JP2005229871A - 足場材料 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 本発明にかかる足場材料は、in−vitroで行なう細胞培養に用いる足場材料であって、コラーゲンからなるスポンジ中に非生体分解吸収性合成高分子が繊維状の形態で存在してなる、ことを特徴とする。
【選択図】 なし
Description
ところが、前記コラーゲンからなるスポンジ状成形体は、力学的強度が低いという欠点があり、これを用いてin−vitroでの細胞培養を行なった場合、培地に浸漬した際や細胞を接着させた際に収縮が生じ、その結果、静置下では栄養や老廃物の交換量が減少して細胞接着性や細胞増殖性や細胞分化誘導能が低下し、所望の細胞培養(細胞の増殖・分化)が充分に行なえない。
本発明の足場材料は、コラーゲンからなるスポンジ中に非生体分解吸収性合成高分子が繊維状の形態で存在してなるものである。詳しくは、本発明の足場材料は、コラーゲンからなるミクロポーラスなスポンジの中に、繊維状の非生体分解吸収性合成高分子がランダムに埋入された構造を有している。
本発明における前記コラーゲンとしては、特に制限はなく、例えば骨や皮や腱等の動物組織を原料として得られる従来公知のあらゆるコラーゲン、例えば、酸不溶化コラーゲン、中性塩不溶化コラーゲンのような不溶化コラーゲン;酸可溶化コラーゲン、中性塩可溶化コラーゲン、酵素可溶化コラーゲン、アルカリ可溶化コラーゲンのような可溶化コラーゲン;これら不溶化もしくは可溶化コラーゲンを化学修飾(例えば、アセチル化、コハク化、マレイル化、フタル化、ベンゾイル化、エステル化、アミド化、グアニジノ化等)したコラーゲン;可溶化コラーゲンからコラーゲン繊維を再生させた再生コラーゲン;等が挙げられる。前記コラーゲンの分子種は、特に制限されないが、具体的には、例えば、豚皮由来I型コラーゲン、豚腱由来I型コラーゲン、牛鼻軟骨由来II型コラーゲン、魚から抽出したI型コラーゲン等が好ましく挙げられる。また、本発明における前記コラーゲンとしては、前述した動物由来のコラーゲン以外に、遺伝子組み替え技術によって得られたコラーゲン、例えば遺伝子組み替え型ヒト型コラーゲンも挙げられる。なお、前記コラーゲンは、テロペプチドを分解・除去したアテロコラーゲンであってもよいし、テロペプチドを含むコラーゲンであってもよい。前記コラーゲンは1種のみであってもよいし、2種以上であってもよい。
前記1)において、繊維状の非生体分解吸収性合成高分子は、油脂分を除去するため、例えば、アセトン、エタノール水溶液(好ましくは70%程度のエタノール水溶液)等の溶剤であらかじめ洗浄しておくことが好ましい。
本発明の足場材料において、前記繊維状の非生体分解吸収性合成高分子は、その隣接する繊維間に結合点を有していることが好ましい。これにより、非生体分解吸収性合成高分子繊維の強度を補強することができ、得られる足場材料により高い力学的強度を付与し、その結果、細胞接着性、細胞増殖性および細胞分化誘導能をより向上させることができるのである。
前記繊維状の非生体分解吸収性合成高分子の隣接する繊維間に結合点を形成する方法としては、特に制限されないが、例えば、i)前記繊維状の非生体分解吸収性合成高分子に、該繊維状で用いる非生体分解吸収性合成高分子よりも融点が低い非生体分解吸収性合成高分子(以下「低融点高分子」と称す。)をコーティングした後、コーティングされた低融点高分子のみが融解するような条件で熱処理する方法、ii)前記繊維状の非生体分解吸収性合成高分子の繊維表面のみが僅かに融解するような条件で熱処理する方法、などを採用すればよい。前記i)の方法では融解した低融点高分子が、前記ii)の方法では繊維表面で融解した非生体分解吸収性合成高分子が、熱処理後、常温に戻る際に繊維の交点にて凝固し、隣接する繊維間に結合点が形成されることとなる。
本発明の足場材料において、前記コラーゲンからなるスポンジは、架橋が施されていることが好ましい。これにより、さらに高い力学的強度を得ることができ、その結果、細胞接着性、細胞増殖性および細胞分化誘導能をより向上させることができるのである。
〔実施例1〕
繊維径12μmのポリエチレンテレフタレート繊維からなる不織布3mg分を切り出し、ピンセットで均一にほぐして繊維状にし、ポリスチレン製鋳型(15.5mmφ、17.3mmH、24穴マイクロプレート、旭テクノグラス社製)の中に入れた。次いで、該鋳型に豚腱由来可溶化コラーゲン2.25mgを含む0.3重量%コラーゲン溶液0.75mLを添加した。次いで、該鋳型の内容物を−80℃で12時間凍結した後、0.1トール未満の真空下で24時間凍結乾燥を行い、スポンジを形成させた。次いで、得られたスポンジに140℃、0.1トール未満の真空下で12時間熱脱水架橋を施し、その後、さらに、紫外線照射装置(「SPECTROLINKER XL−1500」TOMY SEIKO製、254nm、15W×6)を用いてスポンジの上下両面から10分間ずつ紫外線を照射(片面につき3000×100μJ/cm2)し、ポリエチレンテレフタレート/コラーゲン=1.3(重量比)である本発明の足場材料を得た。
繊維径22μmのポリエチレンテレフタレート繊維からなる不織布3mg分を用いるように変更したこと以外は、実施例1と同様にして、ポリエチレンテレフタレート/コラーゲン=1.3(重量比)である本発明の足場材料を得た。
〔実施例3〕
繊維径42μmのポリエチレンテレフタレート繊維からなる不織布3mg分を用いるように変更したこと以外は、実施例1と同様にして、ポリエチレンテレフタレート/コラーゲン=1.3(重量比)である本発明の足場材料を得た。
繊維径22μmのポリエチレンテレフタレート繊維からなる不織布1.5mg分を用いるように変更したこと以外は、実施例1と同様にして、ポリエチレンテレフタレート/コラーゲン=2.6(重量比)である本発明の足場材料を得た。
〔実施例5〕
繊維径22μmのポリエチレンテレフタレート繊維からなる不織布6mg分を用いるように変更したこと以外は、実施例1と同様にして、ポリエチレンテレフタレート/コラーゲン=0.65(重量比)である本発明の足場材料を得た。
実施例1と同様のポリスチレン製鋳型に、豚腱由来可溶化コラーゲン2.25mgを含む0.3重量%コラーゲン溶液0.75mLを添加した。次いで、該鋳型の内容物を−80℃で12時間凍結した後、0.1トール未満の真空下で24時間凍結乾燥を行い、スポンジを形成させた。次いで、得られたスポンジに140℃、0.1トール未満の真空下で12時間熱脱水架橋を施し、その後、さらに、紫外線照射装置(「SPECTROLINKER XL−1500」TOMY SEIKO製、254nm、15W×6)を用いてスポンジの上下両面から10分間ずつ紫外線を照射(片面につき3000×100μJ/cm2)し、ポリエチレンテレフタレート/コラーゲン=0(重量比)である可溶化コラーゲンのみからなる足場材料を得た。
<走査型電子顕微鏡による観察>
実施例2、実施例4、実施例5、および比較例1で得られた各足場材料の断面を走査型電子顕微鏡(「S−2380N」日立社製)を用いて観察した。各断面写真を図1にそれぞれ示す。
図1から、本発明の足場材料(実施例2、実施例4、実施例5)には、ポリエチレンテレフタレート繊維が認められ、しかも、ポリエチレンテレフタレート繊維の有無に関わらずポアサイズに差はないことが判る。
実施例1〜5および比較例1で得られた各足場材料をα−MEM培地(10%FCS含む)に7日間浸漬させ、浸漬後の各足場材料の直径を測定した。なお、浸漬前の各足場材料の直径はいずれも15.5mmであった。結果を図2に示す。
図2の結果から、ポリエチレンテレフタレート繊維を組み込むことで、収縮が抑制されることが判る。また、ポリエチレンテレフタレート繊維の繊維径が細いほど、ポリエチレンテレフタレート繊維の繊維の量が多いほど、収縮抑制効果が大きいことが判る。
<圧縮試験>
実施例1〜5、および比較例1で得られた各足場材料について、圧縮試験機(「オートグラフAGS−10kND」島津製作所製)を用い、ロードセルの速さは1mm/分とし、高さの50%を圧縮したときの応力−ひずみ曲線を得、該曲線から初期圧縮弾性率(kPa)を求めた。結果を図3に示す。
<細胞接着性試験>
実施例2、実施例4、実施例5、および比較例1で得られた各足場材料を直径15mm×高さ3mmの円柱状にし、これを70%エタノール水溶液中に3分間浸漬したのち、α−MEM培地(10%FBS含む)に3回浸漬させた。該培地を除去したのち、各足場材料を培養プレートに入れ、その中にMC3T3−E1骨芽細胞(2×106cells/mL)を含むα−MEM培地(10%FBS含む)0.5mLを加えて37℃でインキュベートした。そして、6時間後に細胞のDNAを定量することにより、初期接着細胞数を測定した。結果を図4に示す。
〔参考例〕
繊維径12μmのポリエチレンテレフタレート繊維からなる不織布(面密度0.08g/cm3)と、繊維径12μmのポリグリコール酸繊維からなる不織布(面密度0.08g/cm3)とを用いて、ラット骨髄から単離した未分化間葉系幹細胞を増殖させた。すなわち、各不織布へそれぞれ1×106個の細胞を播種し、スピナーフラスコで旋回培養を行ない、3週間後の細胞数を調べた。なお、細胞数は、各不織布を細切したのち、lysis溶液にて細胞を溶解させ、DNAを定量することにより行なった。
Claims (1)
- in−vitroで行なう細胞培養に用いる足場材料であって、コラーゲンからなるスポンジ中に非生体分解吸収性合成高分子が繊維状の形態で存在してなる、ことを特徴とする足場材料。
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