CN101204592B - 仿生化组织工程食道的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种仿生化组织工程食道的制备技术，采用电纺织法对生物可降解聚酯类聚合物进行二次电纺丝，得到类似食道上皮基膜和排列有序的类似于肌层构造的不对称多孔纳米纤维结构，并对此纤维进行化学改性，使其表面接枝促进细胞生长的生物活性分子。类似于基膜结构的多孔纳米纤维可以支持食道上皮细胞的生长，而排列有序的趋向纤维有助于诱导食道平滑肌细胞趋向生长，在DMEM完全培养基中培养3～4周，得到同时具有上皮层和肌层的仿生化组织工程食道。这种食道在微观构造上完全模拟了人体正常食道组织，使体外构建的人工食道在构造和功能上更接近人体食道，接枝的生物活性分子有利于植于其上的细胞维持体内细胞原来形貌和生物功能，可用于病变食道的修复和构建。

Description

仿生化组织工程食道的制备方法

技术领域

本发明涉及一种仿生化组织、器官的制备方法，特别是一种在结构上完全模拟人体正常食道的微观构造制作仿生化组织工程食道，用此人工食道置于人体内病损部位以代替病变部分食道的仿生化组织工程食道的制备方法。

背景技术

正常人体食道为25厘米左右长的中空管道，连接咽喉和胃部，主要起输送食物和水的作用。食道由粘膜、粘膜下层、肌层和外膜构成，粘膜由未角化的复层鳞状上皮细胞组成，生长在基膜上，基膜提供细胞生长所需要的特殊蛋白、生长因子及其它营养物质，以调节细胞的增殖、分化、迁移和死亡等。肌层由肌细胞组成，以平滑肌细胞为主，粘膜和粘膜下层共同起分泌粘液和防止食物和水渗漏的作用，是食道能发挥正常功能最重要的部分。

食道病变所引发的死亡已越来越引起人们的关注，这类病变主要指食道癌、慢性逆流性食道炎以及Barret食道等。其中食道癌是最常见的恶性肿瘤之一，已成为世界第五大恶性肿瘤。我国更是食道癌的高发区，每年大约有25万人被诊断患食道癌，将近占全世界患者的一半。因此，组织工程化食道的构建已越来越引起各国科学家的关注。

专利号CN01118316“组织工程用复合结构细胞支架及其制法和用途”，将可降解聚合物，如乳酸/乙醇酸共聚物和聚L-乳酸，分别溶于二氯甲烷后与盐粒混合均匀，浇铸于模具中，室温下挥发溶剂24小时后真空干燥24小时，然后浸入去离子水中脱盐，将脱了盐的多孔支架干燥24小时后用二氯甲烷粘合，再真空干燥48小时制成。选用上述浇铸脱盐的方法制作细胞支架，不仅工艺复杂、速度慢，更重要的是很难将封闭孔内的盐分完全浸出。另外，用二氯甲烷粘合会导致整个支架的孔结构不均，而影响粘合处细胞的生长。

专利号CN02145461.2“组织工程化食道”，用脱细胞的猪皮(含表皮层和真皮层)作为支架，植入内皮细胞以构建支架内的血管和成纤维细胞以仿造真皮层构造，目的是用于替代受损食道的一期重建。这一专利只是提出了一种制备适合多种器官支架的一般方法，并没有根据人体食道的实际微观结构而使制得的支架具有食道组织所特有的生物功能。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种仿生化组织工程食道的制备方法，利用组织工程学原理，在体外构建与人体食道组织具有相似微观构造和功能的仿生化组织工程食道，为解决食道组织的修复和治疗提供新途径，减少医疗创伤，为食道病变患者带来福音。

本发明解决上述问题所采用的技术方案，即仿生化组织工程食道的制备方法，包括以下步骤：

一、)聚(L-乳酸-Co-己内酯)共聚物(PLLC)，以0.02～0.10克/毫升的浓度溶解在1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇中，制得聚合物溶液；

二、)将上述制得的聚合物溶液，运用电纺织技术进行第一次电纺丝，工作电压为25～45KV，针孔直径为26G，接收器为12cm×12cm的平台，得到纤维直径为50～2000nm，孔径为500～10000nm，孔隙率为15～90％的多孔纤维；

三、)在上述多孔纤维的表面，运用电纺织技术进行第二次电纺丝，工作电压为25～45KV，针孔直径为26G，接收器为高速旋转的滚轴，得到按同一方向有序排列的趋向纤维层，即为不对称多孔纳米纤维；

四、)将上述不对称多孔纳米纤维浸入浓度为0.04～0.10克/毫升的二元胺溶液中，在4～80℃温度下，反应0.01～10小时，然后用无水乙醇阻止反应，用去离子水浸泡清洗以去除多余的二元胺；

五、)将步骤四制得的胺解PLLC不对称多孔纳米纤维，浸入到浓度为0.005～0.025克/毫升的偶联剂溶液中室温反应1～3小时，取出并用水冲洗干净，然后再浸入浓度为0.1～1.0毫克/毫升的生物活性分子溶液中，在2～10℃温度下，反应24小时后，用水浸泡清洗，以使生物活性分子固定在聚合物纤维表面，所述的生物活性分子为纤维粘连蛋白Fn、胶原、明胶、壳聚糖、多肽、氨基酸或其它分子结构中含有胺基的细胞生长因子；

六、)从食道组织上剥离上皮层，消毒、浸洗、剪碎再经消化、培养，至上皮细胞增殖到所需的数量，在上述经生物活性分子接枝的不对称多孔纳米纤维的一面上种植食道上皮细胞，种植密度为1-10×10⁴/cm²；

七、)从食道组织上提取肌层组织，消毒、浸洗、剪碎，在培养皿底部加DMEM培养基培养，等平滑肌细胞增殖到所需的数量，在上述经生物活性分子接枝的不对称多孔纳米纤维有序排列的趋向纤维层上，种植食道平滑肌细胞，种植密度为1-10×10⁴/cm²；

八、)将上述种植有上皮细胞和平滑肌细胞的多孔纳米纤维放在含10％小牛血清及生长因子的DMEM完全培养基中培养3～4周，得到同时具有类似上皮层和肌层的仿生化组织工程食道。

与现有技术相比，本发明的优点在于：经实验证明，人体食道上支持上皮细胞生长的基膜通常是直径为80～500nm的纤维和孔径为30～500nm的多孔纳米纤维。根据这一结构特点，将聚酯类聚合物溶液运用电纺织技术进行第一次电纺丝，制得纤维直径为50～2000nm和孔径为500～10000nm的多孔纳米纤维，在此基础上，运用电纺织技术在上述多孔纳米纤维的表面进行第二次电纺丝，获得直径为50-2000nm且排列有序的趋向纤维层，这一趋向纤维可诱导平滑肌细胞的取向生长，有利于维持细胞的形貌和功能。在类似于食道上皮基膜的多孔纳米纤维和排列有序的趋向纤维层上分别种植食道上皮细胞和平滑肌细胞。另外，运用化学偶联的方法，将生物活性分子接枝于多孔纳米纤维表面，能更好地支持和促进上皮细胞和平滑肌细胞的生长及其生物功能的发挥。应用此法制得的食道在微观构建上完全模拟了人体正常食道组织，因此此组织工程化食道更适宜替代患者的部分病变食道。

具体实施方式

下面对本发明的实现例作进一步描述。

实施例

一、)将生物可降解聚酯类聚合物，聚(L-乳酸-Co-己内酯)共聚物(PLLC)，以0.02～0.10克/毫升的浓度溶解在1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇中，制得聚合物溶液；

所述的生物可降解聚酯类聚合物还可以是聚己内酯、聚(L-乳酸)、聚(D-乳酸)、无定型聚(D，L-乳酸)(PDLLA)、聚酯型聚氨酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乙醇酸、聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)中的任一种及这些聚合物的共聚物。聚酯类聚合物的分子量可以不必考虑，但优选使用分子量范围为10000～1000000的聚酯类聚合物。

二、)将上述制得的聚合物溶液，运用电纺织技术进行第一次电纺丝，工作电压为25～45KV，针孔直径为26G，接收器为12cm×12cm的平台，得到纤维直径为50～2000nm，孔径为500～10000nm，孔隙率为15～90％的多孔纤维；

三、)在上述多孔纤维的表面，运用电纺织技术进行第二次电纺丝，工作电压为25～45KV，针孔直径为26G，接收器为高速旋转的滚轴，得到按同一方向有序排列的2～20层趋向纤维层；

四、)将上述不对称多孔纳米纤维浸入浓度为0.04～0.10克/毫升的二元胺，如1，6-己二胺/正丙醇溶液中，在4～80℃温度下，反应0.01～10小时，然后用无水乙醇阻止反应，用去离子水浸泡清洗以去除多余的二元胺；

所述的二元胺为脂肪族二元胺、乙二胺、丙二胺、丁二胺、戊二胺、己二胺、二正辛胺、二正壬胺、二正癸胺中的一种或其混合物。

五、)将步骤四制得的胺解PLLC不对称多孔纳米纤维浸入到浓度为0.005～0.025克/毫升的偶联剂如戊二醛水溶液中，室温反应1～3小时，取出并用水冲洗干净，然后再浸入浓度为0.1～1.0毫克/毫升的生物活性分子，如纤维粘连蛋白Fn溶液中，在2～10℃温度下，反应24小时后，用水浸泡清洗，以使生物活性分子如Fn固定在聚合物纤维表面；

所述的偶联剂是指分子结构中含有两个醛基、异氰酸酯、异硫氰酸酯或环氧基团的化合物。

所述的生物活性分子是指纤维粘连蛋白Fn、胶原、明胶、壳聚糖、RGD、多肽、多聚赖胺酸、氨基酸或其它分子结构中含有胺基的细胞生长因子。

六、)人食道上皮细胞的消化和种植。用镊子将粘膜和粘膜下层从食道组织上剥离，用含100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素B和100μg/ml卡那霉素的磷酸缓冲液浸洗，然后将其浸入50mg/ml Dispase消化液中，37℃下3小时，将上皮层剥离，并剪碎，在10ml含EDTA的胰酶(浓度为0.5wt％)中37℃下消化30分钟，加入等量的DMEM培养基含10％小牛血清以阻止胰酶的活性，1000rpm离心5分钟，弃去上清液，将得到的细胞块分散，种于培养瓶中，于37℃，5％CO₂培养箱中进行培养，DMEM培养基中添加10％小牛血清，上皮生长因子10ng/ml，胰岛素10μg/ml，氢化可的松0.4μg/ml，铁传递蛋白Apo transferrin，5μg/ml，双抗100U/ml和100μg/ml卡那霉素，隔天换液。等细胞增殖至所需数量，将此上皮细胞种于纤维粘连蛋白Fn接枝的PLLC多孔纳米纤维表面，种植密度5-7×10⁴/ml。

七、)食道平滑肌细胞的提取和种植。由于平滑肌细胞本身所具有的较强的移植能力，在此采用自动移植的方法将平滑肌细胞从组织中转移至培养瓶中。从上述同一食道组织中提取少量肌层组织，用含100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素B和100μg/ml卡那霉素的磷酸缓冲液浸洗，将其剪碎成0.5cm大小的小块，直接种植于培养皿底部，加1.0mlDMEM完全培养基(含10％小牛血清，100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素B和100μg/ml卡那霉素)，使其贴附于培养皿底部，隔天补加上述培养基4ml，以 后隔天更换，约一周后可看到平滑肌细胞从组织块中转移至培养皿中，弃去组织块，待细胞增殖至所需数量，将此平滑肌细胞种于纤维粘连蛋白Fn接枝的PLLC趋向纤维层表面，种植密度5-7×10⁴/ml。

八、)将种植了上述上皮细胞、平滑肌细胞的不对称多孔纳米纤维PLLC，放于组织培养级聚苯乙烯的培养板中，于37℃，5％CO₂培养箱中进行培养，培养基为含有10％小牛血清，100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素B和100μg/ml卡那霉素的DMEM完全培养基，每三天换液，培养时间为3-4周，得到同时具有上皮层和肌层的仿生化组织工程食道。

种植的上皮细胞、平滑肌细胞来源于人体食道组织的原代上皮细胞和原代平滑肌细胞或者来源于干细胞诱导分化所得的上皮细胞和平滑肌细胞。

这一仿生化组织工程食道完全模拟人体真实组织的构造制作，适宜作替代物代替人体食道的病变部分，给患者带来福音，减少医疗痛苦。

Claims (5)

1.一种仿生化组织工程食道的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

一、)聚(L-乳酸-Co-己内酯)共聚物(PLLC)，以0.02～0.10克/毫升的浓度溶解在1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇中，制得聚合物溶液；

二、)将上述制得的聚合物溶液，运用电纺织技术进行第一次电纺丝，工作电压为25～45KV，针孔直径为26G，接收器为12cm×12cm的平台，得到纤维直径为50～2000nm，孔径为500～10000nm，孔隙率为15～90％的多孔纤维；

三、)在上述多孔纤维的表面，运用电纺织技术进行第二次电纺丝，工作电压为25～45KV，针孔直径为26G，接收器为高速旋转的滚轴，得到按同一方向有序排列的趋向纤维层，即为不对称多孔纳米纤维；

四、)将上述不对称多孔纳米纤维浸入浓度为0.04～0.10克/毫升的二元胺溶液中，在4～80℃温度下，反应0.01～10小时，然后用无水乙醇阻止反应，用去离子水浸泡清洗以去除多余的二元胺；

五、)将步骤四制得的胺解PLLC不对称多孔纳米纤维，浸入到浓度为0.005～0.025克/毫升的偶联剂溶液中室温反应1～3小时，取出并用水冲洗干净，然后再浸入浓度为0.1～1.0毫克/毫升的生物活性分子溶液中，在2～10℃温度下，反应24小时后，用水浸泡清洗，以使生物活性分子固定在聚合物纤维表面，所述的生物活性分子为纤维粘连蛋白Fn、胶原、明胶、壳聚糖、多肽、氨基酸或其它分子结构中含有胺基的细胞生长因子；

六、)从食道组织上剥离上皮层，消毒、浸洗、剪碎再经消化、培养，至上皮细胞增殖到所需的数量，在上述经生物活性分子接枝的不对称多孔纳米纤维的一面上种植食道上皮细胞，种植密度为1-10×10⁴/cm²；

七、)从食道组织上提取肌层组织，消毒、浸洗、剪碎，在培养皿底部加DMEM培养基培养，等平滑肌细胞增殖到所需的数量，在上述经生物活性分子接枝的不对称多孔纳米纤维有序排列的趋向纤维层上，种植食道平滑肌细胞，种植密度为1-10×10⁴/cm²；

八、)将上述种植有上皮细胞和平滑肌细胞的多孔纳米纤维放在含10％小牛血清及生长因子的DMEM完全培养基中培养3～4周，得到同时具有类似上皮层和肌层的仿生化组织工程食道。

2.根据权利要求1所述的仿生化组织工程食道的制备方法，其特征在于所述的上皮细胞和平滑肌细胞来源于人体食道组织的原代上皮细胞和原代平滑肌细胞或者来源于干细胞诱导分化所得的上皮细胞和平滑肌细胞。

3.根据权利要求1所述的仿生化组织工程食道的制备方法，其特征在于所述的平滑肌细胞来源于人食道组织的原代平滑肌细胞，种植密度为5-7×10⁴/cm²。

4.根据权利要求1所述的仿生化组织工程食道的制备方法，其特征在于第二次电纺丝后得到的不对称多孔纳米纤维的趋向纤维层有2～20层。

5.根据权利要求1所述的仿生化组织工程食道的制备方法，其特征在于所述的二元胺为乙二胺、丙二胺、丁二胺、戊二胺、己二胺、二正辛胺、二正壬胺、二正癸胺中的一种或其混合物。