JP2019118279A - 細胞凝集促進剤 - Google Patents
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Abstract
Description
非特許文献3の方法は大規模化が困難であることや、培地の交換が困難である等の問題があった。
非特許文献4の方法では培養時の培地の移動が少ないため酸素や栄養成分が細胞凝集塊に供給され難いという問題があった。
特許文献1では細胞塊の大きさを適度な大きさに制御するための手段が開示されていないという問題があった。
特許文献2では細胞塊同士の接着を防ぐための手段として培地に水溶性高分子を添加して粘性を高めることが記載されている。このため非特許文献3と同様に、酸素や栄養成分が細胞凝集塊に供給され難いという問題があった。
(2)前記薬剤の濃度が0.1μg/mL以上30.0mg/mL以下である、(1)に記載の細胞凝集促進剤。
(3)前記薬剤がミオシン阻害剤である、(1)又は(2)に記載の細胞凝集促進剤。
(4)前記ミオシン阻害剤がブレビスタチンである、(3)に記載の細胞凝集促進剤。
(5)前記細胞が幹細胞である、(1)から(4)のいずれかに記載の細胞凝集促進剤。
(7)前記薬剤の培地中における濃度が2.9ng/mL以上3.0mg/mL以下である、(6)に記載の製造方法。
(8)前記薬剤がミオシン阻害剤である、(6)又は(7)に記載の製造方法。
(9)前記ミオシン阻害剤がブレビスタチンである、(8)に記載の製造方法。
(10)前記細胞が幹細胞である、(6)から(9)のいずれかに記載の製造方法。
(11)(6)から(10)のいずれかに記載の製造方法により得られた細胞凝集塊。
(13)前記ミオシンシグナル伝達経路におけるシグナル伝達因子の活性を阻害又は抑制する薬剤がミオシン阻害剤である、(12)に記載の方法。
(14)前記ミオシンシグナル伝達経路におけるシグナル伝達因子の活性を促進又は増幅する薬剤がミオシン活性化剤である、(12)又は(13)に記載の方法。
(15)前記細胞が幹細胞である、(12)から(14)のいずれかに記載の方法。
(17)前記ミオシンシグナル伝達経路におけるシグナル伝達因子の活性を阻害又は抑制する薬剤がミオシン阻害剤である、(16)に記載の細胞凝集調節キット。
(18)前記ミオシンシグナル伝達経路におけるシグナル伝達因子の活性を促進又は増幅する薬剤が、ミオシン活性化剤である、(16)又は(17)に記載の細胞凝集調節キット。
(19)さらに培地を含む、(16)から(18)のいずれかに記載の細胞凝集調節キット。
(21)前記薬剤の濃度が2.9ng/mL以上3.0mg/mL以下である、(20)に記載の細胞培養培地。
(22)前記薬剤がミオシン阻害剤である、(20)又は(21)に記載の細胞培養培地。
(23)さらに増殖因子を含む、(20)から(22)のいずれかに記載の細胞培養培地。
(24)幹細胞の培養に用いるための、(20)から(23)のいずれかに記載の細胞培養培地。
(25)細胞凝集塊を作製するための、(20)から(24)のいずれかに記載の細胞培養培地。
(26)培地と、ミオシンシグナル伝達経路におけるシグナル伝達因子の活性を促進又は増幅する薬剤とを含む、細胞培養培地。
(27)前記薬剤の濃度が2.9ng/mL以上3.0mg/mL以下である、(26)に記載の細胞培養培地。
(28)前記薬剤がミオシン活性化剤である、(26)又は(27)に記載の細胞培養培地。
(29)さらに増殖因子を含む、(26)から(28)のいずれかに記載の細胞培養培地。
(30)幹細胞の培養に用いるための、(26)から(29)のいずれかに記載の細胞培養培地。
(31)細胞凝集塊を作製するための、(26)から(30)のいずれかに記載の細胞培養培地。
前記培地がミオシンシグナル伝達経路におけるシグナル伝達因子の活性を阻害又は抑制する薬剤を含む、前記方法。
(33)前記薬剤の培地中における濃度が2.9ng/mL以上3.0mg/mL以下である、(32)に記載の方法。
(34)前記薬剤がミオシン阻害剤である、(32)又は(33)に記載の方法。
(35)前記ミオシン阻害剤がブレビスタチンである、(34)に記載の方法。
(36)前記細胞が幹細胞である、(32)から(35)のいずれかに記載の方法。
(38)前記薬剤の濃度が0.2μg/mL以上30.0mg/mL以下である、(37)に記載の細胞凝集抑制剤。
(39)前記薬剤がミオシン活性化剤である、(37)又は(38)に記載の細胞凝集抑制剤。
(40)前記ミオシン活性化剤がオメカンチブ・メカルビルである、(39)に記載の細胞凝集抑制剤。
(41)前記細胞が幹細胞である、(37)から(40)のいずれかに記載の細胞凝集抑制剤。
(43)前記薬剤の培地中における濃度が2.9ng/mL以上3.0mg/mL以下である、(42)に記載の方法。
(44)前記薬剤がミオシン活性化剤である、(42)又は(43)に記載の方法。
(45)前記ミオシン活性化剤がオメカンチブ・メカルビルである、(44)に記載の方法。
(46)前記細胞が幹細胞である、(42)から(45)のいずれかに記載の方法。
(48)前記薬剤の濃度が2.9ng/mL以上3.0mg/mL以下である、(47)に記載の細胞培養組成物。
(49)前記薬剤がミオシン活性化剤である、(47)又は(48)に記載の細胞培養組成物。
(50)前記ミオシン活性化剤がオメカンチブ・メカルビルである、(49)に記載の細胞培養組成物。
(51)さらに増殖因子を含む、(47)から(50)のいずれかに記載の細胞培養組成物。
(52)前記細胞が幹細胞である、(47)から(51)のいずれかに記載の細胞培養組成物。
(53)前記細胞の形態が細胞凝集塊である、(47)から(52)のいずれかに記載の細胞培養組成物。
(55)前記薬剤の濃度が2.9ng/mL以上3.0mg/mL以下である、(54)に記載の細胞培養組成物。
(56)前記薬剤がミオシン阻害剤である、(54)又は(55)に記載の細胞培養組成物。
(57)さらに増殖因子を含む、(54)から(56)のいずれかに記載の細胞培養組成物。
(58)前記細胞が幹細胞である、(54)から(57)のいずれかに記載の細胞培養組成物。
(59)前記細胞の形態が細胞凝集塊である、(54)から(58)のいずれかに記載の細胞培養組成物。
本発明の細胞凝集塊製造方法によれば、浮遊培養で効率的に細胞凝集塊を製造することができる。
本発明の細胞凝集調節方法によれば、浮遊培養中の細胞凝集の促進及び抑制を制御して、細胞凝集塊を所望の大きさに調製することができる。
本発明の細胞凝集調節キットによれば、それを使用することで、浮遊培養中の細胞の凝集を制御し、所望の大きさの細胞凝集塊を容易に調製することができる。
1−1.概要
本発明の第一の態様は、細胞凝集促進剤である。本態様の細胞凝集促進剤は、浮遊培養用の薬剤であって、細胞内のミオシンシグナル伝達経路におけるシグナル伝達因子の活性を阻害又は抑制する薬剤を有効成分として含むことを特徴とする。本態様の細胞凝集促進剤により、浮遊培養中の細胞における凝集を促進させ、細胞凝集塊を容易に製造することができる。
1−2.用語の定義
本明細書で使用する以下の用語について定義する。なお、特に断りのない限り、本項に記載の以下の定義は、本発明の他の態様においても共通する。
本明細書において発明の対象となる「細胞」は、浮遊培養が可能な接着性細胞である。「接着性細胞」とは、細胞間接着、又は細胞−基質間接着が可能な細胞をいい、この接着性細胞が細胞又は基質と接着することを「細胞接着」という。本明細書では、特に断りのない限り、細胞接着とは細胞間接着を指すものとする。
本明細書において「細胞凝集」とは、複数の細胞が三次元的に集合して、集塊を形成することをいう。異なる細胞による凝集と同一細胞による凝集があるが、本明細書ではいずれの凝集も包含する。同一細胞による凝集は、1つの細胞の増殖によって集塊が形成される場合も含む。細胞凝集の機構としては、限定はしないが、膜タンパク質や細胞膜の細胞間での非特異的な吸着、細胞表面のカドヘリンを介した細胞間の接着等が挙げられる。
本明細書において「浮遊培養」とは、細胞培養方法の一つで、培地中で細胞を浮遊状態で増殖させることをいう。「浮遊培養法」は、細胞を浮遊培養する方法であって、この方法での細胞は、培養液中で凝集した細胞塊で存在する。限定はしないが、本明細書では、細胞を三次元的に培養して大量生産するため方法として使用される。浮遊培養法に対する他の培養方法として、接着培養法がある。「接着培養法」は、細胞を接着培養する方法である。「接着培養」とは、細胞を培養容器等の外部マトリクス等に接着させて、原則単層で増殖させることをいう。本発明で細胞凝集塊を製造し、またその大きさを調節するために、対象となる培養法は、浮遊培養法である。ただし、維持培養で使用される培養法は、この限りではない。なお、前述の接着性細胞は、通常、接着培養のみならず、浮遊培養での培養も可能である。
本発明で用いる培地は、好ましくは血清を含まない培地、すなわち無血清培地である。
本明細書において「ミオシンシグナル伝達経路」とは、ミオシンを起点として細胞間接着の抑制に機能するシグナル伝達経路をいう。
本態様の細胞凝集促進剤は、ミオシンシグナル伝達因子の活性を阻害又は抑制する薬剤を有効成分として含むことを特徴とする。
細胞凝集促進剤の形態は、液剤、又は固形剤(顆粒剤、散剤、粉剤を含む)のいずれであってもよい。
細胞凝集促進剤の適用形態は特に限定されない。例えば、浮遊培養に用いる培地の形態であってもよいし、浮遊培養用の培地の調製時に配合される添加物の形態であってもよい。
細胞凝集促進剤の適用対象は、浮遊培養法により培養する細胞である。
本発明の細胞凝集促進剤によれば、浮遊培養系において細胞の凝集を促進し、また略均一な大きさの細胞凝集塊を形成させることができる。それによって、限られた空間の中で、大量の細胞を効率的に生産することが可能となる。また、本発明の細胞凝集促進剤を用いた幹細胞の浮遊培養では、幹細胞の未分化性を維持することができる。
2−1.概要
本発明の第二の態様は細胞凝集促進方法である。本発明の細胞凝集促進方法は、第一態様の細胞凝集促進剤又はその有効成分を含む培地で細胞を浮遊培養することによって、培養液中の細胞の凝集を促進させる方法である。本発明の細胞凝集促進方法によれば、浮遊培養系において細胞の凝集を適度に促進することにより、細胞凝集塊の生産に利用することができる。
本態様の方法は、浮遊培養工程を必須の工程として、また、維持培養工程並びに回収工程を選択工程として含む。以下、それぞれの工程について、説明をする。
「維持培養工程」は、浮遊培養工程前の細胞集団、又は浮遊培養工程後、若しくはその後の回収工程後に得られる細胞凝集塊を、未分化性を維持した状態で細胞を増殖させるために培養する工程である。維持培養は、当該分野で既知の動物細胞培養法を利用することができる。例えば、細胞を容器、担体等培養基材に接着させながら培養する接着培養であってもよいし、細胞を培地中で浮遊させながら培養する浮遊培養であってもよい。
以下、限定はしないが、本工程をはじめ、後述する浮遊培養工程で用いる動物細胞培養法について例示し、説明をする。
本工程で使用する細胞は、浮遊培養において細胞凝集が可能な細胞である。前述の「1−2.用語の定義」における「培養及び培地」の項で記載したように、動物細胞が好ましく、ヒト細胞はより好ましい。また、細胞の種類は、幹細胞が好ましく、iPS細胞やES細胞のような多能性幹細胞は特に好ましい。
培養に用いる培養容器は、容器内面への細胞の接着性が低い容器が好ましい。容器内面への細胞の接着性が低い容器としては、例えば生体適合性がある物質で親水性表面処理されているようなプレートが挙げられる。例えば、NunclonTM Sphera(サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社)を培養容器として使用できる。
培養容器の形状は特に限定されないが、例えば、ディッシュ状、フラスコ状、ウェル状、バッグ状、スピナーフラスコ状等の形状の培養容器が挙げられる。
使用する培養容器の容量は適宜選択することができ特に限定されないが、培地を収容する部分の底面を平面視したときの面積の下限が、0.32cm2以上、0.65cm2以上、0.65cm2以上、1.9cm2以上、3.0cm2以上、3.5cm2以上、9.0cm2以上、又は9.6cm2以上で、上限が、1000cm2以下、500cm2以下、300cm2以下、150cm2以下、75cm2以下、55cm2以下、25cm2以下、21cm2以下、9.6cm2以下、又は3.5cm2以下であることが好ましい。
本工程で使用する培地は、ミオシンシグナル伝達経路に影響を及ぼし得る薬剤を含まない培地である。原則として液体培地を使用する。
培地や培養液の量は、使用する培養容器によって適宜調整すればよい。例えば12ウェルプレート(平面視でのウェル底面の面積が1ウェルあたり3.5cm2)を使用する場合は、1ウェルあたりの量を0.5mL以上、1.5mL以下、好ましくは1.3mLとすることができる。また、6ウェルプレート(平面視でのウェル底面の面積が1ウェルあたり9.6cm2)を使用する場合には、1ウェルあたりの量を下限は1.5mL以上、2mL以上、又は3mL以上とすることができ、また上限は6.0mL以下、5mL以下、4mL以下とすることができる。さらに、125mL三角フラスコ(容量が125mLの三角フラスコ)を使用する場合は、容器当たりの量を下限は10mL以上、15mL以上、20mL以上、25mL以上、20mL以上、25mL以上、又は30mL以上とすることができ、また上限は50mL以下、45mL以下、又は40mL以下とすることができる。また、容量が500mLの三角フラスコを使用する場合は、容器当たりの量を下限は100mL以上、105mL以上、110mL以上、115mL以上、又は120mL以上とすることができ、また上限は150mL以下、145mL以下、140mL以下、135mL以下、130mL以下、又は125mL以下とすることができる。さらに、容量が1000mLの三角フラスコを使用する場合は、容器当たりの量を下限は250mL以上、260mL以上、270mL以上、280mL以上、又は290mL以上とすることができ、また上限は350mL以下、340mL以下、330mL以下、320mL以下、又は310mL以下とすることができる。さらに、例えば容量が2Lのディスポーザブル培養バッグを使用する場合は、1バッグ当たりの量を下限は100ML以上、200mL以上、300mL以上、400mL以上、500mL以上、600mL以上、700mL以上、800mL以上、900mL以上、又は1000mL以上とすることができ、上限は2000mL以下、1900mL以下、1800mL以下、1700mL以下、1600mL以下、1500mL以下、1400mL以下、1300mL以下、1200mL以下、又は1100mL以下とすることができる。また、容量が10Lのディスポーザブル培養バッグを使用する場合は、1バッグ当たりの量を下限は500mL以上、1L以上、2L以上、3L以上、4L以上、又は5L以上とすることができ、上限は10L以下、9L以下、8L以下、7L以下、又は6L以下とすることができる。後述する第三態様の細胞凝集塊製造方法等では、培地又は培養液量を前記範囲とすることで、適切なサイズの細胞凝集塊を製造することが容易となるため好ましい。
培養に際して、新たな培地に播種する細胞の密度(播種密度)は、培養時間や培養後の細胞状態、培養後に必要な細胞数を勘案して適宜調整することができる。限定はしないが、通常、下限は0.01×105 cells/mL以上、0.1×105 cells/mL以上、又は1×105 cells/mL以上、そして、上限は20×105 cells/mL以下、又は10×105 cells/mL以下の範囲にあればよい。後述する第三態様の細胞凝集塊製造方法等では、播種密度をこの範囲にしたときに、適切な大きさの細胞凝集塊が形成され易いため好ましい。例えば、0.1×105個細胞/mL、0.2×105個細胞/mL、0.3×105個細胞/mL、0.4×105個細胞/mL、0.5×105個細胞/mL、0.6×105個細胞/mL、0.7×105個細胞/mL、0.8×105個細胞/mL、0.9×105個細胞/mL、1×105個細胞/mL、1.5×105個細胞/mL、2×105個細胞/mL、3×105個細胞/mL、4×105個細胞/mL、5×105個細胞/mL、6×105個細胞/ml、7×105個細胞/mL、8×105個細胞/mL、9×105個細胞/mL、10×105個細胞/mLでもよい。
培養温度、時間、CO2濃度等の培養条件は特に限定しない。当該分野における常法の範囲で行えばよい。例えば培養温度は下限が20℃以上、又は35℃以上、そして上限が45℃以下、又は40℃以下であればよいが、好ましくは37℃である。また、培養時間は下限が0.5時間以上又は6時間以上、そして上限が7日間以下、72時間以下、又は48時間以下であればよいが、好ましくは12時間以上24時間以下である。培養時のCO2濃度は、下限が4%以上、又は4.5%以上、そして上限が10%以下、又は5.5%以下であればよいが、好ましくは5%である。また、適当な頻度で培地交換を行うことができる。培地交換の頻度は培養する細胞種によって異なるが、例えば、5日に1回以上、4日に1回以上、3日に1回以上、2日に1回以上、1日に1回以上で行えばよい。培地交換は、回収工程と同様の方法で細胞を回収した後、新鮮な培地を添加し、穏やかに細胞凝集塊を分散させた後、再度培養すればよい。
培養中の培地の流動状態は問わない。静置培養でもよいし、流動培養でもよいが、好ましくは流動培養である。
本工程で細胞の数をどこまで増やすか、また細胞の状態をどこに合わせるかについては、培養する細胞の種類、細胞凝集の目的、培地の種類や培養条件に応じて適宜定めればよい。
本工程後は、常法により培養液を廃棄し、細胞を回収する。この時、細胞は、剥離又は分散処理によって単一の細胞として回収することが好ましい。具体的な方法については、後述の回収工程で詳述する。回収した細胞は、そのまま、又は必要に応じてバッファ(PBSバッファを含む)、生食、又は培地(次の工程で使用する培地か基礎培地が好ましい)で洗浄後、次の工程に供すればよい。
「浮遊培養工程」は、第一態様に記載の細胞凝集促進剤又はその有効成分であるミオシンシグナル伝達因子阻害剤を含む培地中で細胞を浮遊培養する、本発明で必須の工程である。
本工程での細胞培養方法は、基本的に前述の「2−2−1.維持培養工程」に記載の培養方法に準ずる。したがって、ここでは維持培養工程に既述の方法と共通する説明については省略し、本工程に特徴的な点についてのみ詳述する。
本工程で使用する細胞は、限定はしないが、維持培養工程後に調製された細胞が好ましい。細胞の種類も、維持培養工程に記載のように、幹細胞が好ましく、iPS細胞やES細胞のような多能性幹細胞は特に好ましい。また培地に播種する際の細胞の状態は、単一細胞の状態であることが好ましい。
本工程は、ミオシンシグナル伝達因子阻害剤を含む培地で培養することを最大の特徴とし、この点において、維持培養工程で使用する培地と相違する。培地の種類は、ミオシンシグナル伝達因子阻害剤を含み、かつ細胞を増殖及び/又は維持できる培地であれば、限定はしない。
本工程では、浮遊培養を行う。したがって、培養方法は、培地を流動する流動培養が好ましい。ミオシンシグナル伝達因子阻害剤を含む培地で目的の細胞を浮遊培養することによって、その細胞の凝集を促進することができる。
「回収工程」は、維持培養工程又は浮遊培養工程後の培養液から培養した細胞を回収する工程で、本発明の方法における選択工程である。
本明細書において「(細胞の)回収」とは、培養液と細胞とを分離して細胞を取得することをいう。細胞の回収方法は、当該分野の細胞培養法で使用される常法に従えばよく、特に限定はしない。細胞培養方法は、一般に浮遊培養法と接着培養法に大別できる。以下、それぞれの培養方法後の細胞の回収方法について説明をする。
浮遊培養法で培養した場合、細胞は培養液中に浮遊した状態で存在する。したがって、細胞の回収は、静置状態又は遠心分離により上清の液体成分を除去することで達成できる。また、濾過フィルターや中空糸分離膜等を用いて回収することもできる。静置状態で液体成分を除去する場合、培養液の入った容器を静置状態5分程度置き、沈降した細胞や細胞凝集塊を残して上清を除去すればよい。また遠心分離は、遠心力によって細胞がダメージを受けない回転速度と処理時間で行えばよい。例えば、回転速度の下限は、細胞を沈降できれば特に限定はされないが、例えば500rpm以上、800rpm以上、又は1000rpm以上であればよい。一方、上限は細胞が遠心力によるダメージを受けない、又は受けにくい速度であればよく、例えば1400rpm以下、1500rpm以下、又は1600rpm以下であればよい。また処理時間の下限は、上記回転速度により細胞を沈降できる時間であれば特に限定はされないが、例えば30秒以上、1分以上、3分以上、又は5分以上であればよい。また、上限は、上記回転により細胞がダメージを受けない、又は受けにくい時間であればよく、例えば30秒以下、6分以下、8分以下、又は10分以下であればよい。濾過フィルターで液体成分を除去する場合、例えば、メッシュフィルター、不織布や市販のセルストレーナーに培養液を通して濾液を除去し、フィルターに残った細胞凝集塊を回収すればよい。また、中空糸分離膜で液体成分を除去する場合、例えば、細胞濃縮洗浄システム(カネカ社)のような中空糸分離膜を備えた装置を用いて培養液と細胞を分離し、回収すればよい。
接着培養法で培養した場合、培養後、多くの細胞は培養容器や培養担体等の外部マトリクスに接着した状態で存在する。したがって、培養容器から培養液を除去するには、培養後の容器を静かに傾けて液体成分を流し出せばよい。外部マトリクスに接着した細胞が培養容器内に残るため、培養液と細胞を容易に分離することができる。
本明細書において「単一細胞化」とは、単層細胞片や細胞凝集塊等のように複数の細胞が互いに接着又は凝集した細胞集合体を分散させて、単一の遊離した細胞状態にすることをいう。
3−1.概要
本発明の第三の態様は、細胞凝集塊製造方法、及びその方法で得られる細胞凝集塊である。本発明の細胞凝集塊製造方法は、第二態様の細胞凝集促進方法を用いて、生産物として細胞凝集塊を得る方法である。本製造方法によれば、効率的に細胞凝集塊を製造することができる。
本態様の細胞凝集塊製造方法における基本工程は、第二態様の細胞凝集促進方法に準ずる。すなわち、必須の工程として浮遊培養工程を、また選択工程として維持培養工程、回収工程、及び維持培養工程を含む。各工程の説明は、前述の通りである。
本態様の細胞凝集塊製造方法により、細胞凝集塊を製造することができる。
本態様の細胞凝集塊製造方法により製造される個々の細胞凝集塊のサイズは、特に限定されないが、顕微鏡で観察したとき、観察像での最大幅のサイズの下限が50μm以上、60μm以上、70μm以上、80μm以上、90μm以上、又は100μm以上であればよい。一方、その上限は300μm以下、400μm以下、500μm以下、600μm以下、700μm以下、800μm以下、900μm以下、又は1000μm以下であればよい。この範囲の細胞凝集塊は、内部の細胞にも酸素や栄養成分が供給され易く細胞の増殖環境として好ましいからである。本態様の細胞凝集塊製造方法により製造される細胞凝集塊の集団のうち、重量基準で下限が30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、98%以上、又は100%が上記のサイズ範囲内の細胞凝集塊であることが好ましい。
本態様の細胞凝集塊製造方法によれば、浮遊培養において、細胞凝集塊を効率的に製造し、また死細胞を減少することができる。
4−1.概要
本発明の第四の態様は、細胞凝集抑制剤である。本態様の細胞凝集抑制剤は、浮遊培養用の薬剤であって、第一態様の細胞凝集促進剤とは逆に、細胞内のミオシンシグナル伝達経路におけるシグナル伝達因子の活性を促進又は増幅する薬剤を有効成分として含むことを特徴とする。本態様の細胞凝集抑制剤により、浮遊培養中の細胞における凝集を抑制し、細胞凝集塊の形成を阻害又は抑制することができる。
本態様の細胞凝集抑制剤の基本構成は、有効成分を除いて、そのほとんどが第一態様の細胞凝集促進剤と同じである。したがって、ここでは本態様の細胞凝集抑制剤に特異的な構成についてのみ詳述し、他の重複する構成の説明については省略する。
本態様の細胞凝集抑制剤によれば、浮遊培養系において細胞間の接着を抑制することができ、細胞同士の過度な凝集を抑制することで細胞凝集塊作製後の成長を妨げないようにすることができる。また、本発明の細胞凝集抑制剤を用いた幹細胞の浮遊培養では、幹細胞の未分化性を維持することができる。
5−1.概要
本発明の第五の態様は細胞凝集抑制方法である。本発明の細胞凝集抑制方法は、第四態様の細胞凝集抑制剤又はその有効成分を含む培地で細胞を浮遊培養することによって、培養液中の細胞の凝集を抑制する方法である。本発明の細胞凝集抑制方法によれば、浮遊培養系において細胞の凝集を抑制することができる。
本態様の方法の基本工程は、第二態様の細胞凝集促進方法に準ずる。すなわち浮遊培養工程を必須の工程として、また前培養工程、回収工程、及び維持培養工程を選択工程として含む。ただし、本態様の細胞凝集抑制方法と第二態様の細胞凝集促進方法とでは、浮遊培養工程が異なる。したがって、ここでは浮遊培養工程についてのみ詳述し、他の工程の説明ついては省略する。
本態様の「浮遊培養工程」に関しても使用する細胞、培養方法、及び細胞単一化については、第二態様の細胞凝集促進方法における浮遊培養工程と同様に行えばよい。一方、本工程で使用する培地は、第二態様の浮遊培養工程で使用する培地と異なる。つまり、本態様の浮遊培養工程では、第四態様に記載の細胞凝集抑制剤又はその有効成分であるミオシンシグナル伝達因子促進剤を含む培地を使用する。したがって、ここでは本態様の浮遊培養工程に特異的な培地の組成についてのみ詳述し、第二態様の浮遊培養工程と重複する部分の説明については省略する。
第四態様に細胞凝集抑制方法では、第四態様に記載の細胞凝集抑制剤又はその有効成分であるミオシンシグナル伝達因子促進剤を含む培地中で細胞を浮遊培養することを特徴とする。培地の種類は、ミオシンシグナル伝達因子促進剤を含み、かつ細胞を増殖及び/又は維持できる培地であれば、限定はしない。
本態様の細胞凝集抑制方法によれば、浮遊培養系において細胞の凝集を適度に抑制することにより、細胞凝集塊の過度な成長を抑制することができる。
6−1.概要
本発明の第六の態様は細胞凝集調節方法である。本発明の細胞凝集調節方法は、ミオシンシグナル伝達因子阻害剤及びミオシンシグナル伝達因子促進剤を含む培地で細胞を浮遊培養し、その細胞のミオシンシグナル伝達経路における活性を阻害又は抑制、又は促進又は増幅することによって、培地中で形成される細胞凝集を制御し、またそれにより細胞凝集塊を適切な又は所望のサイズに調節することができる。
本態様の細胞凝集調節方法は、必須の工程としてシグナル伝達因子阻害工程及びシグナル伝達因子促進工程を、また選択工程として維持培養工程、及び回収工程を含む。このうち選択工程は、第二態様と同様である。したがって、ここでは本態様の細胞凝集調節方法に特異的な工程であるシグナル伝達因子阻害工程及びシグナル伝達因子促進工程についてのみ詳述し、第二態様と重複する工程の説明については省略する。
「シグナル伝達因子阻害工程」は、ミオシンシグナル伝達因子阻害剤を含む培地中で細胞を浮遊させながら培養する工程である。本工程では、ミオシンシグナル伝達因子阻害剤によってミオシンシグナル伝達因子の活性が阻害又は抑制され、それによりミオシンシグナル伝達経路が阻害される。その結果、細胞凝集が促進される。
「シグナル伝達因子促進工程」は、ミオシンシグナル伝達因子促進剤を含む培地中で細胞を浮遊させながら培養する工程である。本工程では、ミオシンシグナル伝達因子促進剤によってミオシンシグナル伝達因子の活性が促進又は増幅され、それによりミオシンシグナル伝達経路が促進される。その結果、細胞凝集が抑制される。
本態様の細胞凝集調節方法では、維持培養工程が最先で行われ、シグナル伝達因子阻害工程又はシグナル伝達因子促進工程がそれに続く。シグナル伝達因子阻害工程又はシグナル伝達因子促進工程は、いずれか一方を先に行うこともできるし、2つの工程を同時に行うこともできる。限定はしないが、シグナル伝達因子阻害工程を先に行うか、2つの工程を同時に行うのが好ましい。また、シグナル伝達因子阻害工程後、及び/又はシグナル伝達因子促進工程後には、回収工程及び/又は維持培養工程を行うこともできる。
本態様の細胞凝集調節方法によれば、細胞凝集を促進又は抑制することで、細胞凝集を制御し、それによって細胞凝集塊のサイズを適切なサイズに調節することができる。
7−1.概要
本発明の第七の態様は、細胞培養培地である。本態様の細胞培養培地を使用すれば、培地中で細胞凝集塊の形成又は解除を制御することができる。
本態様の細胞培養培地には、細胞凝集促進用培地、及び細胞凝集阻害培地が含まれる。目的に応じてそれぞれの培地を使用すればよい。以下、各培地の構成について説明をする。
「細胞凝集促進培地」は、細胞凝集を促進する浮遊培養用の細胞培養培地である。本培地は、第一態様に記載の細胞凝集促進剤又はその有効成分であるミオシンシグナル伝達因子阻害剤を含む増殖用培地で構成される。
「細胞凝集阻害培地」は、細胞凝集を阻害する浮遊培養用の細胞培養培地である。本培地は、第一態様に記載の細胞凝集阻害剤又はその有効成分であるミオシンシグナル伝達因子促進剤を含む増殖用培地で構成される。
8−1.概要
本発明の第八の態様は、細胞凝集調節キットである。本態様の細胞凝集調節キットは、細胞凝集に関与するミオシンシグナル伝達経路において、その経路を正に制御するミオシンシグナル伝達因子の活性を阻害若しくは抑制、又は促進若しくは増幅することのできる薬剤や培地を包含する。本態様の細胞凝集調節キットを用いることで、細胞の凝集を容易かつ適度なサイズに調節することが可能となる。
本態様の細胞凝集調節キットは、必須の構成要素としてミオシンシグナル伝達因子阻害剤及びミオシンシグナル伝達因子促進剤を、また選択的構成要素として培地、及び/又はプロトコルを包含する。
(目的)
ミオシン阻害剤ブレビスタチンの添加による細胞の凝集促進効果について検討した。
(方法)
1.ヒトiPS細胞の維持培養
ヒトiPS細胞は、TkDN4−M株(東京大学医科学研究所)を使用した。Vitronectin(サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社)をコートした細胞培養用ディッシュ上にヒトiPS細胞を播種した。培地はEssential 8TM(サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社)を使用して、維持培養を行った。継代時の細胞剥離剤には、Accutase(サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社)を用いた。また、細胞播種時のみ、10μMの濃度でROCK阻害剤であるY−27632(和光純薬工業株式会社)を全ての培地に添加した。これは、RHO−ROCKシグナル伝達経路の活性により、その下流で作用するアポトーシス活性を抑制するためである。培地交換は毎日実施した。実験には継代数50回までのヒトiPS細胞を使用した。
上記維持培養で培養したヒトiPS細胞をAccutaseで3分から5分ほど処理して剥離し、単細胞まで分散した。
上記浮遊培養を開始した翌日、すなわち浮遊培養1日目の顕微鏡観察像を図1に示す。観察の結果、ブレビスタチン無添加の対照試験(0μM)では細胞凝集塊は形成されず、単一細胞のままであった。一方、ブレビスタチンを添加した細胞懸濁液(10μM)では、いずれも細胞凝集塊が形成された。
(目的)
ヒトiPS細胞の浮遊培養を行いグルコース消費量、細胞収量、未分化マーカーの陽性率を測定し、ブレビスタチンが与える細胞への影響を解析した。
(方法)
実施例1と同様に細胞懸濁液(細胞濃度:2×105個/mL)を調製し、別途ブレビスタチンを最終濃度5.85mg/mL(20mM)になるように細胞凝集促進剤を調整し、前記調整した細胞凝集促進剤を前記細胞懸濁液にブレビスタチンの最終濃度が10μMとなるように添加した上で、浮遊培養用6ウェルプレート(住友ベークライト株式会社)に4mL/ウェルで播種した。培地は、ロータリーシェーカー(株式会社オプティマ)上で90 rpmのスピードで水平面に沿って旋回幅(直径)が25mmの円を描くように旋回培養し、5% CO2、37℃の環境下で浮遊培養を行った。培養翌日(培養1日目)以降、毎日新鮮な培地(最終濃度5mg/mLのBSA(和光純薬工業株式会社)を含むEssential 8TM培地)に培地交換し、培養5日後まで培養を続けた。培養中、毎日位相差顕微鏡により画像を取得とした。培地交換時に回収した培養上清に含まれるグルコースの濃度を、バイオセンサーBF−5iD(王子計測機器株式会社)で測定し、グルコース消費量を計算した。
図3は、細胞を播種した(0日目)から培養1日目から5日目を観察した顕微鏡写真である。ブレビスタチンを添加した条件では、播種後から培養1日目にかけて細胞凝集塊が形成されており、培養を継続することで徐々に細胞が増殖し、細胞凝集塊が大きくなった。
Claims (19)
- 細胞の浮遊培養に用いるための細胞凝集促進剤であって、
ミオシンシグナル伝達経路におけるシグナル伝達因子の活性を阻害又は抑制する薬剤を含む、前記細胞凝集促進剤。 - 前記薬剤の濃度が0.1μg/mL以上30.0mg/mL以下である、請求項1に記載の細胞凝集促進剤。
- 前記薬剤がミオシン阻害剤である、請求項1又は2に記載の細胞凝集促進剤。
- 前記ミオシン阻害剤がブレビスタチンである、請求項3に記載の細胞凝集促進剤。
- 前記細胞が幹細胞である、請求項1から4のいずれか1項に記載の細胞凝集促進剤。
- 細胞凝集塊の製造方法であって、
培地中で細胞を浮遊培養する工程を含み、
前記培地がミオシンシグナル伝達経路におけるシグナル伝達因子の活性を阻害又は抑制する薬剤を含む、前記製造方法。 - 前記薬剤の培地中における濃度が2.9ng/mL以上3.0mg/mL以下である、請求項6に記載の製造方法。
- 前記薬剤がミオシン阻害剤である、請求項6又は7に記載の製造方法。
- 前記ミオシン阻害剤がブレビスタチンである、請求項8に記載の製造方法。
- 前記細胞が幹細胞である、請求項6から9のいずれか1項に記載の製造方法。
- 請求項6から10のいずれか1項に記載の製造方法により得られた細胞凝集塊。
- 細胞の凝集を調節する方法であって、
ミオシンシグナル伝達経路におけるシグナル伝達因子の活性を阻害又は抑制する薬剤を含む培地中で細胞を浮遊させながら培養する工程と、
ミオシンシグナル伝達経路におけるシグナル伝達因子の活性を促進又は増幅する薬剤を含む培地中で細胞を浮遊させながら培養する工程と、を含む前記方法。 - 前記ミオシンシグナル伝達経路におけるシグナル伝達因子の活性を阻害又は抑制する薬剤がミオシン阻害剤である、請求項12に記載の方法。
- 前記ミオシンシグナル伝達経路におけるシグナル伝達因子の活性を促進又は増幅する薬剤がミオシン活性化剤である、請求項12又は13に記載の方法。
- 前記細胞が幹細胞である、請求項12から14のいずれか1項に記載の方法。
- ミオシンシグナル伝達経路におけるシグナル伝達因子の活性を阻害又は抑制する薬剤と、ミオシンシグナル伝達経路におけるシグナル伝達因子の活性を促進又は増幅する薬剤とを含む、細胞凝集調節キット。
- 前記ミオシンシグナル伝達経路におけるシグナル伝達因子の活性を阻害又は抑制する薬剤がミオシン阻害剤である、請求項16に記載の細胞凝集調節キット。
- 前記ミオシンシグナル伝達経路におけるシグナル伝達因子の活性を促進又は増幅する薬剤が、ミオシン活性化剤である、請求項16又は17に記載の細胞凝集調節キット。
- さらに培地を含む、請求項16から18のいずれか1項に記載の細胞凝集調節キット。
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