功能化的方法所获得的壳聚糖纺丝纤维进行生物相容性验证。
培养液清洗步骤3)所得材料后，置于48孔板中，接种BMSC细胞，接种浓度为3*104个/mL，每孔100μL。培养3天后，CCK-8检测细胞活性。验证发现细胞在角蛋白 处理的壳聚糖纳米纤维材料比未处理材料上活力均要大，5mg/ml角蛋白处理的壳聚糖材料上BMSC细胞活性最好，如图2所示。
用同样的方法接种H9c2细胞，在1、3、5天进行CCK-8检测，研究材料对细胞增殖的影响。验证得该材料能促进细胞增殖，角蛋白的加入大大改善了壳聚糖纳米纤维的生物相容性如图3所示。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种医用高分子材料纳米纤维的表面生物功能化的方法，其特征在于，制备过程包括：
1)通过静电纺丝方法制备壳聚糖纳米纤维，采用的静电纺丝溶液为壳聚糖/聚氧化乙烯溶液；
2)所述壳聚糖纳米纤维进行去酸后处理；
3)步骤2)所得的所述壳聚糖纳米纤维的表面进行功能化修饰：先后用多巴胺和角蛋白溶液浸泡，再经孵育即得。
2.根据权利要求1所述的医用高分子材料纳米纤维的表面生物功能化的方法，其特征在于，所述壳聚糖/聚氧化乙烯溶液中壳聚糖和聚氧化乙烯的质量百分比为9:1。
3.根据权利要求2所述的医用高分子材料纳米纤维的表面生物功能化的方法，其特征在于，所述壳聚糖/聚氧化乙烯溶液溶于90％乙酸溶液中，其中壳聚糖的质量浓度为1.8％，聚氧化乙烯的质量浓度为0.2％。
4.根据权利要求1所述的医用高分子材料纳米纤维的表面生物功能化的方法，其特征在于，步骤1)的具体方法为：
1-1)所述静电纺丝溶液注入注射器中，排出气泡；
1-2)固定注射器在微量挤出泵上，注射器连接喷丝头；喷丝头连接有电源正极，电源负极连接接收装置；
1-3)开启微量挤出泵，调整挤出速率；
1-4)待溶液挤出后，打开电源，调节接收距离，收集样品。
5.根据权利要求4所述的医用高分子材料纳米纤维的表面生物功能化的方法，其特征在于，所述注射器的针头为平口，内径为0.5毫米；步骤1-3)所述挤出速率为1毫升/小时；步骤1-4)所述电源的电压为20千伏，所述接收距离为20厘米。
6.根据权利要求1所述的医用高分子材料纳米纤维的表面生物功能化的方法，其特征在于，所述步骤2)的具体方法为：
2-1)干燥：所述壳聚糖纳米纤维在40℃条件下真空干燥48h；
2-2)浸泡：在w/v％为0.5％NaOH溶液中浸泡10-20min；
2-3)加热：置于沸水中加热10-20min；
2-4)二次干燥：置于烘箱中40℃干燥，即得。
7.根据权利要求1所述的医用高分子材料纳米纤维的表面生物功能化的方法，其特征在于，所述多巴胺溶液是用pH8.5的10mM Tris缓冲液配置成2mg/mL溶液，所述角蛋白溶液是将角蛋白粉末溶于HEPES缓冲液配置成2-5mg/mL溶液。
8.根据权利要求1所述的医用高分子材料纳米纤维的表面生物功能化的方法，其特征在于，步骤3)具体方法为：先用所述多巴胺溶液浸泡1h，超纯水清洗；再用所述角蛋白溶液浸泡材料，在37℃培养箱孵育1h后，超纯水清洗，氮气吹干。
9.根据权利要求8所述的医用高分子材料纳米纤维的表面生物功能化的方法，其特征在于，将所述多巴胺和角蛋白溶液预先用0.22μm的滤膜进行过滤。
10.根据权利要求1-9任一所述的医用高分子材料纳米纤维的表面生物功能化的方法，其特征在于，将步骤3)所得到的壳聚糖纺丝纤维进行生物相容性验证，包括接种BMSC细胞和H9c2细胞；所述BMSC细胞接种后进行CCK-8检测细胞活性；所述H9c2细胞接种后进行CCK-8检测，研究材料对细胞增殖的影响。
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