JP2009112277A - 三次元培養弾性線維組織及び三次元培養弾性線維組織の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】三次元的な厚みを有し、エラスチン、フィブリリン等の弾性線維組織に不可欠な弾性線維成分が発現している三次元培養弾性線維組織、及び、該三次元培養弾性線維組織の製造方法を提供する。
【解決手段】コラーゲンからなる平均孔径が１〜３０μｍである多孔性基材に対して、１×１０３／ｃｍ２以上の密度で線維芽細胞を播種する工程１と、前記工程１で得られた線維芽細胞が播種された多孔性基材を血清添加培地中で培養する工程２とを有する製造方法により製造される三次元培養弾性線維組織であって、厚さが５μｍ以上であり、エラスチン及びフィブリリンを含有する三次元培養弾性線維組織。
【選択図】図１
【解決手段】コラーゲンからなる平均孔径が１〜３０μｍである多孔性基材に対して、１×１０３／ｃｍ２以上の密度で線維芽細胞を播種する工程１と、前記工程１で得られた線維芽細胞が播種された多孔性基材を血清添加培地中で培養する工程２とを有する製造方法により製造される三次元培養弾性線維組織であって、厚さが５μｍ以上であり、エラスチン及びフィブリリンを含有する三次元培養弾性線維組織。
【選択図】図１
Description
本発明は、三次元的な厚みを有し、エラスチン、フィブリリン等の弾性線維組織に不可欠な弾性線維成分が発現している三次元培養弾性線維組織、及び、該三次元培養弾性線維組織の製造方法に関する。
近年の細胞工学技術の進展によって、数々の動物細胞の培養が可能となり、また、それらの細胞を用いてヒトの組織や器官を再構築しようとする、いわゆる再生医療の研究が急速に進んでおり、皮膚や血管等の種々の組織の再生が試みられている。ところで、皮膚や血管の生体組織の柔軟性は弾性線維により保たれており、充分な柔軟性を有する生体組織の再生のためには、弾性線維組織の構築も重要である。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてはシャーレ上で血清添加培地を用いて高密度に線維芽細胞を培養することにより、線維芽細胞が弾性線維成分を産生することが知られている。しかしながら、このようにして得られた弾性線維組織は組織形状を保ったままシャーレから剥離することが困難であった。
これに対して、感温性応答培養皿等の特殊な培養基材を用いて、培養された組織をシート状に剥離する方法が提案されている（特許文献１等）。この方法を応用すれば、シャーレ上に形成された弾性線維組織をシート状に剥離することができる。
これに対して、感温性応答培養皿等の特殊な培養基材を用いて、培養された組織をシート状に剥離する方法が提案されている（特許文献１等）。この方法を応用すれば、シャーレ上に形成された弾性線維組織をシート状に剥離することができる。
しかしながら、このようにして得られた弾性線維組織シートは単層の細胞シートにすぎない。再生医療分野での応用を考えると、皮膚や血管等の組織を構築するためには、単層の細胞シートでは組織としての強度が不足し、また移植のための取り扱いも困難である。仮に移植が可能であったとしても、ほとんど厚さのない弾性線維組織シートを移植しても、柔軟性を付与するという弾性線維組織本来の性能を発揮することはできない。このような方法で作製された細胞シートを用いて厚みのある組織を構築するためには、作製した細胞シートを何枚も剥がして細胞シート同士を接着させるという操作が必要であり、また、作製された組織が厚くなると内部まで栄養供給ができずに作製した再生組織が壊死してしまうという問題点がある。
また、細胞の三次元的な培養方法としてはコラーゲンゲル中で細胞を培養する方法が知られている。しかしながらこれまでのところ、いかに高密度に線維芽細胞をコラーゲンゲル中で培養しても、弾性線維成分が発現されるという報告はなかった。
国際公開第２００２／０１０３４９号パンフレット
本発明は、上記現状に鑑み、三次元的な厚みを有し、エラスチン、フィブリリン等の弾性線維組織に不可欠な弾性線維成分が発現している三次元培養弾性線維組織、及び、該三次元培養弾性線維組織の製造方法を提供することを目的とする。
本発明は、コラーゲンからなる平均孔径が１〜３０μｍである多孔性基材に対して、１×１０３／ｃｍ２以上の密度で線維芽細胞を播種する工程１と、前記工程１で得られた線維芽細胞が播種された多孔性基材を血清添加培地中で培養する工程２とを有する製造方法により製造される三次元培養弾性線維組織であって、厚さが５μｍ以上であり、エラスチン及びフィブリリンを含有する三次元培養弾性線維組織である。
以下に本発明を詳述する。
以下に本発明を詳述する。
本発明者らは、鋭意検討の結果、コラーゲンからなり平均孔径が１〜３０μｍである多孔性基材に対して高密度に線維芽細胞を播種した後、一定期間血清添加培地中で培養することにより、線維芽細胞からエラスチン、フィブリリン等の弾性線維成分が分泌され、更に培養を続けることにより三次元的な厚みを持った弾性線維組織が形成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
線維芽細胞から弾性線維成分が分泌されるためには、線維芽細胞同士が充分に近接した高密度な状態で培養される必要があるものと考えられる。例えばシャーレ上の平板培養の場合では、このような高密度培養が可能となり、これにより弾性線維組織が形成されていたものと思われる。一方、コラーゲンゲル中の培養や、従来の再生医療に一般的に用いられている孔径の比較的大きなコラーゲンスポンジに線維芽細胞を播種して培養する方法では、いかに培養を続けても線維芽細胞同士が充分に近接した状態にはならず、従って弾性線維組織が形成されないと考えられる。
これに対して、平均孔径が１〜３０μｍである多孔性基材は、スポンジの性質とフィルムの性質を有するものである。即ち、平均孔径が１〜３０μｍである多孔性基材に線維芽細胞を播種した場合、フィルム上（シャーレ上）に細胞を播種した場合と同様に、線維芽細胞同士が充分に近接した高密度な状態で培養することができ、弾性線維組織が形成される。一方、細胞自身が分泌する分解酵素により基材が分解されて基材の孔が徐々に大きくなり、播種された線維芽細胞の一部が分解により大きくなった多孔性基材の孔に侵入して三次元的に広がっていくこともできる。更に多孔性基材は、培地成分の透過性に優れることから、高密度に大量に培養されている線維芽細胞に充分に栄養を供給することができる。かくして、培養を継続すると、三次元的な厚みを持った弾性線維組織が形成される。
これに対して、平均孔径が１〜３０μｍである多孔性基材は、スポンジの性質とフィルムの性質を有するものである。即ち、平均孔径が１〜３０μｍである多孔性基材に線維芽細胞を播種した場合、フィルム上（シャーレ上）に細胞を播種した場合と同様に、線維芽細胞同士が充分に近接した高密度な状態で培養することができ、弾性線維組織が形成される。一方、細胞自身が分泌する分解酵素により基材が分解されて基材の孔が徐々に大きくなり、播種された線維芽細胞の一部が分解により大きくなった多孔性基材の孔に侵入して三次元的に広がっていくこともできる。更に多孔性基材は、培地成分の透過性に優れることから、高密度に大量に培養されている線維芽細胞に充分に栄養を供給することができる。かくして、培養を継続すると、三次元的な厚みを持った弾性線維組織が形成される。
本発明の三次元培養弾性線維組織は、コラーゲンからなる平均孔径が１〜３０μｍである多孔性基材に対して、１×１０３／ｃｍ２以上の密度で線維芽細胞を播種する工程１と、上記工程１で得られた線維芽細胞が播種された多孔性基材を血清添加培地中で培養する工程２とを有する製造方法により製造される。
上記工程１において用いられる多孔性基材は、コラーゲンからなる。コラーゲンは線維芽細胞の接着性に優れることから、大量の線維芽細胞を接着して高密度に培養することができる。また、コラーゲンからなる多孔性基材は、培養とともに徐々に分解され、その一部が線維芽細胞から分泌された弾性線維成分と置き換わることにより、弾性線維組織が形成される。
また、上記多孔性基材としては線維芽細胞が接着する材料であればよく、コラーゲン以外にも、例えば、ゼラチン等のタンパク質、ヒアルロン酸等の多糖類等の天然高分子；脂肪族ポリエルテル等生体内で分解吸収され得る合成高分子等も用いることができる。
また、上記多孔性基材としては線維芽細胞が接着する材料であればよく、コラーゲン以外にも、例えば、ゼラチン等のタンパク質、ヒアルロン酸等の多糖類等の天然高分子；脂肪族ポリエルテル等生体内で分解吸収され得る合成高分子等も用いることができる。
上記多孔性基材は、平均孔径の下限が１μｍ、上限が３０μｍである。１μｍ未満であると、播種した線維芽細胞が多孔性基材中に侵入することができず、三次元的な厚みを持った弾性線維組織が得られない。ヒト線維芽細胞の長径はおおよそ５０〜７０μｍであるので、基材の孔径が３０μｍ程度を超えると、播種した線維芽細胞の大部分が多孔性基材中に落ち込んでしまい、線維芽細胞の密度が不充分となって弾性線維成分が分泌されない。好ましい下限は５μｍ、好ましい上限は２５μｍである。
上記多孔性基材の厚さとしては特に限定されないが、好ましい下限は０．１ｍｍ、好ましい上限は３ｍｍである。０．１ｍｍ未満であると、充分な厚さをもった弾性線維組織が形成されなかったり、移植時の取扱い性等に劣ることがあり、３ｍｍを超えると、播種した線維芽細胞への栄養供給に劣ることがある。
上記多孔性基材は、濃度０．５ｕｎｉｔｓ／ｍＬのコラゲナーゼ水溶液中に３７℃、１００分間浸漬した後の重量残存率の好ましい下限が４０％、好ましい上限が６０％である。４０％未満であると、線維芽細胞播種後に細胞の分泌する酵素により早期に多孔性基材が分解してしまい、三次元構造を形成する前に細胞の足場が存在しなくなってしまうこととなり組織の構築が不可能となることがある。６０％を超えると、線維芽細胞が培養基材の孔に侵入することができず、シャーレ上で培養するのと同様に単層の細胞シートとなってしまうことがある。このような多孔性基材の分解性は、架橋処理を行う際の温度や時間を工夫することにより制御することが可能になる。
なお、本明細書において重量残存率とは、コラゲナーゼ水溶液に浸漬後に残存した多孔性基材をフィルターを用いて濾取し、これを充分に乾燥させた後に測定した重量を、コラゲナーゼ水溶液浸漬前に予め測定しておいた多孔性基材の重量に対する割合として算出したものである。
なお、本明細書において重量残存率とは、コラゲナーゼ水溶液に浸漬後に残存した多孔性基材をフィルターを用いて濾取し、これを充分に乾燥させた後に測定した重量を、コラゲナーゼ水溶液浸漬前に予め測定しておいた多孔性基材の重量に対する割合として算出したものである。
上記多孔性基材を製造する方法としては特に限定されず、例えば、コラーゲン水溶液に脂溶性有機溶媒を添加し、ホモジナイズして発泡させた後、真空凍結乾燥して得る方法等により得たコラーゲンスポンジを用いてもよく、また、このようにして得られたコラーゲンスポンジを更にプレスして孔径を調整したものを用いてもよい。
上記工程１においては、上記多孔性基材に対して線維芽細胞を播種する。播種密度の下限は１×１０３／ｃｍ２である。１×１０３／ｃｍ２未満であると、線維芽細胞の密度が不充分となって弾性線維成分が分泌されない。好ましい下限は１×１０４／ｃｍ２である。播種密度の上限については特に限定されないが、１×１０７／ｃｍ２を超えて播種しても、上記多孔性基材に接着できない細胞が増えるばかりで、実質的な効果は少ない。
上記工程２では、工程１で得られた線維芽細胞が播種された多孔性基材を血清添加培地中で培養する。
上記血清添加培地としては特に限定されず、例えば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ等の一般的な培養液に、１〜１０重量％程度のウシ胎児血清を添加したもの等が挙げられる。
培養期間については、多孔性基材の孔径、細胞の播種密度、血清添加培地の種類等により異なり特に限定されないが、１〜４週間程度の期間培養することにより弾性線維組織が形成される。
上記血清添加培地としては特に限定されず、例えば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ等の一般的な培養液に、１〜１０重量％程度のウシ胎児血清を添加したもの等が挙げられる。
培養期間については、多孔性基材の孔径、細胞の播種密度、血清添加培地の種類等により異なり特に限定されないが、１〜４週間程度の期間培養することにより弾性線維組織が形成される。
このような製造方法により製造された本発明の三次元培養弾性線維組織は、少なくともエラスチン、フィブリリン等の弾性線維成分を含有するものである。エラスチン、フィブリリン等の存在は、免疫染色法等により確認することができる。
本発明の三次元培養弾性線維組織を製造する製造方法もまた、本発明の１つである。
本発明の三次元培養弾性線維組織を製造する製造方法もまた、本発明の１つである。
本発明の三次元培養弾性線維組織の厚さの下限は５μｍである。５μｍ未満であると、移植の際に組織としての強度が不足し取り扱いが困難であり、移植しても柔軟性を付与するという弾性線維組織本来の性能を発揮することができない。好ましい下限は１０μｍ、より好ましい下限は３０μｍである。
本発明の三次元培養弾性線維組織は、強度を高める目的で生体吸収性材料からなる補強材を複合化させてもよい。
上記補強材としては、ポリ−Ｌ−ラクチド、ポリグリコリド、Ｌ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体等の合成生体吸収性高分子、特に脂肪族ポリエステルやコラーゲン、ゼラチン等の天然高分子からなる不織布、スポンジ等が挙げられる。
上記補強材としては、ポリ−Ｌ−ラクチド、ポリグリコリド、Ｌ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体等の合成生体吸収性高分子、特に脂肪族ポリエステルやコラーゲン、ゼラチン等の天然高分子からなる不織布、スポンジ等が挙げられる。
本発明の三次元培養弾性線維組織は、エラスチン、フィブリリン等の弾性線維成分を含みながら、三次元的な厚みを有するものである。これにより移植等の際にも充分な強度を有し、取扱い性に優れる。更に、生体に移植した後には、組織に柔軟性を付与するという弾性線維組織本来の性能を発揮することができる。
本発明によれば、三次元的な厚みを有し、エラスチン、フィブリリン等の弾性線維組織に不可欠な弾性線維成分が発現している三次元培養弾性線維組織、及び、該三次元培養弾性線維組織の製造方法を提供することができる。
以下に実施例を挙げて本発明の態様を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例にのみ限定されるものではない。
（実施例１）
（１）多孔性基材の調製
０．３％水溶液（ｐＨ３）のＴｙｐｅＩコラーゲンを、１５％エタノールで３倍希釈し、０．１％コラーゲン、１０％エタノール水溶液とした。更にこの溶液を直径９ｃｍのシャーレに１５ｇ流し込み、−１３５℃で凍結し、真空度：０．１、乾燥温度：４０℃、乾燥時間：２４時間の条件で凍結乾燥を行い、コラーゲンスポンジを得た。その後、真空下で１０５℃、２４時間熱架橋を行うことにより、多孔性基材を得た。
得られた多孔性基材の平均孔径は１５μｍ、厚さは１ｍｍであった。
（１）多孔性基材の調製
０．３％水溶液（ｐＨ３）のＴｙｐｅＩコラーゲンを、１５％エタノールで３倍希釈し、０．１％コラーゲン、１０％エタノール水溶液とした。更にこの溶液を直径９ｃｍのシャーレに１５ｇ流し込み、−１３５℃で凍結し、真空度：０．１、乾燥温度：４０℃、乾燥時間：２４時間の条件で凍結乾燥を行い、コラーゲンスポンジを得た。その後、真空下で１０５℃、２４時間熱架橋を行うことにより、多孔性基材を得た。
得られた多孔性基材の平均孔径は１５μｍ、厚さは１ｍｍであった。
得られた多孔性基材の酵素分解試験を以下の手順により行った。
トリスバッファー（ｐＨ７．４）にコラゲナーゼを０．５ｕｎｉｔｓ／ｍＬとなるように加えた溶液に、作製した多孔性基材を３７℃にて浸漬させた。一定時間後に多孔性基材を取り出して蒸留水で洗浄して乾燥させた。乾燥させた多孔性基材の重量を測定し、試験前の重量と比較することにより重量残存率を計算した。
試験結果を図５に示した。得られた多孔性基材は本試験条件においては直線的に重量減少が観察され、１００分後の重量残存率は約５０％であった。
トリスバッファー（ｐＨ７．４）にコラゲナーゼを０．５ｕｎｉｔｓ／ｍＬとなるように加えた溶液に、作製した多孔性基材を３７℃にて浸漬させた。一定時間後に多孔性基材を取り出して蒸留水で洗浄して乾燥させた。乾燥させた多孔性基材の重量を測定し、試験前の重量と比較することにより重量残存率を計算した。
試験結果を図５に示した。得られた多孔性基材は本試験条件においては直線的に重量減少が観察され、１００分後の重量残存率は約５０％であった。
（２）細胞の播種と培養
得られた多孔性基材上に１×１０５／ｃｍ２の播種密度となるようにヒト包皮由来線維芽細胞を播種し、その後１０％ウシ血清添加ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で培養した。培養開始後４週間培養を続けた。
得られた多孔性基材上に１×１０５／ｃｍ２の播種密度となるようにヒト包皮由来線維芽細胞を播種し、その後１０％ウシ血清添加ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で培養した。培養開始後４週間培養を続けた。
（３）弾性線維組織の検出
培養開始後４週間後に培養組織をホルマリン固定し、パラフィンブロックを作製した。得られたパラフィン切片を用いて、免疫染色法によりエラスチン、フィブリリン１の存在を確認した。各々の免疫染色像を図１、２に示した。図１、２より、弾性線維組織が約５０μｍの厚さで形成されていることが確認された。
培養開始後４週間後に培養組織をホルマリン固定し、パラフィンブロックを作製した。得られたパラフィン切片を用いて、免疫染色法によりエラスチン、フィブリリン１の存在を確認した。各々の免疫染色像を図１、２に示した。図１、２より、弾性線維組織が約５０μｍの厚さで形成されていることが確認された。
（比較例１）
（１）多孔性基材の調製
０．３％水溶液（ｐＨ３）のＴｙｐｅＩコラーゲンをホモジナイザーで攪拌した後に、−４０℃にて凍結した。更に真空度：０．１、乾燥温度：４０℃、乾燥時間：２４時間の条件で凍結乾燥を行い、コラーゲンスポンジを得た。その後、真空下で１０５℃、２４時間熱架橋を行い、更に０．２％グルタルアルデヒド水溶液中で２４時間化学架橋反応を行った。得られた架橋コラーゲンスポンジを水で充分に洗浄してグルタルアルデヒドを除去した後に１５％エタノール中に浸漬し、−１３５℃にて凍結した。更に真空度：０．１、乾燥温度：４０℃、乾燥時間：２４時間の条件で凍結乾燥を行い、多孔質基材を得た。
得られた多孔性基材の平均孔径は９０μｍ、厚さは３ｍｍであった。
（１）多孔性基材の調製
０．３％水溶液（ｐＨ３）のＴｙｐｅＩコラーゲンをホモジナイザーで攪拌した後に、−４０℃にて凍結した。更に真空度：０．１、乾燥温度：４０℃、乾燥時間：２４時間の条件で凍結乾燥を行い、コラーゲンスポンジを得た。その後、真空下で１０５℃、２４時間熱架橋を行い、更に０．２％グルタルアルデヒド水溶液中で２４時間化学架橋反応を行った。得られた架橋コラーゲンスポンジを水で充分に洗浄してグルタルアルデヒドを除去した後に１５％エタノール中に浸漬し、−１３５℃にて凍結した。更に真空度：０．１、乾燥温度：４０℃、乾燥時間：２４時間の条件で凍結乾燥を行い、多孔質基材を得た。
得られた多孔性基材の平均孔径は９０μｍ、厚さは３ｍｍであった。
（２）細胞の播種と培養
得られた多孔性基材上に１×１０５／ｃｍ２の播種密度となるようにヒト包皮由来線維芽細胞を播種し、その後１０％ウシ血清添加ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で培養した。培養開始後４週間培養を続けた。
得られた多孔性基材上に１×１０５／ｃｍ２の播種密度となるようにヒト包皮由来線維芽細胞を播種し、その後１０％ウシ血清添加ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で培養した。培養開始後４週間培養を続けた。
（３）弾性線維組織の検出
培養開始後４週間後に培養組織をホルマリン固定し、パラフィンブロックを作製した。得られたパラフィン切片を用いて、免疫染色法によりエラスチン、フィブリリン１の存在を確認した。各々の免疫染色像を図３、４に示した。図３、４より、本比較例においては、弾性線維組織は形成されていないことを確認した。
培養開始後４週間後に培養組織をホルマリン固定し、パラフィンブロックを作製した。得られたパラフィン切片を用いて、免疫染色法によりエラスチン、フィブリリン１の存在を確認した。各々の免疫染色像を図３、４に示した。図３、４より、本比較例においては、弾性線維組織は形成されていないことを確認した。
本発明によれば、三次元的な厚みを有し、エラスチン、フィブリリン等の弾性線維組織に不可欠な弾性線維成分が発現している三次元培養弾性線維組織、及び、該三次元培養弾性線維組織の製造方法を提供することができる。
Claims (4)
- コラーゲンからなる平均孔径が１〜３０μｍである多孔性基材に対して、１×１０３／ｃｍ２以上の密度で線維芽細胞を播種する工程１と、前記工程１で得られた線維芽細胞が播種された多孔性基材を血清添加培地中で培養する工程２とを有する製造方法により製造される三次元培養弾性線維組織であって、
厚さが５μｍ以上であり、エラスチン及びフィブリリンを含有する
ことを特徴とする三次元培養弾性線維組織。 - 多孔性基材は、濃度０．５ｕｎｉｔｓ／ｍＬのコラゲナーゼ水溶液中に３７℃、１００分間浸漬した後の重量残存率が４０〜６０％であることを特徴とする請求項１記載の三次元培養弾性線維組織。
- コラーゲンからなる平均孔径が１〜３０μｍである多孔性基材に対して、１×１０３／ｃｍ２以上の密度で線維芽細胞を播種する工程１と、
前記工程１で得られた線維芽細胞が播種された多孔性基材を血清添加培地中で培養する工程２とを有する
ことを特徴とする三次元培養弾性線維組織の製造方法。 - 多孔性基材は、濃度０．５ｕｎｉｔｓ／ｍＬのコラゲナーゼ水溶液中に３７℃、１００分間浸漬した後の重量残存率が４０〜６０％であることを特徴とする請求項３記載の三次元培養弾性線維組織の製造方法。
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| JPN6013008192; ＬＡＣＲＯＩＸ，Ｓ． ｅｔ ａｌ: 'Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｄｅｒｍａｌ ａｎｄ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｉｎ' Ｂｉｏｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．８， Ｎｏ．２, 2007, ｐ．９７-１０９ * |
| JPN7012004714; Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｖｏｌ．２３， Ｎｏ．１４, 2002, ｐ．２８５５-６１ * |
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