JP2003304866A - 三次元凝集塊形成による細胞の分化制御 - Google Patents
三次元凝集塊形成による細胞の分化制御Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 単離した細胞の分化を促進させて、該細胞の
フェノタイプを正常に維持したまま、大量かつ短時間に
三次元凝集塊を構築する。さらに、これを利用して組織
再構築型のインプラントを効率的に作製する。 【解決手段】 正常骨・軟骨細胞、または未分化幹細胞
の初代培養細胞を非接着性の容器内で、細胞の凝集力を
高めるような条件下で浮遊培養することにより、細胞の
三次元凝集塊を作製する。該方法によって作製された三
次元凝集塊を利用してインプラントを作製する。
フェノタイプを正常に維持したまま、大量かつ短時間に
三次元凝集塊を構築する。さらに、これを利用して組織
再構築型のインプラントを効率的に作製する。 【解決手段】 正常骨・軟骨細胞、または未分化幹細胞
の初代培養細胞を非接着性の容器内で、細胞の凝集力を
高めるような条件下で浮遊培養することにより、細胞の
三次元凝集塊を作製する。該方法によって作製された三
次元凝集塊を利用してインプラントを作製する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、骨・軟骨細胞等の接着
性動物細胞を非接着性の容器内で浮遊培養することによ
り、短時間で大量に、正常なフェノタイプを維持した細
胞の三次元凝集塊を形成する方法に関する。さらに、該
方法によって形成された三次元凝集塊を用いて、組織再
構築型のインプラントを作製する方法に関する。
性動物細胞を非接着性の容器内で浮遊培養することによ
り、短時間で大量に、正常なフェノタイプを維持した細
胞の三次元凝集塊を形成する方法に関する。さらに、該
方法によって形成された三次元凝集塊を用いて、組織再
構築型のインプラントを作製する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】事故、老化、あるいは疾患による骨や軟
骨組織の損傷は、人間の運動機能に著しい障害をもたら
す。特に、関節障害は高齢者の多くに発症し、生活への
影響も大きいことから、高齢化社会を目前に控えた今日
では大きな社会問題にもなっている。
骨組織の損傷は、人間の運動機能に著しい障害をもたら
す。特に、関節障害は高齢者の多くに発症し、生活への
影響も大きいことから、高齢化社会を目前に控えた今日
では大きな社会問題にもなっている。
【０００３】元々骨や軟骨組織は再生能が低くく、損傷
を受けた関節等の修復には、モザイクプラステイと呼ば
れる荷重のかからない部位の軟骨組織を移植する手法
や、人工関節等のインプラントによる置換・補充が必要
となる。実際、我が国では年間５万個、約５００億円の
人工関節が体内に移植されている。しかし、従来の人工
関節は、金属、セラミックス、プラスチック等により巧
みに構築された構造を有するために、長期間の使用によ
る緩みや、感染、イオン溶出等の様々な問題が生じてい
る。
を受けた関節等の修復には、モザイクプラステイと呼ば
れる荷重のかからない部位の軟骨組織を移植する手法
や、人工関節等のインプラントによる置換・補充が必要
となる。実際、我が国では年間５万個、約５００億円の
人工関節が体内に移植されている。しかし、従来の人工
関節は、金属、セラミックス、プラスチック等により巧
みに構築された構造を有するために、長期間の使用によ
る緩みや、感染、イオン溶出等の様々な問題が生じてい
る。
【０００４】こうした問題の解決方法として、患者から
採取した骨・軟骨細胞を生体外で人工的に培養して、組
織再構築型のインプラントを開発する研究が世界的に試
みられている。しかしながら、生体から単離した骨・軟
骨細胞を培養担体に播種して付着培養すると、病変部位
のフェノタイプと同様の細胞に脱分化するために、組織
再構築型の人工関節および人工軟骨等の開発は未だ成功
していない。
採取した骨・軟骨細胞を生体外で人工的に培養して、組
織再構築型のインプラントを開発する研究が世界的に試
みられている。しかしながら、生体から単離した骨・軟
骨細胞を培養担体に播種して付着培養すると、病変部位
のフェノタイプと同様の細胞に脱分化するために、組織
再構築型の人工関節および人工軟骨等の開発は未だ成功
していない。
【０００５】一方、細胞のフェノタイプを病変部位に存
在する脱分化型から正常な組織と同様の分化型に戻す手
法として、試験管の底に細胞を遠心力で落として細胞の
凝集塊を形成させるペレット培養という技術がアメリカ
の企業によって報告されている。しかし、この方法で
は、一つの試験管に対して、非常に小さな組織片（三次
元凝集塊：スフェロイド）が一つしか形成できないた
め、これを利用して人工関節および人工軟骨等を構築す
ることは現実的ではない。
在する脱分化型から正常な組織と同様の分化型に戻す手
法として、試験管の底に細胞を遠心力で落として細胞の
凝集塊を形成させるペレット培養という技術がアメリカ
の企業によって報告されている。しかし、この方法で
は、一つの試験管に対して、非常に小さな組織片（三次
元凝集塊：スフェロイド）が一つしか形成できないた
め、これを利用して人工関節および人工軟骨等を構築す
ることは現実的ではない。
【０００６】ところで、動物細胞の多くは接着性細胞で
あるため、浮遊状態で長期間培養することは困難であ
る。そのため、このような接着性細胞は、接着性担体と
ともに培養するか、表面の接着性を高めた容器内で付着
培養することが一般的である。例えば、表面を親水化処
理したポリスチレン製容器や、ポリエチレンイミンやポ
リリジン等の塩基性高分子、あるいはフィブロネクチ
ン、ラミニン、各種コラーゲン、プロテオグリカン等の
細胞接着性蛋白質で表面を被覆した接着性の容器内で培
養する。ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＨＬ等の浮遊培養しやす
い、一部の樹立培養細胞株については、物理的な攪拌に
よって浮遊培養する方法も知られているが、骨・軟骨細
胞等の通常の接着性動物細胞を浮遊培養することは一般
に困難と言われ、行われていない。
あるため、浮遊状態で長期間培養することは困難であ
る。そのため、このような接着性細胞は、接着性担体と
ともに培養するか、表面の接着性を高めた容器内で付着
培養することが一般的である。例えば、表面を親水化処
理したポリスチレン製容器や、ポリエチレンイミンやポ
リリジン等の塩基性高分子、あるいはフィブロネクチ
ン、ラミニン、各種コラーゲン、プロテオグリカン等の
細胞接着性蛋白質で表面を被覆した接着性の容器内で培
養する。ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＨＬ等の浮遊培養しやす
い、一部の樹立培養細胞株については、物理的な攪拌に
よって浮遊培養する方法も知られているが、骨・軟骨細
胞等の通常の接着性動物細胞を浮遊培養することは一般
に困難と言われ、行われていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、単離した骨
・軟骨細胞の分化を促進させて、該細胞のフェノタイプ
を正常に維持したまま、大量かつ短時間に三次元凝集塊
を構築し、これを利用して組織再構築型のインプラント
を提供することを目的とする。
・軟骨細胞の分化を促進させて、該細胞のフェノタイプ
を正常に維持したまま、大量かつ短時間に三次元凝集塊
を構築し、これを利用して組織再構築型のインプラント
を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するため鋭意研究した結果、細胞の凝集力を高める
環境下で、正常骨・軟骨細胞、未分化幹細胞を浮遊培養
すると、細胞のフェノタイプを正常に維持したまま、大
量に三次元凝集塊を形成できることを見出し、本発明を
完成させた。
解決するため鋭意研究した結果、細胞の凝集力を高める
環境下で、正常骨・軟骨細胞、未分化幹細胞を浮遊培養
すると、細胞のフェノタイプを正常に維持したまま、大
量に三次元凝集塊を形成できることを見出し、本発明を
完成させた。
【０００９】すなわち、本発明は以下の（１）〜（７）
を提供するものである。 （１） 正常骨・軟骨細胞、または未分化幹細胞の初代
培養細胞を非接着性の容器内で浮遊培養することによ
り、細胞の三次元凝集塊を作製する方法。 （２） 浮遊培養が細胞の凝集を高めるような流れの存
在する系での浮遊培養である、上記（１）記載の方法。 （３） 細胞の凝集を高めるような流れの存在する系で
の浮遊培養が旋回培養である、上記（２）記載の方法。 （４） 正常骨・軟骨細胞または未分化幹細胞が、生体
から単離された細胞である、上記（１）〜（３）のいず
れか１項に記載の方法。 （５） 三次元凝集塊中の細胞が、付着培養された細胞
よりも分化が促進されていることを特徴とする、上記
（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法。 （６） 上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の方
法によって作製された三次元凝集塊を利用して、インプ
ラントを作製する方法。 （７） 正常骨・軟骨細胞、または未分化幹細胞の初代
培養細胞を非接着性の容器内で浮遊培養することによ
り、細胞の分化を促進させる方法。
を提供するものである。 （１） 正常骨・軟骨細胞、または未分化幹細胞の初代
培養細胞を非接着性の容器内で浮遊培養することによ
り、細胞の三次元凝集塊を作製する方法。 （２） 浮遊培養が細胞の凝集を高めるような流れの存
在する系での浮遊培養である、上記（１）記載の方法。 （３） 細胞の凝集を高めるような流れの存在する系で
の浮遊培養が旋回培養である、上記（２）記載の方法。 （４） 正常骨・軟骨細胞または未分化幹細胞が、生体
から単離された細胞である、上記（１）〜（３）のいず
れか１項に記載の方法。 （５） 三次元凝集塊中の細胞が、付着培養された細胞
よりも分化が促進されていることを特徴とする、上記
（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法。 （６） 上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の方
法によって作製された三次元凝集塊を利用して、インプ
ラントを作製する方法。 （７） 正常骨・軟骨細胞、または未分化幹細胞の初代
培養細胞を非接着性の容器内で浮遊培養することによ
り、細胞の分化を促進させる方法。
【００１０】
【発明の実施の形態】１．三次元凝集塊の作製方法
本発明は、正常骨・軟骨細胞、または未分化幹細胞の初
代培養細胞を非接着性の容器内で浮遊培養することによ
り、短時間かつ大量に、フェノタイプが正常に維持され
た細胞の三次元凝集塊を作製する方法に関する。
代培養細胞を非接着性の容器内で浮遊培養することによ
り、短時間かつ大量に、フェノタイプが正常に維持され
た細胞の三次元凝集塊を作製する方法に関する。
【００１１】１．１ 細胞
本発明で用いられる細胞は、正常骨・軟骨細胞、または
未分化幹細胞の初代培養細胞である。該細胞の由来は動
物であれば特に限定されないが、哺乳類が好ましく、霊
長類が最も好ましい。
未分化幹細胞の初代培養細胞である。該細胞の由来は動
物であれば特に限定されないが、哺乳類が好ましく、霊
長類が最も好ましい。
【００１２】本発明において、「正常骨・軟骨細胞」と
は、組織学的かつ遺伝子学的に正常な骨細胞および軟骨
細胞を意味し、疾患等により病変した骨細胞や軟骨細胞
は排除される。また、骨・軟骨細胞には、骨細胞、軟骨
細胞のほか、骨芽細胞、骨膜細胞、破骨細胞、および軟
骨芽細胞も含まれる。
は、組織学的かつ遺伝子学的に正常な骨細胞および軟骨
細胞を意味し、疾患等により病変した骨細胞や軟骨細胞
は排除される。また、骨・軟骨細胞には、骨細胞、軟骨
細胞のほか、骨芽細胞、骨膜細胞、破骨細胞、および軟
骨芽細胞も含まれる。
【００１３】本発明において、「未分化幹細胞」とは、
分化・増殖能力を有する未分化の細胞であり、たとえ
ば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、間葉系幹細胞、造血幹細
胞、骨格筋幹細胞、神経幹細胞および肝臓幹細胞等を挙
げることができるが、特に、胚性幹細胞および間葉系幹
細胞が好ましい。これらの未分化幹細胞は初代培養細胞
であることが必要である。
分化・増殖能力を有する未分化の細胞であり、たとえ
ば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、間葉系幹細胞、造血幹細
胞、骨格筋幹細胞、神経幹細胞および肝臓幹細胞等を挙
げることができるが、特に、胚性幹細胞および間葉系幹
細胞が好ましい。これらの未分化幹細胞は初代培養細胞
であることが必要である。
【００１４】前記細胞は、培養細胞株ではなく、生体か
ら単離された細胞を好適に用いることができる。なお、
生体は、患者自身であってもよいし、他人であってもよ
いし、あるいは、異種動物であってもよい。これらの細
胞は、常法に従って結合組織等を除去して調製すること
が好ましい。また、単離した細胞は、一次培養を行い、
予め増殖させてから用いてもよい。
ら単離された細胞を好適に用いることができる。なお、
生体は、患者自身であってもよいし、他人であってもよ
いし、あるいは、異種動物であってもよい。これらの細
胞は、常法に従って結合組織等を除去して調製すること
が好ましい。また、単離した細胞は、一次培養を行い、
予め増殖させてから用いてもよい。
【００１５】１．２ 非接着性の容器
本発明で用いられる培養容器は、非接着性の容器であ
る。本発明において、「非接着性の容器」とは、細胞が
付着しにくい容器であればよく、例えば、ポリエチレン
テレフタレート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ
カーボネート、ポリスチレン等の付着性の低いプラスチ
ック製の容器あるいは、フッ素加工、シリコン加工のよ
うな疎水性表面加工を施したプラスチック製またはガラ
ス製の容器を挙げることができる。該容器の大きさや形
状は特に限定されず、ディッシュ状、フラスコ状、ウェ
ル状等、培養する細胞に応じて任意の形状および大きさ
を選択することができる。
る。本発明において、「非接着性の容器」とは、細胞が
付着しにくい容器であればよく、例えば、ポリエチレン
テレフタレート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ
カーボネート、ポリスチレン等の付着性の低いプラスチ
ック製の容器あるいは、フッ素加工、シリコン加工のよ
うな疎水性表面加工を施したプラスチック製またはガラ
ス製の容器を挙げることができる。該容器の大きさや形
状は特に限定されず、ディッシュ状、フラスコ状、ウェ
ル状等、培養する細胞に応じて任意の形状および大きさ
を選択することができる。
【００１６】１．３ 細胞の浮遊培養
本発明の方法では、前記非接着性の容器内において細胞
を浮遊培養する。浮遊培養は静置培養であっても、静置
培養でなくてもよいが、細胞の凝集力を高める条件下で
の培養であることが好ましい。細胞の凝集力を高める条
件下での培養とは、例えば、細胞の凝集を高めるような
流れのある条件下での培養をいう。
を浮遊培養する。浮遊培養は静置培養であっても、静置
培養でなくてもよいが、細胞の凝集力を高める条件下で
の培養であることが好ましい。細胞の凝集力を高める条
件下での培養とは、例えば、細胞の凝集を高めるような
流れのある条件下での培養をいう。
【００１７】「細胞の凝集を高めるような流れのある条
件下」としては、例えば、旋回流等の流れによる応力
（遠心力、求心力）によって、細胞を１点に集めるよう
にして培養する方法を挙げることができる。本発明にお
いては、旋回培養をその好適な例として挙げる。旋回培
養を行う場合の旋回速度は、特に限定されず、容器の大
きさ等によって適宜設定する。例えば、35ｍｍ程度のウ
ェルであれば、１０〜１０００rpm程度で十分な三次元
凝集塊を形成させることができる。
件下」としては、例えば、旋回流等の流れによる応力
（遠心力、求心力）によって、細胞を１点に集めるよう
にして培養する方法を挙げることができる。本発明にお
いては、旋回培養をその好適な例として挙げる。旋回培
養を行う場合の旋回速度は、特に限定されず、容器の大
きさ等によって適宜設定する。例えば、35ｍｍ程度のウ
ェルであれば、１０〜１０００rpm程度で十分な三次元
凝集塊を形成させることができる。
【００１８】前記浮遊培養で用いられる培地は、特に限
定されず、培養する細胞に合わせて適宜選択することが
できる。例えば、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰ
Ｍ１，ｃＲＤＦ、ＥＲＤＦ、Ｆ１２、ＭＣＤＢ１３１、
Ｆ１２／ＤＭＥＭ、およびＷＥ等の公知の培地を挙げる
ことができる。また、培地には、ＦＢＳ（Sigma社
製）、Antibiotic-Antimycotic（GIBCO BRL社製）等の
抗生物質、ＴＧＦβ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ等の増殖因
子、ＢＭＰ、インシュリン、デキサメタゾン、プロリ
ン、ピルビン酸ナトリウム、グルコース、トランスフェ
リン、セリン、あるいはレチノイン酸等を適宜添加して
も良い。
定されず、培養する細胞に合わせて適宜選択することが
できる。例えば、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰ
Ｍ１，ｃＲＤＦ、ＥＲＤＦ、Ｆ１２、ＭＣＤＢ１３１、
Ｆ１２／ＤＭＥＭ、およびＷＥ等の公知の培地を挙げる
ことができる。また、培地には、ＦＢＳ（Sigma社
製）、Antibiotic-Antimycotic（GIBCO BRL社製）等の
抗生物質、ＴＧＦβ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ等の増殖因
子、ＢＭＰ、インシュリン、デキサメタゾン、プロリ
ン、ピルビン酸ナトリウム、グルコース、トランスフェ
リン、セリン、あるいはレチノイン酸等を適宜添加して
も良い。
【００１９】細胞は、前記培地に適当な播種密度で播種
して培養する。播種する細胞の数（播種密度）は細胞の
形態を維持して培養を効率よく行わせるため、用いる細
胞や容器に応じて適宜調整することが望ましい。たとえ
ば、軟骨細胞であれば、播種密度は１０2〜１０6cells
／ml程度であることが望ましい。
して培養する。播種する細胞の数（播種密度）は細胞の
形態を維持して培養を効率よく行わせるため、用いる細
胞や容器に応じて適宜調整することが望ましい。たとえ
ば、軟骨細胞であれば、播種密度は１０2〜１０6cells
／ml程度であることが望ましい。
【００２０】培養条件は、用いる細胞に合わせて適宜設
定するが、一般には３〜１０％ＣＯ2下、３０〜４０
℃、特に４〜６％ＣＯ2、３４〜３８℃の条件下で行う
ことが望ましい。培養期間は、目的とする三次元凝集塊
が形成される時間であれば特に限定されないが、少なく
とも０．５時間以上であるとよい。
定するが、一般には３〜１０％ＣＯ2下、３０〜４０
℃、特に４〜６％ＣＯ2、３４〜３８℃の条件下で行う
ことが望ましい。培養期間は、目的とする三次元凝集塊
が形成される時間であれば特に限定されないが、少なく
とも０．５時間以上であるとよい。
【００２１】１．４ 三次元凝集塊
本発明の方法に従って培養をすると、数時間で細胞の三
次元凝集塊（aggregates, スフェロイド）が形成されは
じめ、２４時間〜３６時間程度で数百μｍほどの大きな
三次元凝集塊を形成させることができる。なお、本明細
書中において、「三次元凝集塊」とは細胞が三次元的に
集まって形成する塊を意味する。
次元凝集塊（aggregates, スフェロイド）が形成されは
じめ、２４時間〜３６時間程度で数百μｍほどの大きな
三次元凝集塊を形成させることができる。なお、本明細
書中において、「三次元凝集塊」とは細胞が三次元的に
集まって形成する塊を意味する。
【００２２】こうして形成される三次元凝集塊を構成す
る細胞は、付着培養された細胞よりも分化が促進され、
正常なフェノタイプを維持する。すなわち、本発明の方
法によれば、分化を促進して、正常なフェノタイプを有
する細胞の三次元凝集塊を、短時間かつ大量に作製する
ことができる。
る細胞は、付着培養された細胞よりも分化が促進され、
正常なフェノタイプを維持する。すなわち、本発明の方
法によれば、分化を促進して、正常なフェノタイプを有
する細胞の三次元凝集塊を、短時間かつ大量に作製する
ことができる。
【００２３】２．細胞の分化を促進させる方法
本発明はまた、正常骨・軟骨細胞、または未分化幹細胞
の初代培養細胞を非接着性の容器内で浮遊培養すること
により、細胞の分化を促進させる方法を提供する。
の初代培養細胞を非接着性の容器内で浮遊培養すること
により、細胞の分化を促進させる方法を提供する。
【００２４】前述したように、生体から単離した骨・軟
骨細胞を培養担体に播種して付着培養すると、病変部位
のフェノタイプと同様の細胞に脱分化する。しかしなが
ら、本発明の方法によって形成された三次元凝集塊中で
は、細胞の分化が著しく促進される（換言すれば、脱分
化が抑制される）。したがって、本発明の方法によって
得られた三次元凝集塊は、組織再構築型のインプラント
の作製に適している。
骨細胞を培養担体に播種して付着培養すると、病変部位
のフェノタイプと同様の細胞に脱分化する。しかしなが
ら、本発明の方法によって形成された三次元凝集塊中で
は、細胞の分化が著しく促進される（換言すれば、脱分
化が抑制される）。したがって、本発明の方法によって
得られた三次元凝集塊は、組織再構築型のインプラント
の作製に適している。
【００２５】３．インプラントの作製方法
本発明はまた、本発明の培養方法によって形成された三
次元凝集塊を利用したインプラントの作製方法を提供す
る。本発明の方法によって形成される三次元凝集塊中で
は細胞の分化が促進され、正常なフェノタイプが維持さ
れる。しかも、従来になく、短時間かつ大量の三次元凝
集塊を得ることができる。
次元凝集塊を利用したインプラントの作製方法を提供す
る。本発明の方法によって形成される三次元凝集塊中で
は細胞の分化が促進され、正常なフェノタイプが維持さ
れる。しかも、従来になく、短時間かつ大量の三次元凝
集塊を得ることができる。
【００２６】したがって、本発明の培養方法を応用する
ことにより、効率的に組織再構築型のインプラントを作
製することができる。該インプラントは、本発明の方法
によって形成された三次元凝集塊のみから構成されるも
のであってもよいし、適当な生分解性材料と組み合わせ
て構成されるものであってもよい。
ことにより、効率的に組織再構築型のインプラントを作
製することができる。該インプラントは、本発明の方法
によって形成された三次元凝集塊のみから構成されるも
のであってもよいし、適当な生分解性材料と組み合わせ
て構成されるものであってもよい。
【００２７】後者の場合、用いられる生分解性材料とし
ては、例えば、ハイドロキシアパタイト、β-ＴＣＰ
（リン酸三カルシウム）、α−ＴＣＰ 等の多孔性セラ
ミックス、コラーゲン、ポリ乳酸、およびポリグリコー
ル酸、ならびにこれらの複合体等を挙げることができ
る。該生分解性材料は、インプラントの目的や適用部位
に応じて、適宜最適なものを選べばよく、例えば、強度
が必要とされる移植箇所については、ハイドロキシアパ
タイトが好ましく、強度が必要とされない移植箇所につ
いては、生体吸収性のβ−ＴＣＰ等が好ましい。これら
のインプラントの用途としては、例えば、人工軟骨、人工
関節、人工骨等の骨・軟骨代替用インプラント等の整形
外科領域での利用、あるいは人工歯根等の歯科用インプ
ラント等の歯科領域で利用を挙げることができる。
ては、例えば、ハイドロキシアパタイト、β-ＴＣＰ
（リン酸三カルシウム）、α−ＴＣＰ 等の多孔性セラ
ミックス、コラーゲン、ポリ乳酸、およびポリグリコー
ル酸、ならびにこれらの複合体等を挙げることができ
る。該生分解性材料は、インプラントの目的や適用部位
に応じて、適宜最適なものを選べばよく、例えば、強度
が必要とされる移植箇所については、ハイドロキシアパ
タイトが好ましく、強度が必要とされない移植箇所につ
いては、生体吸収性のβ−ＴＣＰ等が好ましい。これら
のインプラントの用途としては、例えば、人工軟骨、人工
関節、人工骨等の骨・軟骨代替用インプラント等の整形
外科領域での利用、あるいは人工歯根等の歯科用インプ
ラント等の歯科領域で利用を挙げることができる。
【００２８】また、インプラントの形態および形状は、
特に限定されず、スポンジ、メッシュ、不繊布状成形
物、ディスク状、フィルム状、棒状、粒子状、およびペ
ースト状等、任意の形態および形状を用いることができ
る。こうした形態や形状は、インプラントの目的に応じ
て適宜選択され、例えば、コラーゲンゲル等のゲル基材
に軟骨細胞からなる三次元凝集塊を埋包して患部に適用
するインプラントも可能である。特に、生体から取り出
した自己の細胞をin vitroで培養してインプラントを作
製すれば、それは限りなく生体に近いインプラントとし
て、再生医療のための有用な材料となりうる。
特に限定されず、スポンジ、メッシュ、不繊布状成形
物、ディスク状、フィルム状、棒状、粒子状、およびペ
ースト状等、任意の形態および形状を用いることができ
る。こうした形態や形状は、インプラントの目的に応じ
て適宜選択され、例えば、コラーゲンゲル等のゲル基材
に軟骨細胞からなる三次元凝集塊を埋包して患部に適用
するインプラントも可能である。特に、生体から取り出
した自己の細胞をin vitroで培養してインプラントを作
製すれば、それは限りなく生体に近いインプラントとし
て、再生医療のための有用な材料となりうる。
【００２９】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。実施例１：旋回培養による軟骨組織の構築 １．旋回培養 （試験方法）ウシ正常膝関節軟骨細胞を0.2％コラゲナ
ーゼ/F12培地（10％ウシ胎児血清を含む）で一晩抽出し
た後、組織培養用ディッシュ（ファルコン社製、625cm2
−スクエアディッシュ）に播種し、5％ＣＯ2、37℃にて
付着培養した。組織培養用ディッシュに軟骨細胞が付着
伸展した後、細胞の数を増やすため、さらに継代を行っ
た。十分な数になるまで細胞を増殖させた後、トリプシ
ンを用いて細胞を剥離回収した。
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。実施例１：旋回培養による軟骨組織の構築 １．旋回培養 （試験方法）ウシ正常膝関節軟骨細胞を0.2％コラゲナ
ーゼ/F12培地（10％ウシ胎児血清を含む）で一晩抽出し
た後、組織培養用ディッシュ（ファルコン社製、625cm2
−スクエアディッシュ）に播種し、5％ＣＯ2、37℃にて
付着培養した。組織培養用ディッシュに軟骨細胞が付着
伸展した後、細胞の数を増やすため、さらに継代を行っ
た。十分な数になるまで細胞を増殖させた後、トリプシ
ンを用いて細胞を剥離回収した。
【００３０】次いで、回収した軟骨細胞を1.5x107 cell
s/dishの濃度で非接着性の6-wells-プレート（コースタ
ー社製、Ultra Low Attachment Polystylene：直径35m
m，ポリスチレン製）に播種した。その後、プレートを
大腸菌培養用シェイカ（TAITEC社製、 NR-2）の上にの
せ、5％ＣＯ2、37℃の条件下、80rpmの速度で旋回培養
を行った。
s/dishの濃度で非接着性の6-wells-プレート（コースタ
ー社製、Ultra Low Attachment Polystylene：直径35m
m，ポリスチレン製）に播種した。その後、プレートを
大腸菌培養用シェイカ（TAITEC社製、 NR-2）の上にの
せ、5％ＣＯ2、37℃の条件下、80rpmの速度で旋回培養
を行った。
【００３１】（結 果）旋回培養開始後12時間でプレー
ト内に軟骨細胞の三次元凝集塊の形成が認められ（図
１）、24〜36時間後には数百μｍの直径を有する大量の
三次元凝集塊が形成された。
ト内に軟骨細胞の三次元凝集塊の形成が認められ（図
１）、24〜36時間後には数百μｍの直径を有する大量の
三次元凝集塊が形成された。
【００３２】２．タイプIコラーゲン遺伝子の発現
（試験方法）組織培養用ディッシュで付着（単層）培養
させた軟骨細胞と、旋回培養により三次元凝集塊を形成
させた軟骨細胞のＲＮＡをそれぞれIsogen（日本ジー
ン）を用いて抽出し、RT-PCR法により脱分化型の軟骨細
胞から分泌されることが知られているタイプIコラーゲ
ン遺伝子の発現をみた。なお、コントロールとしてGP3D
H（ハウスキーピング遺伝子）を用いた。
させた軟骨細胞と、旋回培養により三次元凝集塊を形成
させた軟骨細胞のＲＮＡをそれぞれIsogen（日本ジー
ン）を用いて抽出し、RT-PCR法により脱分化型の軟骨細
胞から分泌されることが知られているタイプIコラーゲ
ン遺伝子の発現をみた。なお、コントロールとしてGP3D
H（ハウスキーピング遺伝子）を用いた。
【００３３】（結 果）図２に示すよう、組織培養用の
ディッシュで付着培養した軟骨細胞（Monolayer）に比
べて、旋回培養により三次元凝集塊を形成した軟骨細胞
では、タイプIコラーゲン遺伝子の産生が著しく少なか
った（図２）。このことから、旋回培養を行った三次元
凝集塊中の細胞は、付着培養した細胞よりも分化が促進
されていることが確認された。
ディッシュで付着培養した軟骨細胞（Monolayer）に比
べて、旋回培養により三次元凝集塊を形成した軟骨細胞
では、タイプIコラーゲン遺伝子の産生が著しく少なか
った（図２）。このことから、旋回培養を行った三次元
凝集塊中の細胞は、付着培養した細胞よりも分化が促進
されていることが確認された。
【００３４】実施例２：非接着性プレートを利用した間
葉系幹細胞の旋回培養 成牛の四肢の骨髄から、常法に従い、間葉系幹細胞を調
製した。次いで、この間葉系細胞を組織培養用ディッシ
ュ（ファルコン社製、625cm2−スクエアディッシュ）で
5％ＣＯ2、37℃にて付着培養した後、トリプシン処理し
て剥離回収した。回収した細胞を、1.5x107 cells/dish
の濃度で非接着性の6-wells-プレート（コースター社
製、Ultra Low Attachment Polystylene：直径35mm，ポ
リスチレン製）に播種し、5％ＣＯ2、37℃の条件下、80
rpmの速度で旋回培養を行った。
葉系幹細胞の旋回培養 成牛の四肢の骨髄から、常法に従い、間葉系幹細胞を調
製した。次いで、この間葉系細胞を組織培養用ディッシ
ュ（ファルコン社製、625cm2−スクエアディッシュ）で
5％ＣＯ2、37℃にて付着培養した後、トリプシン処理し
て剥離回収した。回収した細胞を、1.5x107 cells/dish
の濃度で非接着性の6-wells-プレート（コースター社
製、Ultra Low Attachment Polystylene：直径35mm，ポ
リスチレン製）に播種し、5％ＣＯ2、37℃の条件下、80
rpmの速度で旋回培養を行った。
【００３５】（結 果）旋回培養開始後12時間でプレー
ト内に軟骨細胞の三次元凝集塊の形成が認められ（図
３）、24〜36時間には100〜500μｍ程度の直径を有する
三次元凝集塊が形成された。
ト内に軟骨細胞の三次元凝集塊の形成が認められ（図
３）、24〜36時間には100〜500μｍ程度の直径を有する
三次元凝集塊が形成された。
【００３６】
【発明の効果】本発明の方法によれば、細胞の分化が促
進され、フェノタイプが正常に維持された、正常骨・軟
骨細胞、または未分化幹細胞の初代培養細胞由来の三次
元凝集塊を短時間で大量に形成することができる。した
がって、本発明の培養方法を利用することにより、再生
医療の有用なツールである組織培養型インプラントを効
率的に作製することができる。
進され、フェノタイプが正常に維持された、正常骨・軟
骨細胞、または未分化幹細胞の初代培養細胞由来の三次
元凝集塊を短時間で大量に形成することができる。した
がって、本発明の培養方法を利用することにより、再生
医療の有用なツールである組織培養型インプラントを効
率的に作製することができる。
【図１】図１は、非接着性の容器内で旋回培養によって
軟骨細胞から形成された三次元凝集塊を示す。
軟骨細胞から形成された三次元凝集塊を示す。
【図２】図２は、付着培養した軟骨細胞（Monolayer）
と、旋回培養した軟骨細胞（Aggregates）における、タ
イプIコラーゲン遺伝子の発現を示す。（CN：タイプIコ
ラーゲン遺伝子 G3PDH：ハウスキーピング遺伝子）
と、旋回培養した軟骨細胞（Aggregates）における、タ
イプIコラーゲン遺伝子の発現を示す。（CN：タイプIコ
ラーゲン遺伝子 G3PDH：ハウスキーピング遺伝子）
【図３】図３は、非接着性の容器内で旋回培養によって
間葉系幹細胞から形成された三次元凝集塊を示す。
間葉系幹細胞から形成された三次元凝集塊を示す。
フロントページの続き
(72)発明者 酒井 康行
東京都目黒区駒場４−６−１ 東京大学生
産技術研究所 ４部内
(72)発明者 立石 哲也
茨城県つくば市東１−１−１ 独立行政法
人産業技術総 合研究所 つくばセンター
内
Ｆターム(参考） 4B065 AA90 AA93 AC20 BC01 BC26
CA44
4C081 AB04 BA13 BA14 BA15 BB08
BC01 CD34 DA01 EA01
Claims (7)
- 【請求項１】 正常骨・軟骨細胞、または未分化幹細胞
の初代培養細胞を非接着性の容器内で浮遊培養すること
により、細胞の三次元凝集塊を作製する方法。 - 【請求項２】 浮遊培養が細胞の凝集を高めるような流
れの存在する系での浮遊培養である、請求項１記載の方
法。 - 【請求項３】 細胞の凝集を高めるような流れの存在す
る系での浮遊培養が旋回培養である、請求項２記載の方
法。 - 【請求項４】 正常骨・軟骨細胞または未分化幹細胞
が、生体から単離された細胞である、請求項１〜３のい
ずれか１項に記載の方法。 - 【請求項５】 三次元凝集塊中の細胞が、付着培養され
た細胞よりも分化が促進されていることを特徴とする、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の方
法によって作製された三次元凝集塊を用いて、インプラ
ントを作製する方法。 - 【請求項７】 正常骨・軟骨細胞、または未分化幹細胞
の初代培養細胞を非接着性の容器内で浮遊培養すること
により、細胞の分化を促進させる方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002115282A JP2003304866A (ja) | 2002-04-17 | 2002-04-17 | 三次元凝集塊形成による細胞の分化制御 |
| AU2003235200A AU2003235200A1 (en) | 2002-04-17 | 2003-04-17 | Control of cell differentiation through formation of three-dimensional aggregate |
| PCT/JP2003/004900 WO2003087350A1 (fr) | 2002-04-17 | 2003-04-17 | Regulation de la differentiation cellulaire par formation d'agregat tridimensionnel |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002115282A JP2003304866A (ja) | 2002-04-17 | 2002-04-17 | 三次元凝集塊形成による細胞の分化制御 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003304866A true JP2003304866A (ja) | 2003-10-28 |
Family
ID=29243420
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002115282A Pending JP2003304866A (ja) | 2002-04-17 | 2002-04-17 | 三次元凝集塊形成による細胞の分化制御 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003304866A (ja) |
| AU (1) | AU2003235200A1 (ja) |
| WO (1) | WO2003087350A1 (ja) |
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005011765A1 (ja) * | 2003-07-31 | 2005-02-10 | Yukihide Iwamoto | 人工関節の作製方法 |
| WO2006003802A1 (ja) * | 2004-06-30 | 2006-01-12 | Nihon University | Ｅｓ細胞培養用アガロースプレート |
| WO2007004469A1 (ja) * | 2005-07-04 | 2007-01-11 | Osaka University | 前脂肪細胞の成熟脂肪細胞への分化培養方法、ならびにその分化過程に影響する物質のスクリーニング |
| JP2007301387A (ja) * | 2007-07-17 | 2007-11-22 | Pg Research:Kk | 人工軟骨組織の製造方法 |
| JP2009077708A (ja) * | 2007-09-07 | 2009-04-16 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 浮遊培養システム及び浮遊培養方法 |
| WO2009081503A1 (ja) * | 2007-12-21 | 2009-07-02 | Yukihide Iwamoto | 細胞移植用器具 |
| US7923244B2 (en) | 2005-08-02 | 2011-04-12 | Pg Research Co., Ltd. | Artificial cartilage tissue and production method thereof |
| JP2016524967A (ja) * | 2013-07-17 | 2016-08-22 | アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル | 組織再生のための微細組織を用いて機能化された三次元スキャフォールド |
| US10010649B2 (en) | 2007-05-04 | 2018-07-03 | Ascendia Ab | Method and means for culturing osteoblastic cells |
| WO2019131940A1 (ja) | 2017-12-28 | 2019-07-04 | 株式会社カネカ | 多能性幹細胞凝集抑制剤 |
| WO2019131942A1 (ja) | 2017-12-28 | 2019-07-04 | 株式会社カネカ | 細胞凝集促進剤 |
| WO2019131941A1 (ja) | 2017-12-28 | 2019-07-04 | 株式会社カネカ | 細胞凝集抑制剤 |
| JP2019118279A (ja) * | 2017-12-28 | 2019-07-22 | 株式会社カネカ | 細胞凝集促進剤 |
| WO2020013345A1 (ja) * | 2018-07-11 | 2020-01-16 | 学校法人松本歯科大学 | 親水性の違いを利用したスフェロイドの製造方法 |
| WO2020184350A1 (ja) | 2019-03-08 | 2020-09-17 | 株式会社カネカ | 多能性幹細胞の大量培養 |
-
2002
- 2002-04-17 JP JP2002115282A patent/JP2003304866A/ja active Pending
-
2003
- 2003-04-17 AU AU2003235200A patent/AU2003235200A1/en not_active Abandoned
- 2003-04-17 WO PCT/JP2003/004900 patent/WO2003087350A1/ja active Application Filing
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| US8246570B2 (en) | 2007-12-21 | 2012-08-21 | Japan Medical Materials Corporation | Device for cell transplantation |
| KR101450943B1 (ko) | 2007-12-21 | 2014-10-21 | 쿄세라 메디칼 가부시키가이샤 | 세포 이식용 기구 |
| JP2016524967A (ja) * | 2013-07-17 | 2016-08-22 | アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル | 組織再生のための微細組織を用いて機能化された三次元スキャフォールド |
| WO2019131940A1 (ja) | 2017-12-28 | 2019-07-04 | 株式会社カネカ | 多能性幹細胞凝集抑制剤 |
| WO2019131942A1 (ja) | 2017-12-28 | 2019-07-04 | 株式会社カネカ | 細胞凝集促進剤 |
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| JP7398114B2 (ja) | 2018-07-11 | 2023-12-14 | 学校法人松本歯科大学 | 親水性の違いを利用したスフェロイドの製造方法 |
| WO2020184350A1 (ja) | 2019-03-08 | 2020-09-17 | 株式会社カネカ | 多能性幹細胞の大量培養 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2003235200A1 (en) | 2003-10-27 |
| WO2003087350A1 (fr) | 2003-10-23 |
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