CN113249811A - 一种中空纳米纤维内部固定化生物酶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于酶固定化的纳米功能材料领域，具体涉及一种中空纳米纤维内部固定化生物酶的制备方法。将高分子聚合物溶于混合有机溶剂中，充分溶解搅拌均匀形成的透明溶液作为同轴静电纺丝的外壳纺丝液；将低分子量的多元醇或低聚合度的聚乙二醇溶于纯水或磷酸盐缓冲液中，添加多巴胺和生物酶，充分溶解混合均匀形成的均质溶液作为同轴静电纺丝的内芯纺丝液；利用两台微量注射泵分别控制外壳纺丝液和内芯纺丝液的流速，施加电压进行同轴静电纺丝，在接受端收集纳米纤维。在同轴静电纺丝时和后处理过程中，多巴胺自发聚合生成聚多巴胺的同时，聚多巴胺可以原位共价交联固定化多种生物酶，反应条件温和，方法简便实用，降低了蛋白泄露率。

Description

一种中空纳米纤维内部固定化生物酶的制备方法
技术领域
本发明属于酶固定化的纳米功能材料领域，具体涉及一种中空纳米纤维内部固定化生物酶的制备方法，并且这种内部功能化的中空纳米纤维材料可应用于生物催化、分析检测和环境污染物治理等功能材料领域。
背景技术
纳米功能材料是一类新型的纳米材料，既具有纳米材料的高比表面积、可控可调的形貌结构等优点，又可以复合无机、有机、高分子和生物活性分子的特殊功能，在酶催化、生物材料、分析检测和环境治理等领域得到了广泛的发展，因此开发新型的一维纳米纤维功能材料具有十分巨大的潜在应用价值。
聚多巴胺是通过多巴胺在弱碱性环境下自发氧化聚合形成的，是一种新型的仿生高分子粘附材料，可以均匀的包覆在材料表面，并且聚多巴胺可以进一步功能化修饰含有氨基或巯基的功能分子。而现有的技术主要是在无机材料、高分子材料、纳米材料、烟草花叶病毒等材料的外表面进行聚多巴胺的包覆和功能化修饰（例如中国专利公开号CN102000658和CN 102813963是在生物医用的无机、金属、金属合金和高分子材料表面用聚多巴胺功能化修饰具有生物活性的分子；CN 103920152和CN 104549159是在多壁碳纳米管和磁性银纳米线为代表的一维无机纳米材料表面包覆聚多巴胺；CN 105327354是在自组装的烟草花叶病毒纳米线外表面包覆聚多巴胺并功能化修饰；CN 107297197是在超滤膜或纳滤膜材料表面黏附聚多巴胺涂层并固定化生物酶）。但这些技术方法都没有涉及到在功能材料内部生成聚多巴胺并功能化，特别是没有在中空纳米纤维内部的管状空间中，通过添加多巴胺原位聚合生成聚多巴胺并固定化生物酶的方法。
中空纳米纤维的制备方法，目前最常用的方法是采用同轴静电纺丝技术，在传统的静电纺丝基础上，使用特殊的同轴结构的纺丝针头，将2种不相容的纺丝液分别通入内外嵌套的毛细管中，静电纺丝得到核壳结构的纳米纤维，然后通过溶解去除内核物质得到中空管状结构的纳米纤维，其内部空间可以包埋生物活性物质和药物分子。但现有技术方法多采用物理吸附、静电相互作用以及材料本身的包埋效果实现生物活性物质的固定化（例如中国专利公开号CN 102733000将α-胰凝乳蛋白酶和药物酮洛芬分子溶解于甘油中作为内芯纺丝液，通过同轴静电纺丝物理包埋在中空结构的聚合物纳米纤维中；CN102768190将3α-羟基类固醇脱氢酶、心肌黄酶和辅酶原位包埋在中空的聚合物纳米纤维的腔室内；CN104818540将催化CO2还原制备甲醇的多种酶和辅酶通过包埋和静电引力作用束缚在中空纳米纤维内部；CN 103668485利用同轴三通道静电纺丝技术得到三层同轴的纳米纤维，将生物酶包埋于缓释激活剂和多孔聚合物的夹层内）。这些方法虽然实现了酶在纳米纤维内部的固定化，但由于酶与纳米纤维之间的相互作用依靠比较弱的物理吸附、静电吸引和材料的包埋，在实际应用中容易造成生物酶的流失，存储稳定性和重复使用率不高。
此外CN 102645474利用同轴静电纺丝制备纳米纤维，将酶和聚合物混合作为外壳材料，并用交联剂交联固定化，但酶暴露在材料表面，容易受外部环境影响而失活。
迄今为止，在纳米纤维内部中空管状结构中，一步法简便的在多巴胺自身原位聚合生成聚多巴胺的同时，利用聚多巴胺的反应性以共价键交联实现对生物酶修饰固定化的制备方法还没有报道过。
发明内容
本发明的目的是克服上述现有技术方法的缺陷和问题，提供一种中空纳米纤维内部固定化生物酶的制备方法，使用同轴静电纺丝技术制备中空纳米纤维时，在内芯纺丝液中添加一定量的多巴胺和生物酶，进行纺丝和后处理过程中多巴胺自发聚合生成聚多巴胺，而聚多巴胺可以原位固定化生物酶，从而得到内部修饰固定生物酶的功能化中空纳米纤维，实现材料内部一步化学交联固定生物酶，方法简便，负载酶量大可达200 mg/mL，同时可以保持生物酶原有生理活性，极大提高多种生物酶组成级联反应的催化活性等多个有益效果。
本发明是通过以下技术方案实现的：一种中空纳米纤维内部固定化生物酶的制备方法，包括以下步骤：
（1）将高分子聚合物溶于混合有机溶剂中，充分溶解搅拌均匀形成的透明溶液作为同轴静电纺丝的外壳纺丝液；
（2）将低分子量的多元醇或低聚合度的聚乙二醇溶于纯水或磷酸盐缓冲液中，添加多巴胺和生物酶，充分溶解混合均匀形成的均质溶液作为同轴静电纺丝的内芯纺丝液；
（3）将上述内芯纺丝液和外壳纺丝液分别加入两个注射器中，通过管路分别与同轴电纺针头的内外进样口相连；将高压电源的正极与同轴电纺针头喷丝口相连作为纺丝端，高压电源的接地极或负极与表面覆盖铝箔纸的旋转辊筒相连作为接受端；利用两台微量注射泵分别控制外壳纺丝液和内芯纺丝液的流速，施加电压进行同轴静电纺丝，在接受端收集纳米纤维；
（4）在后处理过程中，将收集到的纳米纤维浸泡到弱碱性缓冲液中，在纳米纤维内部低分子量的多元醇或低聚合度的聚乙二醇溶解出来形成中空管状结构的同时，多巴胺自发聚合生成的聚多巴胺原位固定生物酶将其截留在纳米纤维内部，最后将纳米纤维取出后进行干燥，最终得到内部修饰固定生物酶的功能化中空纳米纤维。
作为本发明技术方案的进一步改进，步骤（2）中，所述内芯纺丝液中的多巴胺浓度为0.1～10 mg/mL，生物酶浓度为0.1～200 mg/mL。
作为本发明技术方案的进一步改进，步骤（1）中，所述高分子聚合物为聚偏氟乙烯、聚醚砜或聚丙烯腈；所述混合有机溶剂为溶解高分子聚合物的良溶剂和不良溶剂混合得到的，其中良溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或N,N-二甲基乙酰胺，不良溶剂为丙酮、二甲基亚砜、四氢呋喃或二氯甲烷。
作为本发明技术方案的进一步改进，步骤（1）中，外壳纺丝液为质量体积百分比8%～30% 的高分子聚合物溶液。
作为本发明技术方案的进一步改进，步骤（2）中，所述低分子量的多元醇为乙二醇、丙二醇、丙三醇（甘油）、1,4-丁二醇、1,6-己二醇、戊五醇（木糖醇）、己六醇（山梨糖醇）、聚甘油-10（十聚甘油）中的一种或其中任意两种的混合物；所述的低聚合度的聚乙二醇为平均聚合度200、400、600、800、1000、1500或2000的聚乙二醇中的一种或其中任意两种的混合物。
作为本发明技术方案的进一步改进，步骤（2）中，所述生物酶为具有催化功能及生理活性的酶制品或蛋白质，所述生物酶为血红素蛋白、牛血清白蛋白、葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶、半乳糖苷酶、漆酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、脂肪酶中的一种或其中任意多种的混合物。
作为本发明技术方案的进一步改进，步骤（2）中，所述充分溶解混合均匀的步骤包括多元醇水溶液或聚乙二醇水溶液中添加多巴胺和生物酶后在室温25 ℃或冷却到4 ℃，轻柔地混合1～10分钟。
作为本发明技术方案的进一步改进，步骤（3）中，所述内芯纺丝液的流速为0.3～1.0 mL/h，外壳纺丝液的流速为1.0～3.0 mL/h；所述施加电压为10～25 kV，纺丝端和接收端距离为10～30 cm；所述的旋转辊筒的转速为100～2000 RPM。
作为本发明技术方案的进一步改进，步骤（4）中，所述弱碱性缓冲液为磷酸盐缓冲溶液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液或磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶，其pH值为7.0～8.5，摩尔浓度为0.01～0.2 M；所述浸泡时间为1～24小时。
作为本发明技术方案的进一步改进，步骤（4）中，所述的内部修饰固定生物酶的功能化中空纳米纤维的外径为300～5000 nm，内径为200～4000 nm。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
（1）通过在内芯纺丝液中加入聚多巴胺的前驱体多巴胺，在同轴静电纺丝时和后处理过程中，多巴胺自发聚合生成聚多巴胺的同时，聚多巴胺可以原位共价交联固定化多种生物酶，反应条件温和，方法简便实用，降低了蛋白泄露率，解决了传统固定化方法采取物理吸附、静电吸引和材料包埋造成生物酶大量流失的问题，以及化学试剂固定化需要多步反应并额外添加交联剂的问题，同时生成的聚多巴胺增加了纳米纤维的拉伸机械性能。
（2）在后处理过程中，在纳米纤维内部低分子量的水溶性物质溶解出来形成中空管状结构的同时，一步法实现了内部多种生物酶的固定化，避免了繁琐的处理过程，有效的保留了多种生物酶的良好的催化活性。
（3）将低分子量的多元醇或低聚合度的聚乙二醇与水互溶形成的溶液作为内芯纺丝液，对各种酶制品或蛋白质的生物相容性好，保护多种生物酶不与外壳纺丝液的混合有机溶剂接触，同时可溶解负载的生物酶量大，提高了生物酶的稳定性和催化活性。
（4）可以将多种具有级联特性的生物酶原位均匀的固定在中空纳米纤维内部的管状限域空间中，有效的促进了多酶体系之间的协同作用和级联效应，极大的提高了多酶体系的整体催化效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施的同轴静电纺丝装置示意图和中空纳米纤维结构示意图。
图2是本发明实施例1所制备的中空聚偏氟乙烯纳米纤维@聚多巴胺@牛血清白蛋白的扫描电镜图。
图3是本发明实施例1所制备的中空聚偏氟乙烯纳米纤维@聚多巴胺@牛血清白蛋白的横截面扫描电镜图。
图4是本发明实施例2所制备的中空聚偏氟乙烯纳米纤维@聚多巴胺@牛血清白蛋白在不同多巴胺浓度和固定化时间的蛋白质泄漏率曲线。
图5是本发明实施例2所制备的中空聚偏氟乙烯纳米纤维@聚多巴胺@牛血清白蛋白在不同多巴胺浓度下的机械拉伸应力应变曲线。
图6是本发明实施例4所制备的中空聚偏氟乙烯纳米纤维@聚多巴胺@半乳糖苷酶/葡萄糖氧化酶/辣根过氧化物酶的扫描电镜图。
图7是本发明实施例4 所制备的中空聚偏氟乙烯纳米纤维@聚多巴胺@半乳糖苷酶/葡萄糖氧化酶/辣根过氧化物酶的氮气吸脱附曲线图和孔径分布图。
图8是本发明实施例4所制备的中空聚偏氟乙烯纳米纤维@聚多巴胺@半乳糖苷酶/葡萄糖氧化酶/辣根过氧化物酶与游离酶在不同反应时间下相对催化活性的曲线图。
图9是本发明实施例5所制备的中空聚偏氟乙烯纳米纤维@聚多巴胺@漆酶/辣根过氧化物酶的扫描电镜图。
图10是本发明实施例5所制备的中空聚偏氟乙烯纳米纤维@聚多巴胺@漆酶/辣根过氧化物酶与游离酶在4 ℃下的存储时间与相对催化活性曲线图。
图11是本发明实施例6所制备的中空聚醚砜纳米纤维@聚多巴胺@脂肪酶的扫描电镜图。
图12是本发明实施例7所制备的中空聚丙烯腈纳米纤维@聚多巴胺@辣根过氧化物酶/木质素过氧化物酶/锰过氧化物酶的扫描电镜图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
下面结合附图对本发明的技术方案进行详细的说明。
一种中空纳米纤维内部固定化生物酶的制备方法，包括以下步骤：
（1）将高分子聚合物溶于混合有机溶剂中，充分溶解搅拌均匀形成的透明溶液作为同轴静电纺丝的外壳纺丝液；
（2）将低分子量的多元醇或低聚合度的聚乙二醇溶于纯水或磷酸盐缓冲液中，添加多巴胺和生物酶，充分溶解混合均匀形成的均质溶液作为同轴静电纺丝的内芯纺丝液；
（3）将上述内芯纺丝液和外壳纺丝液分别加入两个注射器中，通过管路分别与同轴电纺针头的内外进样口相连；将高压电源的正极与同轴电纺针头喷丝口相连作为纺丝端，高压电源的接地极或负极与表面覆盖铝箔纸的旋转辊筒相连作为接受端；利用两台微量注射泵分别控制外壳纺丝液和内芯纺丝液的流速，施加电压进行同轴静电纺丝，在接受端收集纳米纤维；
（4）在后处理过程中，将收集到的纳米纤维浸泡到弱碱性缓冲液中，在纳米纤维内部低分子量的多元醇或低聚合度的聚乙二醇溶解出来形成中空管状结构的同时，多巴胺自发聚合生成的聚多巴胺原位固定生物酶将其截留在纳米纤维内部，最后将纳米纤维取出后进行干燥，最终得到内部修饰固定生物酶的功能化中空纳米纤维。
在本发明步骤（1）中，所述高分子聚合物为聚偏氟乙烯、聚醚砜或聚丙烯腈；所述混合有机溶剂为溶解高分子聚合物的良溶剂和不良溶剂混合得到的，其中良溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或N,N-二甲基乙酰胺，不良溶剂为丙酮、二甲基亚砜、四氢呋喃或二氯甲烷。其中，混合有机溶剂中的良溶剂和不良溶剂可以按体积比6:4、7:3、8:2或9:1混合得到。另外，外壳纺丝液为质量体积百分比8%～30% 的高分子聚合物溶液。进一步的，为了能够将高分子聚合物充分溶解于混合有机溶剂中，可在室温25 ℃或加热到40～60 ℃（可采用40℃、50℃或60℃），持续搅拌2～8小时（可根据实际情况采用2、4、6或8小时）。
在本发明步骤（2）中，所述低分子量的多元醇为乙二醇、丙二醇、丙三醇（甘油）、1,4-丁二醇、1,6-己二醇、戊五醇（木糖醇）、己六醇（山梨糖醇）、聚甘油-10（十聚甘油）中的一种或其中任意两种的混合物；所述的低聚合度的聚乙二醇为平均聚合度200、400、600、800、1000、1500或2000的聚乙二醇中的一种或其中任意两种的混合物。所述生物酶为具有催化功能及生理活性的酶制品或蛋白质，具体的，所述生物酶为血红素蛋白、牛血清白蛋白、葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶、半乳糖苷酶、漆酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、脂肪酶中的一种或其中任意多种的混合物。另外，具体实施时，多元醇和聚乙二醇能够溶于水或磷酸盐缓冲液中，其中，磷酸盐缓冲液的pH 5.7～8.0，其浓度为0.01～0.2 M；具体的pH可采用5.7、6.5、7.4或8.0，浓度可采用0.01M、0.05M、0.1M或0.2M。进一步的，所述内芯纺丝液中的多巴胺浓度为0.1～10 mg/mL，生物酶浓度为0.1～200 mg/mL；具体的，多巴胺浓度可采用0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、5 mg/mL或10 mg/mL，生物酶浓度可采用0.1mg/mL、0.2 mg/mL、1 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL、100 mg/mL或200 mg/mL。更进一步的，为了能够将多巴胺和生物酶充分溶解混合，可在室温25 ℃或冷却到4 ℃，轻柔地混合1～10分钟。在本发明中，所述轻柔地混合指的是上下颠倒溶液混合均匀。另外，低分子量的多元醇或低聚合度的聚乙二醇溶于纯水或磷酸盐缓冲液后，溶液中多元醇的体积百分比为60%～90%，聚乙二醇的体积百分比为40%～80%；具体的，多元醇的体积百分比可采用60%、70%、80%或90%，聚乙二醇的体积百分比可采用40%、50%、60%、70%或80%。
在本发明步骤（3）中，所述内芯纺丝液的流速为0.3～1.0 mL/h（可采用0.3mL/h、0.5mL/h、0.8mL/h或1.0mL/h），外壳纺丝液的流速为1.0～3.0 mL/h（可采用1.0 mL/h、1.5mL/h、2.0 mL/h或3.0 mL/h）；所述施加电压为10～25 kV（可采用10 kV、15 kV、20 kV或25kV），纺丝端和接收端距离为10～30 cm（可采用10cm、20cm或30cm）；所述的旋转辊筒的转速为100～2000 RPM（可采用100RPM、500RPM、1000RPM或2000RPM）。
在本发明步骤（4）中，所述弱碱性缓冲液为磷酸盐缓冲溶液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液或磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶，其pH值为7.0～8.5（可采用7.0、7.2、7.4、8.0或8.5），摩尔浓度为0.01～0.2 M（可采用0.01M、0.05M、0.1M或0.2M）；所述浸泡时间为1～24小时（可根据实际浸泡情况采用1小时、5小时、10小时或24小时）。最后，所述的内部修饰固定生物酶的功能化中空纳米纤维的外径为300～5000 nm，内径为200～4000 nm。前述的内部修饰固定生物酶的功能化中空纳米纤维的内径和外径是通过电镜照片显示测量获得的，而中空纳米纤维的内径和外径的大小是由步骤（3）中同轴静电纺丝的工艺参数共同决定的。
具体干燥时，可在室温25 ℃自然干燥4～24小时（可采用4小时、8小时、12小时或24小时）或烘箱加热25～40 ℃（可采用25℃、30℃或40℃）干燥1～4小时（可采用1小时、2小时或4小时）。
本发明所述方法所采用的同轴静电纺丝装置示意图和中空纳米纤维结构示意图，如图1所示。
下面通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细的说明。
实施例1
将聚偏氟乙烯溶于体积比为9:1的N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜的混合有机溶剂中，加热到60 ℃充分溶解，持续搅拌8小时，配成重量百分比为15% 的溶液，作为外壳纺丝液，加入到10 mL 的注射器中；将乙二醇4 mL、山梨糖醇1 g与pH 6.5的0.1 M 磷酸盐缓冲液1 mL混合均匀，冷却到4 ℃，加入多巴胺25 mg和牛血清白蛋白500 mg，轻柔地混合5分钟，配置成总体积5 ml的多元醇水溶液，最终多巴胺浓度为5 mg/mL，牛血清白蛋白浓度为100 mg/mL的内芯纺丝液，加入到5 mL注射器中；将外壳纺丝液和内芯纺丝液通过管路分别与同轴电纺针头的内外进样口相连，将高压电源的正极与同轴电纺针头喷丝口相连作为纺丝端，高压电源的接地极与表面覆盖铝箔纸的旋转辊筒相连作为接受端，调节纺丝端和接收端距离为25 cm，电压为15 kV，辊筒的转速为1500 RPM，利用两台微量注射泵分别控制内芯纺丝液的流速为1.0 mL/h，外壳纺丝液的流速为3.0 mL/h，流速比为1:3，进行同轴静电纺丝，在接受端收集纳米纤维后浸泡到pH 8.5的0.2 M三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中2小时，然后将纳米纤维取出后放入烘箱加热40 ℃干燥4小时，最终得到内部固定化牛血清白蛋白的中空聚偏氟乙烯纳米纤维。
本实施例所制备的中空聚偏氟乙烯纳米纤维@聚多巴胺@牛血清白蛋白的扫描电镜图如图2所示，横截面扫描电镜图如图3所示，其内径为1800±200 nm；外径为2400±600nm。上述实施例中固定化的蛋白浓度为100 mg/mL，远远大于现有物理包埋方法1～5 mg/mL的浓度。
实施例2
将聚偏氟乙烯溶于体积比为7:3的N,N-二甲基甲酰胺和丙酮的混合有机溶剂中，加热到60 ℃充分溶解，持续搅拌6小时，配成重量百分比为10% 的溶液，作为外壳纺丝液，加入到10 mL 的注射器中；将丙三醇4 mL与水1 mL混合均匀，室温25 ℃，分别加入多巴胺0、1、10 mg和牛血清白蛋白100 mg，轻柔地混合3分钟，配置成总体积5 ml的多元醇水溶液，最终多巴胺浓度为0、0.2、2.0 mg/mL，牛血清白蛋白浓度为20 mg/mL的内芯纺丝液，加入到5 mL注射器中；连接同轴静电纺丝的管路和高压电源，调节纺丝端和接收端距离为15 cm，电压为12 kV，辊筒的转速为1200 RPM，利用两台微量注射泵分别控制内芯纺丝液的流速为0.6 mL/h，外壳纺丝液的流速为2.0 mL/h，流速比为1:3，进行同轴静电纺丝，在接受端收集纳米纤维后在室温25 ℃自然干燥8小时，最终得到不同多巴胺添加量的内部固定化牛血清白蛋白的中空聚偏氟乙烯纳米纤维。
将得到的纳米纤维剪成4×4 cm 样品，准确称重，然后浸泡到pH 7.4的0.1 M三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中24小时，在不同时间点取样，用Bradford 法测定释放的牛血清白蛋白浓度，绘制蛋白质泄漏率曲线。将得到的纳米纤维剪取固定的宽度和长度，并且测量其厚度，在力学测试仪上测试其断裂伸长率，分析中空纳米纤维的机械性能。
本实施例所制备的中空聚偏氟乙烯纳米纤维@聚多巴胺@牛血清白蛋白在不同多巴胺浓度和固定化时间的蛋白质泄漏率曲线如图4所示。当内芯纺丝液中没有添加多巴胺时，牛血清白蛋白泄露了近70%，随着添加多巴胺浓度的增大，生成的聚多巴胺含量增加，牛血清白蛋白的泄露率降低，当多巴胺浓度增大到2.0 mg/mL时，牛血清白蛋白的泄露率为11.3%，即88.7% 的牛血清白蛋白固定在中空纳米纤维内部。上述实施例结果表明，聚多巴胺可以有效的在材料内部固定化生物酶，相比物理包埋，极大的提高了酶负载量，降低了生物酶的流失泄露；优化的多巴胺浓度为2.0 mg/mL，优化的后处理固定化时间为 6小时。
本实施例所制备的中空聚偏氟乙烯纳米纤维@聚多巴胺@牛血清白蛋白在不同多巴胺浓度下的机械拉伸应力应变曲线如图5所示。当内芯纺丝液中没有添加多巴胺时，中空聚偏氟乙烯纳米纤维的断裂伸长率为50%，在加入0.2 mg/mL多巴胺之后断裂伸长率增大至70%，加入2.0 mg/mL多巴胺之后断裂伸长率增大至80%，表明添加多巴胺可以改善中空纳米纤维的机械性能。
实施例3
聚偏氟乙烯溶于体积比为7:3的N,N-二甲基甲酰胺和丙酮的混合有机溶剂中，加热到60 ℃充分溶解，持续搅拌4小时，配成重量百分比为10% 的溶液，作为外壳纺丝液，加入到10 mL 的注射器中；将丙三醇4 mL与pH 7.4的0.1 M 磷酸盐缓冲液1 mL混合均匀，室温25 ℃，分别加入多巴胺10 mg、葡萄糖氧化酶5 mg和辣根过氧化物酶5 mg，轻柔地混合1分钟，配置成总体积5 ml的多元醇水溶液，最终多巴胺浓度为2.0 mg/mL，生物酶总浓度为2.0 mg/mL的内芯纺丝液，加入到5 mL注射器中；连接同轴静电纺丝的管路和高压电源，调节纺丝端和接收端距离为15 cm，电压为10 kV，辊筒的转速为1000 RPM，利用两台微量注射泵分别控制内芯纺丝液的流速为0.6 mL/h，外壳纺丝液的流速为2.0 mL/h，流速比为1:3，进行同轴静电纺丝，在接受端收集纳米纤维后浸泡到pH 7.4的0.1 M磷酸盐缓冲溶液中6小时，然后将纳米纤维取出后在室温25 ℃自然干燥4小时，最终得到内部固定化葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶共2种生物酶的中空聚偏氟乙烯纳米纤维。
实施例4
聚偏氟乙烯溶于体积比为7:3的N,N-二甲基甲酰胺和丙酮的混合有机溶剂中，室温25 ℃充分溶解，持续搅拌8小时，配成重量百分比为10% 的溶液，作为外壳纺丝液，加入到10 mL 的注射器中；将丙三醇4 mL与pH 7.4的0.1 M 磷酸盐缓冲液1 mL混合均匀，室温25 ℃，分别加入多巴胺10 mg、半乳糖苷酶10 mg、葡萄糖氧化酶5 mg和辣根过氧化物酶5mg，轻柔地混合1分钟，配置成总体积5 ml的多元醇水溶液，最终多巴胺浓度为2.0 mg/mL，生物酶总浓度为4.0 mg/mL的内芯纺丝液，加入到5 mL注射器中；连接同轴静电纺丝的管路和高压电源，调节纺丝端和接收端距离为15 cm，电压为10 kV，辊筒的转速为1000 RPM，利用两台微量注射泵分别控制内芯纺丝液的流速为0.6 mL/h，外壳纺丝液的流速为2.0 mL/h，流速比为1:3，进行同轴静电纺丝，在接受端收集纳米纤维后浸泡到pH 7.4的0.1 M磷酸盐缓冲溶液中6小时，然后将纳米纤维取出后在室温25 ℃自然干燥8小时，最终得到内部固定化半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶共3种生物酶的中空聚偏氟乙烯纳米纤维。
本实施例所制备的中空聚偏氟乙烯纳米纤维@聚多巴胺@半乳糖苷酶/葡萄糖氧化酶/辣根过氧化物酶的扫描电镜图如图6所示，显示中空聚偏氟乙烯纳米纤维的表面具有纳米微孔；氮气吸脱附曲线图和孔径分布图如图7所示，结果表明经吸附模型计算中空聚偏氟乙烯纳米纤维的比表面积为20.557 m2∙g-1，具有3～10 nm、30～40 nm和150～160 nm的孔径分布，可以容许底物通过高分子聚合物外壳进入中空纳米纤维内部，满足底物与酶的充分接触。
本实施例所制备的中空聚偏氟乙烯纳米纤维@聚多巴胺@半乳糖苷酶/葡萄糖氧化酶/辣根过氧化物酶与相应的游离态生物酶（前后对比的生物酶的量相等）在不同反应时间下的相对催化活性曲线图如图8所示，在反应体系中添加底物乳糖和染料分子10-乙酰基-3,7-二羟基吩嗪，被聚多巴胺原位均匀固定在中空纳米纤维内部的半乳糖苷酶首先催化乳糖分解为半乳糖和葡萄糖，然后葡萄糖氧化酶将上一步反应产生的葡萄糖氧化为葡萄糖酸并生成双氧水，最后辣根过氧化物酶利用第二步反应生成的双氧水将染料分子10-乙酰基-3,7-二羟基吩嗪氧化为荧光分子7-羟基-3H-吩恶嗪-3-酮（试卤灵）产生585 nm荧光，其荧光强度换算的相对催化活性比游离酶增强了4.4倍，这表明在中空纳米纤维内部原位均匀固定的半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶具有级联反应特性，中空管状的限域结构有利于多种生物酶形成级联反应进行催化反应，与相应的游离态生物酶相比，极大的提高了整体的催化活性。
实施例5
聚偏氟乙烯溶于体积比为7:3的N,N-二甲基甲酰胺和丙酮的混合有机溶剂中，加热到40 ℃充分溶解，持续搅拌4小时，配成重量百分比为20% 的溶液，作为外壳纺丝液，加入到10 mL 的注射器中；将丙三醇4 mL与pH 7.4的0.1 M 磷酸盐缓冲液1 mL混合均匀，冷却到4 ℃，分别加入多巴胺10 mg、漆酶20 mg和辣根过氧化物酶20 mg，轻柔地混合1分钟，配置成总体积5 ml的多元醇水溶液，最终多巴胺浓度为2.0 mg/mL，生物酶总浓度为8.0mg/mL的内芯纺丝液，加入到5 mL注射器中；连接同轴静电纺丝的管路和高压电源，调节纺丝端和接收端距离为15 cm，电压为12 kV，辊筒的转速为1250 RPM，利用两台微量注射泵分别控制内芯纺丝液的流速为0.5 mL/h，外壳纺丝液的流速为2.5 mL/h，流速比为1:5，进行同轴静电纺丝，在接受端收集纳米纤维后浸泡到pH 7.4的0.1 M三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中6小时，然后将纳米纤维取出后在室温25 ℃自然干燥6小时，最终得到内部固定化漆酶和辣根过氧化物酶共2种生物酶的中空聚偏氟乙烯纳米纤维。
本实施例所制备的中空聚偏氟乙烯纳米纤维@聚多巴胺@漆酶/辣根过氧化物酶的扫描电镜图如图9所示；中空聚偏氟乙烯纳米纤维@聚多巴胺@漆酶/辣根过氧化物酶与相应的游离态生物酶在4 ℃下的存储时间与相对催化活性曲线图如图10所示，表明中空纳米纤维内部固定的漆酶和辣根过氧化物酶可以保存较长时间，比游离态生物酶可以保持更高的催化活性。
实施例6
聚醚砜溶于体积比为8:2的N,N-二甲基乙酰胺和丙酮的混合有机溶剂中，加热到50 ℃充分溶解，持续搅拌5小时，配成重量百分比为12% 的溶液，作为外壳纺丝液，加入到10 mL 的注射器中；将4 mL聚乙二醇-200、2 g聚乙二醇-2000与水1 mL混合均匀，室温25℃，分别加入多巴胺10 mg、脂肪酶50 mg，轻柔地混合3分钟，配置成总体积5 ml的聚乙二醇水溶液，最终多巴胺浓度为2.0 mg/mL，脂肪酶浓度为10.0 mg/mL的内芯纺丝液，加入到5mL注射器中；连接同轴静电纺丝的管路和高压电源，调节纺丝端和接收端距离为20 cm，电压为15 kV，辊筒的转速为1200 RPM，利用两台微量注射泵分别控制内芯纺丝液的流速为0.5 mL/h，外壳纺丝液的流速为2.0 mL/h，流速比为1:4，进行同轴静电纺丝，在接受端收集纳米纤维后浸泡到pH 7.4的0.1 M三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中6小时，然后将纳米纤维取出后在室温25 ℃自然干燥5小时，最终得到内部固定化脂肪酶的中空聚醚砜纳米纤维。
本实施例所制备的中空聚醚砜纳米纤维@聚多巴胺@脂肪酶的扫描电镜图如图11所示。
实施例7
聚丙烯腈溶于体积比为6:4的N,N-二甲基乙酰胺和二甲基亚砜的混合有机溶剂中，加热到50 ℃充分溶解，持续搅拌5小时，配成重量百分比为15% 的溶液，作为外壳纺丝液，加入到10 mL 的注射器中；将4 mL聚乙二醇-400与水1 mL混合均匀，室温25 ℃，分别加入多巴胺10 mg、辣根过氧化物酶20 mg、木质素过氧化物酶20 mg和锰过氧化物酶20 mg，轻柔地混合2分钟，配置成总体积5 ml的聚乙二醇水溶液，最终多巴胺浓度为2.0 mg/mL，生物酶总浓度为12.0 mg/mL的内芯纺丝液，加入到5 mL注射器中；连接同轴静电纺丝的管路和高压电源，调节纺丝端和接收端距离为10 cm，电压为16 kV，辊筒的转速为800 RPM，利用两台微量注射泵分别控制内芯纺丝液的流速为0.5 mL/h，外壳纺丝液的流速为1.5 mL/h，流速比为1:3，进行同轴静电纺丝，在接受端收集纳米纤维后浸泡到pH 7.4的0.1 M三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中6小时，然后将纳米纤维取出后在室温25 ℃自然干燥5小时，最终得到内部固定化辣根过氧化物酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶共3种生物酶的中空聚丙烯腈纳米纤维。
本实施例所制备的中空聚丙烯腈纳米纤维@聚多巴胺@辣根过氧化物酶/木质素过氧化物酶/锰过氧化物酶的扫描电镜图如图12所示。
实施例8
聚丙烯腈溶于体积比为9:1的N,N-二甲基乙酰胺和二氯甲烷的混合有机溶剂中，室温25 ℃充分溶解，持续搅拌4小时，配成重量百分比为25% 的溶液，作为外壳纺丝液，加入到10 mL 的注射器中；将3 mL聚甘油-10与水2 mL混合均匀，室温25 ℃，分别加入多巴胺20 mg、漆酶50 mg、木质素过氧化物酶50 mg和锰过氧化物酶50 mg，轻柔地混合2分钟，配置成总体积5 ml的多元醇水溶液，最终多巴胺浓度为4.0 mg/mL，生物酶总浓度为30.0 mg/mL的内芯纺丝液，加入到5 mL注射器中；连接同轴静电纺丝的管路和高压电源，调节纺丝端和接收端距离为20 cm，电压为15 kV，辊筒的转速为2000 RPM，利用两台微量注射泵分别控制内芯纺丝液的流速为0.6 mL/h，外壳纺丝液的流速为3.0 mL/h，流速比为1:5，进行同轴静电纺丝，在接受端收集纳米纤维后浸泡到pH 7.2的0.05 M磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中8小时，然后将纳米纤维取出后在室温25 ℃自然干燥6小时，最终得到内部固定化漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶共3种生物酶的中空聚丙烯腈纳米纤维。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种中空纳米纤维内部固定化生物酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将高分子聚合物溶于混合有机溶剂中，充分溶解搅拌均匀形成的透明溶液作为同轴静电纺丝的外壳纺丝液；
（2）将低分子量的多元醇或低聚合度的聚乙二醇溶于纯水或磷酸盐缓冲液中，添加多巴胺和生物酶，充分溶解混合均匀形成的均质溶液作为同轴静电纺丝的内芯纺丝液；
（3）将上述内芯纺丝液和外壳纺丝液分别加入两个注射器中，通过管路分别与同轴电纺针头的内外进样口相连；将高压电源的正极与同轴电纺针头喷丝口相连作为纺丝端，高压电源的接地极或负极与表面覆盖铝箔纸的旋转辊筒相连作为接受端；利用两台微量注射泵分别控制外壳纺丝液和内芯纺丝液的流速，施加电压进行同轴静电纺丝，在接受端收集纳米纤维；
（4）在后处理过程中，将收集到的纳米纤维浸泡到弱碱性缓冲液中，在纳米纤维内部低分子量的多元醇或低聚合度的聚乙二醇溶解出来形成中空管状结构的同时，多巴胺自发聚合生成的聚多巴胺原位固定生物酶将其截留在纳米纤维内部，最后将纳米纤维取出后进行干燥，最终得到内部修饰固定生物酶的功能化中空纳米纤维。
2.根据权利要求1所述的一种中空纳米纤维内部固定化生物酶的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述内芯纺丝液中的多巴胺浓度为0.1～10 mg/mL，生物酶浓度为0.1～200mg/mL。
3.根据权利要求1所述的一种中空纳米纤维内部固定化生物酶的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述高分子聚合物为聚偏氟乙烯、聚醚砜或聚丙烯腈；所述混合有机溶剂为溶解高分子聚合物的良溶剂和不良溶剂混合得到的，其中良溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或N,N-二甲基乙酰胺，不良溶剂为丙酮、二甲基亚砜、四氢呋喃或二氯甲烷。
4.根据权利要求1所述的一种中空纳米纤维内部固定化生物酶的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，外壳纺丝液为质量体积百分比8%～30% 的高分子聚合物溶液。
5.根据权利要求1所述的一种中空纳米纤维内部固定化生物酶的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述低分子量的多元醇为乙二醇、丙二醇、丙三醇、1,4-丁二醇、1,6-己二醇、戊五醇、己六醇、聚甘油-10中的一种或其中任意两种的混合物；所述的低聚合度的聚乙二醇为平均聚合度200、400、600、800、1000、1500或2000的聚乙二醇中的一种或其中任意两种的混合物。
6.根据权利要求1所述的一种中空纳米纤维内部固定化生物酶的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述生物酶为具有催化功能及生理活性的酶制品或蛋白质，所述生物酶为血红素蛋白、牛血清白蛋白、葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶、半乳糖苷酶、漆酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、脂肪酶中的一种或其中任意多种的混合物。
7.根据权利要求1所述的一种中空纳米纤维内部固定化生物酶的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述充分溶解混合均匀的步骤包括多元醇水溶液或聚乙二醇水溶液中添加多巴胺和生物酶后在室温25 ℃或冷却到4 ℃，轻柔地混合1～10分钟。
8.根据权利要求1所述的一种中空纳米纤维内部固定化生物酶的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述内芯纺丝液的流速为0.3～1.0 mL/h，外壳纺丝液的流速为1.0～3.0mL/h；所述施加电压为10～25 kV，纺丝端和接收端距离为10～30 cm；所述的旋转辊筒的转速为100～2000 RPM。
9.根据权利要求1所述的一种中空纳米纤维内部固定化生物酶的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，所述弱碱性缓冲液为磷酸盐缓冲溶液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液或磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶，其pH值为7.0～8.5，摩尔浓度为0.01～0.2 M；所述浸泡时间为1～24小时。
10.根据权利要求1所述的一种中空纳米纤维内部固定化生物酶的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，所述的内部修饰固定生物酶的功能化中空纳米纤维的外径为300～5000nm，内径为200～4000 nm。
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