JP2016524967A - 組織再生のための微細組織を用いて機能化された三次元スキャフォールド - Google Patents

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Abstract

本発明は、成長因子を欠く生体材料に関し、以下を含む：‐ 生体適合性ポリマーで作られた三次元スキャフォールド；および‐ 生細胞、それにおいて、前記生細胞は微細組織の形態であり、ナノ繊維の三次元スキャフォールドはナノ繊維スキャフォールドである。それは、さらに、そのような生体材料を製造するための方法に関する。最後に、それは、骨および／または軟骨欠損の処置における使用のためのそのような生体材料に関する。

Description

本発明は、組織生成のために有用な、三次元機能化スキャフォールドおよび生細胞を含む生体材料に関する。それは、さらに、そのような生体材料を産生するための方法に関する。
それは、また、特に移植片として、そのような生体材料および骨または軟骨欠損の処置における使用のための生体材料を使用し、骨または軟骨欠損を処置する方法に関する。
［発明の背景］
骨再生は、骨形成の複雑で十分に編成された生理学的プロセスであり、正常な骨折治癒の間に生じ、成人期を通じて継続的なリモデリングに関与する。クリニックにおいて、骨再生は、外傷、腫瘍切除により作られた大きな骨欠損の骨格再構成などのために、または再生プロセスが損なわれた場合（非癒合、骨粗鬆症）において大量に要求されうる。現在の骨再生プロセス（無腓骨血管新生移植片、自家骨移植片、同種移植片の移植、ならびに成長因子、スキャフォールド、および骨前駆細胞の使用を含む）は不満が残る。なぜなら、それらによって、不十分な量の骨がもたらされるからである。
骨再生のための有望な戦略は、単に非生体スキャフォールドを移植するためよりむしろ、新たな機能的な組織を生成することを目的とする組織工学アプローチである。骨組織工学において、前駆細胞、例えば間葉系幹細胞（ＭＳＣ；天然または増殖）、または成熟細胞（骨芽細胞）が、骨を生成し、維持するために、生体適合性スキャフォールド中に、理想的には、適当な成長因子（例えば骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）など）を伴う三次元組織様構造中に播種される。現在のアプローチは、十分に頑強な骨再生を可能にしていない。さらに、骨再生の速度を改善させることが必要である。
骨芽細胞を加えることが、骨再生の速度を増強する際に有用でありうることが以前に示されている。特許出願ＷＯ２０１２／１１３８１２ Ａ１には、成長因子を組み込みうる高分子電解質多層膜を用いてコーティングされた生分解性ポリマーのナノ繊維スキャフォールドを含む生体材料が開示されている。生細胞は、そのようなナノ構造ハイブリッド膜上に沈着された場合、高分子電解質多層膜により形成された成長因子のスマートナノリザーバーが、組織の再成長の期間にわたる遅い、制御された放出を可能にする。
最近では、５０μmの厚さを伴う、そのような生体材料が、マウスにおけるインビボ移植後でのスキャフォールド内部での完全コロニー形成および骨誘導を伴う、優れた骨再生を可能にすることが示された（Mendoza-Palomares, C. et al., ACS Nano 6, 483-490 (2012)）。
この技術は、小さな病変についての骨再生のために非常に有望である。しかし、それは、５０μmまでの厚さを有する移植片に限定されると思われる。なぜなら、細胞のコロニー形成および骨誘導は、より厚い移植片については満足できないからである。
Lai et al.（2011 PLoS ONE 6(10): e26821. doi:10.1371/journal.pone.0026821）には、三次元ポリスチレンスキャフォールド上で神経細胞を培養する際での微細組織形成が記載されている。
このように、大きな病変を含む、効率的な骨および／または軟骨修復（例えば骨軟骨部全体の回復のためなど）を可能にする生体材料の必要性が依然として残っている。そのような生体材料によって、高品質で、頑強で、耐久性があり、迅速な組織再生が、回復時間を短縮し、患者についての術後合併症のリスクを減少させることを可能にするはずである。理想的には、これらの生体材料は、成長因子についての必要性を伴わずに、速く、徹底的な組織再生を可能にするはずである。また、コストを下げ、従来の介入に競合するように、産生時間を短縮することが有利であろう。
本発明に従い、この必要性は、微細組織により機能化されているナノ繊維スキャフォールドを含む生体材料により満たされる。
そのような生体材料によって、有利には、三次元スキャフォールド内に第２の三次元組織再生システムが作製される。
そのようなスキャフォールドは、その上に沈着した生細胞の加速再生を可能にすることが発見された。また、組織再生は、スキャフォールドのコアまで、深く進行することが示された。そのような生体材料上での組織生成は、このように、成長因子の存在を要求しない。
そのような機能化されたナノ繊維スキャフォールドが、インビボで骨再生を効率的に誘導することが可能であることがさらに実証されている。
本発明に従った生体材料は、再生ナノ医療のための新世代の生体材料を表す。実際に、微細組織によりスキャフォールドを機能化する戦略は、細胞増殖に影響し、それにより、厚いスキャフォールドの完全なコロニー形成でさえ可能にし、今日のクリニックにおいて使用される生細胞を用いて機能化されたスキャフォールドと比較し、有効性が増強される。現在、この改善は、微細組織により形成された細胞についてのさらなる三次元環境による、スキャフォールド上の生細胞により形成された二次元細胞単層の置換に起因すると考えられる。
第１の態様に従い、本発明は、このように、以下を含む、成長因子を欠く生体材料を提供する：
‐ 生体適合性ポリマーで作られた三次元スキャフォールド；および
‐ 生細胞、
それにおいて、前記生細胞は、微細組織の形態である。
好ましくは、三次元スキャフォールドは、ナノ繊維スキャフォールドまたはヒドロゲルである。
生体適合性ポリマーは、好ましくは、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（エチレングリコール）テレフタレート、ポリ（ブチレンテレフタレート）、コラーゲン、フィブリン、ヒアルロン酸、ヒドロキシアパタイト、コンドロイチン硫酸、キトサン、コポリマー、およびそれらの混合物より選択される。
三次元スキャフォールドは、５０μmから２cmの好ましい厚さを有する。
微細組織は、特に、骨芽細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、筋細胞、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、および／または軟骨細胞を含みうる。
微細組織は、特に、１００から３００μmのサイズを有しうる。
特に好ましいのは、移植片である、そのような生体材料である。
第２の態様に従い、本発明は、以下の工程を含む、生体適合性ポリマーおよび生細胞で作られる三次元スキャフォールドを含む生体材料を産生するための方法を提供する：
（ａ）生体適合性ポリマーで作られた三次元スキャフォールドを産生すること；および
（ｂ）機能化された三次元スキャフォールドを形成するように、前記三次元スキャフォールドを、生細胞の微細組織と接触させること。
生体適合性ポリマーは、特に、ポリ（ε−カプロラクトン）、コラーゲン、フィブリン、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（エチレングリコール）テレフタレート、ポリ（ブチレンテレフタレート）、またはそれらのコポリマーより選択してもよい。
微細組織は、特に、骨芽細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、筋細胞、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、および／または軟骨細胞に含みうる。
上の方法の工程（ｂ）は、好ましくは、三次元スキャフォールド中またはその上への微細組織の溶液または分散液の注射または沈着により、あるいは、前記溶液または分散液中へ三次元スキャフォールドを浸漬することにより行われる。
第３の態様に従い、本発明は、骨および／または軟骨欠損の処置における使用のための、特に、離断性骨軟骨症、骨壊死、骨軟骨骨折、脊椎固定術に苦しむ患者における骨および／または軟骨欠損、傷害に起因する骨および／または軟骨欠損、加齢に起因する骨および／または軟骨欠損、顎顔面再建を必要とする骨および／または軟骨欠損、サイナスリフトを必要とする骨および／または軟骨欠損、歯槽堤増大術を必要とする骨および／または軟骨欠損、あるいは腫瘍に起因する骨および／または軟骨喪失の処置における使用のための、そのような生体材料に関する。
また、軟骨下骨欠損または骨軟骨欠損の処置における使用のための、そのような生体材料に関する。
特に好ましいのは、移植片としての使用のための、そのような生体材料である。
［定義］
本願内で、「生体材料」により、哺乳動物における、特にヒト患者における、インビボでの使用のために適切な任意の材料を意味する。より具体的には、本発明に従った生体材料は、移植可能であり、このように、移植片としての使用のために適切である。
用語「三次元スキャフォールド」は、組織再生のための一時的なスキャフォールドを提供しながら、組織の（例、骨および／または軟骨の）自然特性を模倣することが可能であるマトリックスを意味する。この用語は、内因性細胞外マトリックスを包含しない。
用語「ナノ繊維スキャフォールド」は、繊維、顕著には、ポリマー繊維により形成された特定の三次元スキャフォールドを指し、その直径は１μm未満である。繊維の存在に起因して、ナノ繊維スキャフォールドは、組織の三次元構造を模倣するだけでなく、また、細胞の接着および伸展を促進する。
用語「ヒドロゲル」は、定常状態にある場合に流動を示さない固体のゼリー状材料を指す。そのようなヒドロゲルは、分散媒質としての水中での架橋された親水性ポリマー鎖のネットワークで作られる。ヒドロゲル中では、ポリマー鎖が、細胞の付着および伸展に導く三次元構造を形成する。
用語「生細胞」は、成長、増殖、および分化が可能である細胞を指す。
用語「微細組織」は、天然組織と形態学的および機能的に非常に類似している、生細胞の多細胞スフェロイドを指定する。微細組織は、密接な細胞間接触、インビボに近い遺伝子発現プロファイル、インタクトな内因性細胞外マトリックス、ならびに生理学的栄養勾配および酸素勾配を示す。
本明細書を通して使用する通り、用語「治療的分子」は、疾患を処置または防止することが意図された任意の分子を指す。それは、例えば、販売許可が、（欧州医薬品庁（ＥＭＡ）により、または米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により）発行されている薬物、または臨床もしくは前臨床治験を受けている候補薬物に対応しうる。治療的分子は、例えば、ポリペプチド（組換えタンパク質、抗体およびペプチドを含む）、核酸（ＲＮＡ分子およびＤＮＡ分子を含む）、化学分子（例、小分子）、または糖（例、リポ多糖）に対応しうる。
用語「成長因子を欠く生体材料」は、追加の成長因子を欠く生体材料を指す。
［発明の詳細な説明］
本発明の主題は、成長因子を欠く生体材料であって、以下を含む：
‐ 生体適合性ポリマーで作られた三次元スキャフォールド；および
‐ 生細胞、
それにおいて、前記生細胞は、微細組織の形態である。
実際に、そのような生体材料は、大きな病変の修復のために要求されるような、厚いスキャフォールドを含む、頑強な組織を再生するための新たな戦略として特に有用である。
［本発明の生体材料］
本発明に従った生体材料は、生体適合性ポリマーで作られた三次元スキャフォールドを含む。
前記生体適合性ポリマーは、合成または天然のいずれかでありうる。生体適合性ポリマーは、好ましくは、生分解性である。しかし、非生分解性の生体適合性ポリマーで作られた三次元スキャフォールドも本明細書において熟考される。なぜなら、そのようなスキャフォールドは、例えば、プロテーゼの置換において、脊椎固定術を行う際、または骨欠損の充填材料として有用であるからである。
前記三次元スキャフォールドは、好ましくは、多孔性である、または少なくとも１つの多孔性側もしくは部分を含む。
三次元スキャフォールドは、顕著には、大きな分子（例えばポリマーなど）により、または細い繊維（例えばナノ繊維など）により形成されうる。故に、スキャフォールドは、特に、ゲル、顕著には、ハイドロゲルまたはナノ繊維材料でありうる。
ヒドロゲルは、当業者に周知である。コラーゲンヒドロゲルは、例えば、コラーゲン（例、３mLのRat Tail Type-I Collagen）を、１０%ＦＢＳ（例、５．５mL）を含む培地と、０．１M ＮａＯＨ溶液（例、０．５mL）と混合することにより調製してもよい。アルギン酸ヒドロゲルは、例えば、アルギン酸塩およびヒアルロン酸（アルギン酸塩：ヒアルロン酸溶液（４：１）、０．１５M ＮａＣｌ溶液（ｐＨ７．４）中で調製してもよい）の混合物でありうる。
ナノ繊維キャフォールドは、典型的には、約５０から約１０００μm、好ましくは約５０から約５００μmの、または約１００から約１０００μmの直径を有する繊維をベースとし、それは、高多孔性の、および相互接続された細孔構造を伴う材料を形成する。そのような材料は、顕著には、その高い比表面積のため、スキャフォールド構造として特に適切である。
移植片としての使用のために適切であるナノ繊維スキャフォールドが、当業者に周知である。例えば、Swieszkowski et al.（2007 Biomol Eng. 24:489-95）は、骨および／または軟骨再生の枠組みにおける移植片としての使用のために適切である、いくつかのナノ繊維スキャフォールドを開示している。
生分解性ポリマーで作られた、これらのナノ繊維スキャフォールドは、例えば、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（エチレングリコール）−テレフタレート（ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ）、ポリ（ブチレンテレフタレート（ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ））、またはそれらのコポリマーもしくは混合物で作ることができる。
ナノ繊維スキャフォールドは、また、ポリマー、例えばコラーゲン、フィブリン、ヒアルロン酸、ヒドロキシアパタイト、コンドロイチン硫酸、キトサン、およびそれらの混合物などで作ることができる。
好ましい実施形態において、ナノ繊維スキャフォールドは、ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）を含む、またはそれからなる。
本発明の枠組みにおいて、ポリマーナノ繊維は、好ましくは、エレクトロスピニングにより得られる。特に好ましいのは、Li et al.（2005 Biomaterials. 26:599-609）において、またはSavarino et al.（2007 Biomaterials. 28:3101-9）において記載される通りに得られたエレクトロスピニングされたＰＣＬ（ポリ（ε−カプロラクトン））ナノ繊維から作られたナノ繊維スキャフォールドである。
エレクトロスピニングされたナノ繊維は、それらの小さな直径のおかげで、非常に高い比表面積を有し、スキャフォールドが、コラーゲン細胞外マトリックスを模倣することを可能にする。そのようなナノ繊維材料は、高度に多孔質であり（９０%超）、優れた細孔の相互接続性および薄いナノ繊維層の重層を伴う。異なるナノ繊維層間での相互作用は、サイズに関して細孔のランダムな分布に導くエレクトロスピニングプロセスの間に、および異なるナノ繊維層間での定時の相互作用のため、ランダムに生じた。これらのユニークな特徴によって、進歩した適用のための多くの望ましい特性を伴うナノ繊維生体材料が明らかになる。
別の好ましい実施形態において、スキャフォールドは、コラーゲンを含む、またはそれからなる。コラーゲンは、例えば、ブタから得ることができる天然ポリマーである。コラーゲンで作られたナノ繊維スキャフォールドは、一般に、移植片として使用され、例えば、Geistlich Pharma AG（ドイツ）により商業化されているBio-Gide（登録商標）再吸収性コラーゲン膜を含む。
本発明の範囲内で、三次元スキャフォールドは、骨および／または軟骨の三次元構造を模倣する。
本発明に従った微細組織を用いて機能化された生体材料は、特に興味深い。なぜなら、それらは、スキャフォールドの簡単で速い詳細な細胞コロニー形成を可能にするためである。そのようなコロニー形成は、外部の力（例えば拍動流または圧力下での注入など）の使用を伴わず、ナノ繊維の三次元スキャフォールド全体での細胞の自発的な移動を可能にする。従って、本発明は、厚い生体材料の調製のため、即ち、スキャフォールドが、５０μmを上回る、有利には、５０mmまで、最も好ましくは０．１から２０、特に０．５から１０mmである場合、特に有利である。
本発明の枠組みにおいて、三次元スキャフォールドは、生細胞の微細組織を用いて機能化される。実際に、生細胞を移植することは、組織または器官の修復への有望な解決策である。多くの型の細胞が、懸濁液または非接着性環境中で培養された場合、凝集し、三次元多細胞スフェロイドに分化することができる。従来の単層培養と比較し、微細組織は、構造的および機能的特性に関して、本物の組織により良く似ている。
骨および／または軟骨再生の観点において、前記の生細胞の微細組織は、例えば、骨芽細胞、軟骨細胞、幹細胞（例、胚性または間葉系幹細胞）、骨髄間質細胞、もしくは、それらの混合物を含む、またはそれらからなりうる。好ましくは、前記の生細胞の微細組織は、骨芽細胞、軟骨細胞、もしくは、それらの混合物を含む、またはそれらからなりうる。特定の実施形態において、胚性幹細胞は、本発明に従った生細胞の微細組織から除外されうる。
微細組織の調製は、当技術分野において公知であり、顕著には、ＷＯ ２０１２／０１４０４７ Ａ１に詳細に記載されている。本発明の枠組みの中で特に好ましいのは、GravityPLUS（商標）プレート（InSphero（スイス、チューリッヒ）により販売）を使用した自動化懸滴プラットフォームにおける微細組織の調製である。そのような微細組織は、サイズ、形態、および細胞の数において十分に較正されており、このように、均質なコロニー形成およびその後の組織成長を確実にする。微細組織は、また、商業的に、顕著には、InSphero（スイス、チューリッヒ）で入手可能である。
前記の生細胞の微細組織は、好ましくは、ヒト細胞、最も好ましくは自己細胞（即ち、処置される患者から得られた細胞）で作られる。
特定の実施形態において、前記の生細胞の微細組織は、三次元スキャフォールドと接触させたヒドロゲル（例、アルギン酸ヒドロゲルまたはコラーゲンヒドロゲル）中に懸濁される。他の点において、本発明に従った生体材料は、また、スキャフォールドに加えて、生細胞の微細組織を含むヒドロゲルを含みうる。
本発明の好ましい実施形態において、生体材料は、以下を含む、またはそれからなる：
‐ エレクトロスピニングされたＰＣＬ（ポリ（ε−カプロラクトン））ナノ繊維で作られたナノ繊維スキャフォールドの形態における三次元スキャフォールド；および
‐ 骨芽細胞、軟骨細胞、またはそれらの混合物の微細組織。
本発明の実施形態に従い、三次元スキャフォールドは、さらに、また、成長因子以外の治療的分子を含んでもよく、このように、また、治療的分子のためのリザーバとしての役割を果たしうる。治療用分子を用いてさらに機能化された、そのようなスキャフォールドは、本発明に従った生体材料の移植部位での、前記の治療的分子の持続放出を可能にする。
［本発明に従った生体材料を産生するための方法］
別の態様に従い、本発明は、上に記載する生体材料を産生するための方法に関係し、該方法は、以下の工程を含む：
‐ 生体適合性ポリマーで作られた三次元スキャフォールドを産生すること； および
‐ 機能化された三次元スキャフォールドを形成するように、前記の三次元スキャフォールドを生細胞の微細組織と接触させること。
上の方法の第１工程に関して、三次元スキャフォールドを産生するためのいくつかの方法が、当技術分野において公知である。ナノ繊維スキャフォールドに関しては、それは、Swieszkowski et al.（2007 Biomol Eng. 24:489-95）を参照してもよい。ヒドロゲルおよびそれらの調製の方法は、そのようなものとしても公知である。
上の方法の第２工程は、機能化スキャフォールドを形成するように、スキャフォールドと微細組織との接触を、異なる方法で行ってもよい。
一般的に、微細組織は、液体媒質、一般的には水溶液、最も頻繁には緩衝液中での懸濁液の形態で使用される。あるいは、上で説明した通り、微細組織は、また、スキャフォールドと接触させる前に、ヒドロゲル中に導入してもよい。
微細組織と接触してスキャフォールドを置くための非常に便利で簡単な手段は、例えば、噴霧することにより、スキャフォールド上に微細組織の懸濁液を沈着させること、または、懸濁液中にスキャフォールドを浸漬すること、および、毛管力の補助を用いて、懸濁液をスキャフォールドに含浸させることである。
別の選択肢は、例えば、シリンジを使用して、注射により、スキャフォールド中へ微細組織の懸濁を押し込むことである。
使用前に、本発明に従った生体材料は、（例、それを無血清培地と接触させることにより）平衡化してもよい。
有利には、本発明に従った生体材料は、成長因子を加えずに、産生してもよい。
本発明は、さらに、本明細書において記載する方法により入手可能な生体材料を提供する。
［本発明に従った生体材料の治療的な使用］
本発明者らは、微細組織を用いて機能化された、本発明に従った生体材料が、骨および／または軟骨再生を誘導する際に非常に効率的であることを示してきた。特に、それらは、移植片としての使用のために適切である。
従って、本発明は、骨および／または軟骨欠損の充填材料としての使用のための、あるいは、骨および／または軟骨再生における使用のための、上の段落において記載する生体材料に関係する。本発明は、また、骨および／または軟骨欠損の処置における使用のための、上の段落において記載する生体材料を提供する。
骨および／または軟骨欠損は、骨、もしくは軟骨のいずれか、または両方に影響しうる。それは、例えば、軟骨欠損、骨軟骨欠損、または軟骨下骨欠損でありうる。
本発明に従った特定の実施形態において、骨および／または軟骨欠損は、軟骨下骨欠損である。本発明は、このように、軟骨下骨再生における使用のための、および／または軟骨下骨欠損の処置における使用のための、上の段落において記載する生体材料を提供する。
特に、本発明に従った生体材料は、離断性骨軟骨症、骨壊死、骨軟骨骨折、脊椎固定術に苦しむ患者における骨および／または軟骨欠損、傷害（例、スポーツ傷害または事故に起因する傷害）に起因する骨および／または軟骨欠損、加齢に起因する骨および／または軟骨欠損、顎顔面再建を必要とする骨および／または軟骨欠損、サイナスリフトを必要とする骨および／または軟骨欠損、歯槽堤増大術を必要とする骨および／または軟骨欠損、あるいは腫瘍（良性および癌性腫瘍を含む）に起因する骨および／または軟骨喪失の処置における使用を見出す。
特定の実施形態において、骨および／または軟骨欠損は、関節欠損、例えば膝および／または足首の欠損などである。
生きた微細組織の存在に起因して、細胞コロニー形成は、厚いスキャフォールドについてでさえ、深く進行する。本発明の生体材料は、このように、大きなおよび／または深い骨および／または軟骨欠損の処置のために特に適当である。
例えば、生体材料が、大きなおよび／または深い骨欠損の処置における移植片としての使用のためである場合、生体材料は、好ましくは、骨芽細胞を含む。生体材料が、大きなおよび／または深い軟骨欠損の処置における移植片としての使用のためである場合、生体材料は、好ましくは、軟骨細胞を含む。生体材料が、骨および軟骨に影響する大きいおよび／または深い欠損（例、骨軟骨欠損または軟骨下骨欠損）の処置における移植片としての使用のためである場合、生体材料は、好ましくは、骨芽細胞および軟骨細胞の両方を含む。
本発明は、このように、その必要がある個体において、本発明に従った生体材料を移植する工程を含む、骨および／または軟骨欠損を処置するための方法を提供する。
処置される個体および／または患者は、好ましくは、ヒトの個体および／または患者である。しかし、本発明に従った生体材料は、また、獣医学の分野における使用を見出す。
本明細書中で引用される全ての参考文献（学術論文または要約、公開特許出願、発行特許、または任意の他の文献を含む）は、本明細書中で参照として全体的に組み入れられ、引用した参考文献において提示される全てのデータ、表、図、およびテキストを含む。
異なる意味を有するが、用語「含む」、「有する」、「含む」、および「からなる」は、本発明の上の記載を通して、互いに置換してもよい。
本明細書の枠組みにおいて、全ての分子および細胞が、場合により、単離および／または精製されうる。
本発明は、以下の実施例および図面を考慮して、さらに評価される。
実施例１に従ったＰＣＬ（ポリ（ε−カプロラクトン）エレクトロスピニングナノ繊維スキャフォールドの光顕微鏡写真：正面図（Ａ）、斜め前から見た図（Ｂ）、透過光からの正面図（Ｃ）。 ＤＡＰＩ（ＤＮＡ）およびファロイジン（アクチン）を用いて染色したヒト初代骨芽細胞の微細組織（Ａ、Ｂ、Ｃ）および実施例２に従ったスキャフォールド中の生きた微細組織ネスティング（Ｄ）の蛍光顕微鏡写真。 ７日（Ａ）および１４日（ＢおよびＣ）後の実施例２に従ったスキャフォールド上で成長するヒト骨芽細胞の微細組織のＳＥＭ可視化および形態。 ３日、７日、１４日、２１日、および２８日（Ａ）後の実施例１に従ったスキャフォールドの表面上で成長するヒト骨芽細胞の単一細胞および微細組織のインビトロ増殖。２１日後の骨誘導および石灰化（アリザリンレッド染色）、２１日（Ｄ）および２８日（Ｅ）後のヒト骨芽細胞の単一細胞（Ｃ）および微細組織のインビトロ培養。細胞を伴わない対照（Ｂ）。 ヌードマウスにおける４週間頭蓋冠移植後での、ヒト初代骨芽細胞の単一細胞（比較例ＡおよびＣに従う）および微細組織（実施例２ＢおよびＤに従う）を用いて機能化されたスキャフォールドのインビボ骨誘導。マロリー染色（ＡおよびＢ）について：暗灰色の細胞核、明灰色の骨コラーゲンマトリックス、ＨＢ：宿主の骨、ＮＢ：新しい骨。カルセイン染色（ＣおよびＤ）について、ＤＡＰＩを用いた暗灰色の細胞核、カルセインを用いた明灰色の形成中の骨。 実施例４に従って調製された骨軟骨移植片の概略図。
実施例
実施例１：材料および方法
化学物質
ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）、Capa 6800（Ｍｗ＝８００００）分析グレードは、Perstorp（Industriparken、Sweden）から入手した。ＰＣＬは、２７%重量／容積のジクロロメタン／ジメチルホルムアミド（ＤＣＭ／ＤＭＦ４０／６０容積／容積）の混合物中に溶解し、良好なポリマーの可溶化を確実にするために、使用前に一晩撹拌した。
エレクトロスピニング
IME Technologies（Eindhoven, Netherlands）から購入した標準的なエレクトロスピニングセットアップ装置EC-DIGを使用し、ＰＣＬ三次元ナノ繊維スキャフォールドを作製した。ＰＣＬ溶液を５mLシリンジ中に注ぎ、プログラム可能なポンプ（ProSense）により、１．２mL/時間の流速で直径０．８mmの２１Ｇ針を通して排出させた。エレクトロスピニング排出は、導電性コレクター上に配置された孔を用いて貫通された２．５mm厚（直径２５mm）のポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）プレートの使用により、集中させた。コレクターを、針から１６cmの距離に配置した。＋１５kVの電圧を針に適用したのに対し、−５kVを、エレクトロスピニングプロセスの間に、コレクター上に適用した。全ての実験について、温度および湿度を２５℃および４０%で一定に保った。エレクトロスピニングにより得られた三次元スキャフォールドを図１に示す。
細胞培養
ヒト初代骨芽細胞は、Promocell（ハイデルベルク、ドイツ）から得て、補体および５０U/mLペニシリン、５０μg/mLストレプトマイシン、２．５μg/mLアンホテリシンＢを加えた特定の骨芽細胞の成長培地中で培養した。細胞を、５%ＣＯ２の加湿雰囲気中で、３７℃でインキュベートした。細胞がサブコンフルエントに達した際、それらを、トリプシンを用いて収集し、継代培養した。
微細組織培養
骨芽細胞をGravityPLUS（商標）プレート（InSphero, Zurich, Switzerlandから）中に播種し、微細組織を産生した。微細組織当たり１×１０４個細胞を、これらのプレート中に播種し、５日間培養した。骨再生のために、骨芽細胞の微細組織を、次に、インビトロ試験およびインビボ移植のためにＰＣＬ三次元スキャフォールド上に播種した。
アルギン酸ヒドロゲル培養
骨芽細胞をGravityPLUS（商標）プレート（InSphero, Zurich, Switzerlandから）中に播種し、微細組織を産生させた。微細組織当たり１×１０４個細胞を、これらのプレート中に播種し、５日間培養した。軟骨再生のために、軟骨細胞の微細組織を、次に、アルギン酸塩（１２mg/mL）／ヒアルロン酸（３mg/mL）ヒドロゲル溶液中に懸濁した。アルギン酸塩を、次に、３７℃で１５分間、１０２mMのＣａＣｌ２溶液中で重合させた。アルギン酸塩／ＡＨを用いて包埋された微細組織を、次に、１mMのＣａＣｌ２を添加した培地中で培養した。
細胞の生存および増殖
細胞生存率は、トリパンブルー排除により決定した。AlamarBlue（登録商標）（Serotec）を使用し、細胞増殖を評価した。AlamarBlueテストは、細胞代謝に応答して色が変化する、非毒性、水溶性、比色レドックス指標である。本試験において、４×１０４個のヒト骨芽細胞の単一細胞を、４８ウェルプレート上に配置されたＰＣＬスキャフォールド（ｎ＝３）上に播種し、１×１０４個の骨芽細胞の４つの微細組織を、比較のために、他のＰＣＬスキャフォールド上に播種した。３日間の培養後、細胞を、３７℃および５%ＣＯ２の加湿雰囲気中の１０%AlamarBlue／ＤＭＥＭ溶液中でインキュベートした。４時間後、AlamarBlueの低下の割合を決定するために、２００μLのインキュベーション培地を９６ウェルプレートに移し、５７０nmおよび６３０nmで測定した。同じプロトコルを、次に、７、１４、２１、２８日の培養後に繰り返し、細胞増殖をモニターした。
Alizarin Red S染色を使用した石灰化のインビトロ分析
Alizarin Red S粉末を、１００mLについて２ｇの濃度で蒸留水に溶解した。サンプルは、２０分間にわたりAlizarin Red溶液中でインキュベートし、次に、蒸留水を用いて数回洗浄した。サンプルは、Tissue-Tek OCT（商標）Compound中に包埋し、クライオスタット（LEICA JUNG CM3000）を用いて、切片（３５μm）に切断した。切片を、次に、光学顕微鏡（LEICA DM4000 B）下で観察した。
ヌードマウスの頭蓋冠におけるインビボ移植
マウスを麻酔し、ヒト単一細胞の骨芽細胞を播種したＰＣＬ三次元スキャフォールドを用いて、頭蓋冠の側に、骨芽細胞の微細組織を播種したＰＣＬ三次元スキャフォールドを用いて、反対側に移植した。１群当たり５匹のマウスを使用した。移植は、上と同じプロトコルを用いて行われている。頭蓋冠移植の２または４週間後、マウスを屠殺し、サンプルを分析のために抽出した。
ヌードマウスにおけるインビボ皮下移植
マウスを麻酔し、ヒト単一細胞の骨芽細胞を播種したＰＣＬ三次元スキャフォールドおよび骨芽細胞の微細組織を播種したＰＣＬ三次元スキャフォールドを用いて移植した。サンプルは、マウスの耳の後ろの皮膚と筋肉の間に移植した。１群当たり５匹のマウスを使用した。頭蓋冠移植の４週間後、マウスを屠殺し、サンプルを分析のために抽出した。
骨誘導マロリー着色の組織学的分析
移植片は、２日間、Bouin Hollande溶液を用いて固定した。次に、それらを、一連の増加エタノール濃度を通じで脱水し、トルエンを用いて清浄化し、パラフィンワックス中に包埋した。切片を、スレッジミクロトームを使用して７μmに切断し、スライドガラス上に乗せた。パラフィンワックスの除去後、頭蓋冠の切片および皮下移植片は、２日間、マロリー着色を使用して染色した。
走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）
形態を分析するために、３７℃で２時間にわたる２．５%グルタルアルデヒド中での固定、１時間にわたる四酸化オスミウム１%インキュベーション、および脱水後、スキャフォールドを、金コーティングし（Edwards Sputter Coater）、従来のモード（高真空）で走査型電子顕微鏡（SEM Hitachi TM1000）を用いて観察した。
共焦点顕微鏡法
ヒト骨芽細胞の単一細胞または微細組織を、ＰＣＬ三次元エレクトロスピニングスキャフォールド上に播種し、ＰＦＡ４%を用いた固定前に、１および２１日間にわたり培養した。次に、細胞核を、ＤＡＰＩを用いて染色し、ナノ繊維は、PLL-FITCを用いて染色した。蛍光観察を、共焦点顕微鏡Zeiss LSM700を用いて実施した。
免疫蛍光染色および観察
単一細胞としてのヒト骨芽細胞または骨芽細胞の微細組織を用いて播種したサンプルを、２１日間にわたり培養した。次に、それらを、１時間にわたり４%ＰＦＡを用いて固定し、１時間にわたり０．１%Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を用いて透過処理し、Ｆアクチン標識のために、Alexa Fluor 546コンジュゲートファロイジン（Molecular Probes）を用いて３０分間にわたり、および、核染色のために、２００nm ＤＡＰＩを用いて５分間にわたりインキュベートした。骨成長誘導は、ポリクローナルヤギ抗オステオカルシン（１／２００；Santa Cruz Biotechnology）およびモノクローナルマウス抗ＢＳＰＩＩ（１／２００；Santa Cruz Biotechnology）を４℃で一晩使用して、オステオカルシンおよびＢＳＰの発現をアッセイすることにより測定した。ＰＢＳを用いた洗浄後、サンプルを、Alexa Fluor 488（Invitrogen）にコンジュゲートした二次抗ヤギ抗体または抗マウス抗体とインキュベートした。サンプルは、蛍光顕微鏡（LEICA DM 4000 B）下で観察した。
カルセイン注射および観察
ＰＢＳ中のカルセイン（１０mg/kg、Sigma）の皮下注射を、剖検前の１０および３日目に与えた。頭蓋冠移植の４週間後、マウスを屠殺し、サンプルを抽出した。サンプルを、次に、Tissue-Tek中に包埋し、−２０℃で凍結し、クライオスタット（Leica JUNG CM3000）を用いて切片に切断した。細胞核を、５分間にわたり２００nm ＤＡＰＩ（Sigma）を用いて染色した。切片を、抗退色媒質を用いて乗せ、蛍光顕微鏡（Leica DM4000 B）下で観察した。
比較例：生きている骨芽細胞を用いて機能化されたスキャフォールド
本試験において、三次元スキャフォールド、厚さ１ｍｍを伴うエレクトロスピニングＰＣＬ（ポリ（ε−カプロラクトン）ナノ繊維移植片（６８９±４５μmの繊維径）を製造した（図１）。生死蛍光染色後のヒト初代骨芽細胞は、三次元移植片中への組み込み前に可視化した。
ヒト骨芽細胞により播種された場合に骨再生を誘導する、このエレクトロスピニングナノ繊維スキャフォールドの能力を、インビトロで分析した。細胞形態には、ＳＥＭが続き、継時的な細胞接着の増加が示された。
結果は、多孔質構造中への細胞の浸潤は、比較的限定されており、スキャフォールドの上面上での単層細胞膜の形成をもたらしたが、しかし、細孔中への任意の顕著な細胞浸潤に導かなかったことを示す。
上で言及する通り、移植後のスキャフォールド内部での完全なコロニー形成および骨誘導（マウス頭蓋冠、４週間）を伴う優れた骨再生が、５０μmの厚さを伴う、そのような移植片について最近観察された（Mendoza-Palomares, C., et al., ACS Nano 6, 483- 490 (2012)）。
しかし、この実施例において調製される、１mm程度の厚さを伴う、そのようなスキャフォールドでは、骨誘導は、依然として、４週間の移植後でさえ外表面に限定されていた。
実施例２：微細組織を用いて機能化されたスキャフォールド（インビトロ）
比較例は、スキャフォールドに、生きたヒト骨芽細胞の単一細胞の代わりに、生きたヒト骨芽細胞の微細組織を播種したことを除き、反復された。
微細組織は、InSphero AG（Zurich, Switzerland）からの懸滴細胞培養のために、GravityPLUS（商標）プレートを使用し、上に示したプロトコルに従って調製した。
スキャフォールド中への生きているヒト骨芽細胞の微細組織による取り込み、細胞のコロニー形成、増殖、および骨誘導を試験した。
特に、蛍光顕微鏡により観察された、スキャフォールドと接触した細胞の挙動は、微細組織が、スキャフォールド中への組み込み後に生存したままであることを示した（図２Ｄ）。骨芽細胞の微細組織の挙動、ならびに、コロニー形成および増殖後に骨再生を誘導する官能スキャフォールドの能力をＳＥＭにより試験した。スキャフォールドの深いコロニー形成後での継時的な微細組織の挙動を、走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）により観察した（図３）。
結果は、スキャフォールド上に播種された微細組織が、継時的にスキャフォールド中に広がることを示す。７日後、微細組織は、スキャフォールド上に付着し、さらに広がり始めたが、ナノ繊維上での骨芽細胞の遊走を示す（図３Ａ）。７日目と１４日目の間に、骨芽細胞は、スキャフォールドのコロニー形成および細孔中への浸潤を続けた。驚くべきことに、層別のコロニー形成は、恐らくは、骨芽細胞上でのナノ繊維の先導の影響に起因して観察される：細胞は、それらの伸長した糸状仮足を使用し、スキャフォールド中での繊維組織化に続く（図３Ｂおよび３Ｃ）。単一細胞を使用する場合、この現象は観察されなかった。
エレクトロスピニングされたナノ繊維の厚いキャフォールド上に播種されたヒト骨芽細胞の微細組織の増殖および細胞活性が、また、２８日間追跡され、ヒト骨芽単一細胞を用いて機能化されたスキャフォールドと比較された（図４）。
結果は、骨芽細胞の単一細胞を用いて機能化されたスキャフォールドにおいて、細胞増殖が経時的に（３日目から２８日目まで）増加することを示す（図４Ａ）。骨芽細胞の微細組織を使用し、細胞増殖が、また、増加するが、やや遅い。この現象は、恐らくは、微細組織を用いて機能化されたスキャフォールド中へのコロニー形成が、増殖前に生じるとの事実に起因する（図４Ａ）。これらの結果は、ヒト骨芽単一細胞（図４Ｃ）および微細組織（図４Ｄ）を用いて機能化されたスキャフォールドのインビトロ培養の２１日後に、アリザリンレッド染色により観察された骨誘導および石灰化と一致している（図４Ｄ）。２８日後、骨芽細胞の単一細胞を用いて機能化されたスキャフォールドの石灰化が、依然として、境界に限定されており（図４Ｃに示す通り）、完全な石灰化が、微細組織を伴うスキャフォールド中で既に達成している（図４Ｅ）。
実施例３：微細組織を用いて機能化されたスキャフォールド（インビボ）
比較例および実施例２において調製された骨芽細胞の微細組織を用いて機能化された厚いスキャフォールドを使用し、皮下移植および頭蓋冠移植が、ヌードマウスにおいて実現された（図５Ａ−Ｄ）。
生きた微細組織を用いて機能化されたスキャフォールドについての結果は、４週間後、細胞がスキャフォールド中に移動し、その内でさらに深くスキャフォールドにコロニー形成することを示し、また、骨誘導が生じた証拠を示す（図５Ｂおよび５Ｄ）。
骨誘導は、骨芽細胞の単一細胞を用いて機能化されたスキャフォールドと比較し、微細組織を用いて機能化されたスキャフォールドについて、より速いことにさらに注意する（図５Ｃおよび５Ｄ）。実際に、石灰化マトリクスの量の比較では、微細組織を用いて機能化されたスキャフォールドでの２２%石灰化面積に対して、骨芽細胞の単一細胞を用いて機能化されたスキャフォールドでの８%石灰化面積がもたらされる。
さらに、マウス頭蓋冠移植が、ヌードマウスにおいて同じ条件で行われ、皮下での結果が確認されている。
２週間後、両方の移植片は、良好な骨融合、大きな細胞コロニー形成、さらには石灰化した骨基質を示した。微細組織を用いて機能化されたスキャフォールドは、大きな新たな石灰化面積を提示した。
これらの結果は、微細組織を用いて機能化された、本発明に従った生体材料が、成長因子についての必要性を伴わず、５０μm超の厚さを有するスキャフォールドを含む、速く深い組織工学を提供することを示す。
実施例４：骨軟骨移植片（インビボ）
骨軟骨部の再生のために有用な移植片を、以下の通りに調製する。
ナノ繊維の三次元スキャフォールドは、５０μmまたは１mmの厚さを伴う、エレクトロスピニングＰＣＬ（ポリ（ε−カプロラクトン））ナノ繊維移植片（６８９±４５μmの繊維径）であった。三次元スキャフォールドは、上に示すプロトコルに従って得られた、軟骨細胞の微細組織または間葉系幹を含むアルギン酸ヒドロゲルを用いてカバーされた。
骨病変が小さかったため、これらは移植部位から動員されるため、骨芽細胞を用いてスキャフォールドを機能化する必要はなかった。
骨軟骨部の再生のための移植片は、次に、上に記載する通り、軟骨再生のためにヌードマウスにおいて移植された。
結果として得られた移植片の概略図を、図６に示す。骨軟骨移植片（１）は、軟骨細胞または間葉系幹細胞の微細組織（４）を含む、ヒドロゲル（アルギン酸）およびヒアルロン酸（３）を用いてカバーされたナノ繊維の三次元スキャフォールド（２）を含む。骨芽細胞（５）は、それらが移植部位から動員されうるため、必ずしも播種する必要はない。

Claims (15)

  1. 以下：
    ‐ 生体適合性ポリマーで作られた三次元スキャフォールド；および
    ‐ 生細胞
    を含む、成長因子を欠く生体材料であって、
    前記生細胞は、微細組織の形態であり、三次元スキャフォールドは、ナノ繊維スキャフォールドである、生体材料。
  2. ヒドロゲルをさらに含む、請求項１記載の生体材料。
  3. 微細組織が、骨芽細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、筋細胞、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、および／または軟骨細胞を含む、請求項１または２記載の生体材料。
  4. 生体適合性ポリマーが、ポリ（ε−カプロラクトン）、コラーゲン、フィブリン、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（エチレングリコール）テレフタレート、ポリ（ブチレンテレフタレート）、またはそれらのコポリマーより選択される、請求項３記載の生体材料。
  5. 三次元スキャフォールドが、５０μmから２cmの厚さを有する、請求項１〜４のいずれか一項記載の生体材料。
  6. 微細組織が、１００〜３００μmのサイズを有する、請求項１〜５のいずれか一項記載の生体材料。
  7. 移植片である、請求項１〜６のいずれか一項記載の生体材料。
  8. ナノ繊維生体適合性ポリマーおよび生細胞で作られるスキャフォールドを含む生体材料を産生するための方法であって、以下の工程：
    （ａ）生体適合性ポリマーで作られた三次元スキャフォールドを産生すること；および
    （ｂ）前記三次元スキャフォールドを生細胞の微細組織と接触させ、機能化された三次元スキャフォールドを形成すること
    を含む、方法。
  9. 生体適合性ポリマーが、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（エチレングリコール）テレフタレート、ポリ（ブチレンテレフタレート）、コラーゲン、フィブリン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、キトサン、コポリマー、およびそれらの混合物より選択される、請求項８記載の方法。
  10. 微細組織が、工程（ｂ）の前にヒドロゲル中に導入される、請求項８または９記載の方法。
  11. 工程（ｂ）が、三次元スキャフォールド中またはその上への微細組織の懸濁液の注入または沈着、あるいは三次元スキャフォールドを前記溶液または分散液中に浸漬することにより行われる、請求項８〜１１のいずれか記載の方法。
  12. 骨および／または軟骨欠損の処置における使用のための請求項１〜８記載の生体材料。
  13. 離断性骨軟骨症、骨壊死、骨軟骨骨折、脊椎固定に苦しむ患者における骨および／または軟骨欠損、傷害に起因する骨および／または軟骨欠損、加齢に起因する骨および／または軟骨欠損、顎顔面再建を必要とする骨および／または軟骨欠損、サイナスリフトを必要とする骨および／または軟骨欠損、歯槽堤増大術を必要とする骨および／または軟骨欠損、あるいは腫瘍に起因する骨および／または軟骨喪失の処置における使用のための、請求項１２記載の生体材料。
  14. 軟骨下骨欠損のまたは骨軟骨欠損の処置における使用のための、請求項１２または１３記載の生体材料。
  15. 移植片としての使用のための、請求項１２〜１４記載の生体材料。
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