CN102430155B - 一种蜂窝状丝素蛋白多孔支架及制备方法 - Google Patents

Abstract

一种蜂窝状丝素蛋白多孔支架及制备方法，首先以蚕茧为原料，经脱胶、溶解、透析、冷冻干燥，得到丝素蛋白；接着以植物组织结构的负模氯化钠多孔体为模板，浸渍丝素蛋白溶液，再经室温真空干燥、β化处理、脱盐过程，获得仿生植物组织蜂窝状孔结构的丝素蛋白多孔支架。本发明制备的蜂窝状丝素蛋白多孔支架，孔隙率大于80％、蜂窝状孔孔径范围为50μm～300μm，具有良好的生物相容性、力学性能、降解性能以及物质渗透性等。该支架特别适用于周围神经、肌腱和韧带等具有纵行结构组织的组织工程技术，也可广泛用于体外三维细胞培养。

Description

一种蜂窝状丝素蛋白多孔支架及制备方法

技术领域

本发明属于生物材料领域，尤其涉及周围神经、韧带、肌腱等具有纵行形貌组织的组织工程技术，具体涉及一种仿生植物组织多孔结构的蜂窝状丝素蛋白多孔支架及制备方法。

背景技术

组织工程技术作为一种新兴的再生医学技术，它主要是通过在可生物降解的三维多孔支架材料上种植细胞、继而进行体外/体内培养以实现对缺损组织或器官修复的一类技术。组织工程技术在解决目前临床上组织或器官移植存在的供体来源不足、免疫排斥反应等问题方面给予了厚望。

在组织工程技术中，三维多孔支架材料在很大程度上决定着组织工程技术的成败，它决定着种植细胞的粘附、增殖、分化和生长等行为，进而影响细胞各种功能。为满足组织工程技术对仿生多孔支架的需求，人们已提出多种制备三维多孔支架材料的方法，如发泡法、静电纺丝、相分离法、冷冻干燥法、快速成型法、脱细胞组织法等，这些方法在组织工程技术领域均得到了重视并取得了很大进展。从孔结构看，多孔支架主要包括泡沫状、蜂窝状和纤维状三种，其中蜂窝状孔的制备在技术上更富挑战性。在实际的多孔支架应用中，一方面，大量研究表明，蜂窝状多孔支架可促进细胞-支架共培养期间支架内外的物质交换速度，有利于维持种植于支架内部细胞的正常生长；另一方面，在利用组织工程技术修复周围神经、肌腱和韧带等具有纵行形貌的缺损组织时，即它们呈现由大量平行基膜管构成的蜂窝状结构，必须采用具有与其类似结构的多孔支架才能最大程度地实现组织再生修复和功能恢复。为此，申请人在之前申请的发明专利(申请号为201010602753.1)中，提出一种仿生植物组织蜂窝状孔结构的多孔支架制备方法，并利用该方法制备出聚(乳酸-羟基乙酸)、聚乳酸、聚己内酯或聚羟基乙酸等多孔支架。它们都是人工合成的聚酯类生物高分子材料，具有良好的力学性能、生物可降解性和生物相容性等，然而这些材料自身呈疏水性，并且高分子链中缺乏活性基团，难以进行生物学修饰。为充分利用这一新技术的优势，通过将其扩大适用于生物相容性更好的天然高分子材料，将可为组织工程技术的发展做出贡献。

在各种天然生物高分子材料中，丝素蛋白具有优异的生物相容性、力学性能和生物可降解性，甚至是生物活性。首先，丝素蛋白分子链上具有生物活性位点如由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸组成的RGD序列，可促进细胞粘附与生长；其部分氨基酸序列还可与细胞外基质结合，与细胞产生良性互动[Harkin D G，George K A，Madden P W，et al.Biomaterials，2011，32：2445-2358]。其次，丝素蛋白的降解速度可通过调节β-折叠结构所占比例来控制，并且丝素蛋白降解产物主要为多肽，对细胞和组织生长无任何有害影响，这也是丝素蛋白最为显著的特点。再次，丝素蛋白的强度、韧性和弹性模量与生物体肌腱的接近[王辉，陈雄生，周盛源，等.中国组织工程研究与临床康复，2010，14(34)：6381-6384]。最后，丝素蛋白良好的氧/水渗透性[Talukdar S，Mandal M，Hutmacher D W，et al.Biomaterials，2011，32：2149-2159]，有利于细胞生长。这些优点，使丝素蛋白在韧带、肌腱、周围神经等组织工程技术中呈现出美好的应用前景。目前，丝素蛋白在细胞培养中的应用形式主要是膜、纤维状多孔体和多孔泡沫等[(a)Perry H，Gopinath A，Kaplan D L，et al.Advanced Materials，2008，20：3070-3072；(b)Liu H F，Fan HB，Wang Y，et al.Biomaterials，2008，29：662-674]，鲜见有关蜂窝状孔结构丝素蛋白支架的报道。

因此，制备仿生植物组织蜂窝状孔结构的丝素蛋白多孔支架，不仅可扩大已专利申请(申请号为201010602753.1)中支架制备技术的适用材料种类范围，即应用于天然生物高分子材料，而且丰富了丝素蛋白的应用形式。

发明内容

本发明的目的是在之前(申请号为201010602753.1)的发明专利申请基础之上，通过工艺和技术上的改进，提供一种蜂窝状丝素蛋白多孔支架及制备方法，制备出综合性能更加优异的丝素蛋白多孔支架，制得多孔支架不仅可应用于具有纵行形貌组织的组织工程技术，而且可广泛应用于体外三维细胞培养。

为达到上述目的，本发明的制备方法如下：

1)制备具有植物组织结构的负模氯化钠多孔体；

此多孔氯化钠负模制备为现有技术，详细制备过程见发明专利“一种蜂窝状聚合物基仿生多孔支架材料及制备方法”(申请号为201010602753)；

2)丝素蛋白制备：以蚕茧为原料，经质量分数为0.5％的碳酸钠水溶液煮沸脱胶、无机盐水溶液溶解、透析、冷冻干燥，得到丝素蛋白；

3)将丝素蛋白制成质量分数为5％～15％的非水相溶液，用其浸渍氯化钠多孔体，经室温真空干燥后得到丝素蛋白/盐复合物；

4)将丝素蛋白/盐复合物在促β化溶剂中处理12小时，然后置于30℃的蒸馏水中24小时，在超声或者机械振动辅助下脱除水溶性的氯化钠，每4小时置换一次蒸馏水，最后在30℃下真空干燥获得蜂窝状丝素蛋白多孔支架。

所述的无机盐为硫氰酸锂、溴化锂、硝酸钙或氯化钙。

所述的非水相溶剂为无水甲酸或六氟异丙醇。

所述的促β化溶剂为甲醇、乙醇或异丙醇。

按本发明的制备方法制成的蜂窝状丝素蛋白多孔支架的孔隙率大于80％，孔径范围为50μm～300μm，压缩强度为100kPa。

本发明具有以下优点及有益效果：

1)本发明采用蚕茧为原料制得的丝素蛋白作为支架材料，其生物相容性优异、力学性能良好、降解速率可调且降解产物无毒；此外此原料易得、成本低，可批量制备；

2)制得蜂窝状丝素蛋白多孔支架具有仿生的多孔结构，与生物体中肌腱、韧带和周围神经等组织具有的平行排列的基膜管结构十分相似，具有高度仿真特性，可用于这些组织的组织工程技术。这是除生物组织衍生法外的其他方法无法得到的，同时又避免了生物组织衍生法的免疫原性和潜在的传染病风险；

3)相互连通的蜂窝状孔结构特有的毛细作用与丝素蛋白固有的良好的氧/水渗透性一起，将为细胞培养期间多孔支架内外的物质交换提供保障，有助于解决支架内部细胞易坏死的问题。

4)本发明制备的丝素蛋白多孔支架孔隙率不低于80％，孔径范围为50μm～300μm，压缩强度约100kPa，能满足包括组织工程技术在内的各种体外三维细胞培养的需要。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的做进一步说明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：

1)制备具有植物组织结构的负模氯化钠多孔体，此多孔氯化钠负模制备为现有技术，原始植物模板为紫藤，详细制备过程见发明专利“一种蜂窝状聚合物基仿生多孔支架材料及制备方法”(申请号为201010602753.1)，在此不再赘述；

2)丝素蛋白制备：将蚕茧放入质量分数为0.5％的碳酸钠水溶液中，于90℃搅拌30分钟取出，用蒸馏水洗涤4次，重复这一过程3次，得到脱胶蚕丝；再将其溶解于70℃的氯化钙水溶液中，然后在透析袋中对水透析3天，去除下层沉淀物后进行冻干，即得到丝素蛋白；

3)将丝素蛋白溶于无水甲酸中，制成质量分数为10％的丝素蛋白溶液，用其浸渍氯化钠多孔体，具体浸渍方法如下：将氯化钠多孔体在常压下浸渍于丝素蛋白溶液中0.5小时后置于真空度为-4kPa的环境中，保持1.5小时后将真空度升高至-0.098MPa，保持1小时后恢复常压，取出试样后真空干燥获得丝素蛋白/盐复合物；

4)将丝素蛋白/盐复合物在乙醇中浸泡12小时，随后在30℃蒸馏水中浸泡24小时，在机械振动辅助下脱除水溶性的氯化钠，每4小时置换一次蒸馏水，最后在30℃下真空干燥24小时，获得具有蜂窝状孔结构的丝素蛋白多孔支架。

实施例2：

1)同实施例1的步骤；

2)丝素蛋白制备：将蚕茧放入质量分数为0.5％的碳酸钠水溶液中，于90℃搅拌10分钟取出，用蒸馏水洗涤3次，重复这一过程3次，得到脱胶蚕丝；再将其溶解于65℃的硝酸钙水溶液中，然后在透析袋中对水透析3天，去除下层沉淀物后进行冻干，即得到丝素蛋白；

3)将丝素蛋白溶于六氟异丙醇中，制成质量分数为12％的丝素蛋白溶液，用其浸渍氯化钠多孔体，具体浸渍方法如下：将氯化钠多孔体在常压下浸渍于丝素蛋白溶液中0.5小时后置于真空度为-4kPa的环境中，保持1.5小时后将真空度升高至-0.098MPa，保持1小时后恢复常压，取出试样后真空干燥获得丝素蛋白/盐复合物；

4)将丝素蛋白/盐复合物在甲醇中浸泡12小时，随后在30℃蒸馏水中浸泡24小时，在机械振动辅助下脱除水溶性的氯化钠，每4小时置换一次蒸馏水，最后在30℃下真空干燥获得具有蜂窝状孔结构的丝素蛋白多孔支架。

实施例3：

1)同实施例1的步骤；

2)丝素蛋白制备：将蚕茧放入质量分数为0.5％的碳酸钠水溶液中，于90℃搅拌30min取出，用蒸馏水洗涤4次，重复这一过程3次，得到脱胶蚕丝；再将其溶解于70℃的LiBr水溶液中，然后在透析袋中对水透析3天，去除下层沉淀物后进行冻干，即得到丝素蛋白；

3)将丝素蛋白制成质量分数为5％的无水甲酸溶液中制成丝素蛋白溶液，用其浸渍氯化钠多孔体，具体浸渍方法如下：将氯化钠多孔体在常压下浸渍于丝素蛋白溶液中0.5小时后置于真空度为-4kPa的环境中，保持1.5小时后将真空度升高至-0.098MPa，保持1小时后恢复常压，取出试样后经室温真空干燥得到丝素蛋白/盐复合物；

4)将丝素蛋白/盐复合物在异丙醇中处理12小时，然后置于30℃的蒸馏水中24小时，在超声辅助下脱除水溶性的氯化钠，每4小时置换一次蒸馏水，最后在30℃下真空干燥获得具有蜂窝状孔结构的丝素蛋白多孔支架。

实施例4：

1)同实施例1的步骤；

2)丝素蛋白制备：将蚕茧放入质量分数为0.5％的碳酸钠水溶液中，于90℃搅拌30分钟取出，用蒸馏水洗涤4次，重复这一过程3次，得到脱胶蚕丝；再将其溶解于40℃的硫氰酸锂水溶液中，然后在透析袋中对水透析3天，去除下层沉淀物后进行冻干，即得到丝素蛋白；

3)将丝素蛋白制成质量分数为15％的无水甲酸溶液中制成丝素蛋白溶液，用其浸渍氯化钠多孔体，具体浸渍方法如下：将氯化钠多孔体在常压下浸渍于丝素蛋白溶液中0.5小时后置于真空度为-4kPa的环境中，保持1.5小时后将真空度升高至-0.098MPa，保持1小时后恢复常压，取出试样后经室温真空干燥得到丝素蛋白/盐复合物；

4)将丝素蛋白/盐复合物在乙醇中处理12小时，然后置于30℃的蒸馏水中24小时，在超声辅助下脱除水溶性的氯化钠，每4小时置换一次蒸馏水，最后在30℃下真空干燥获得具有蜂窝状孔结构的丝素蛋白多孔支架。

Claims (5)

1.一种蜂窝状丝素蛋白多孔支架的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1）制备具有植物组织结构的负模氯化钠多孔体；

2）丝素蛋白制备：以蚕茧为原料，经质量分数为0.5%的碳酸钠水溶液煮沸脱胶、无机盐水溶液溶解、透析、冷冻干燥，得到丝素蛋白；

3）将丝素蛋白制成质量分数为5%～15%的非水相溶液，用其浸渍氯化钠多孔体，经室温真空干燥后得到丝素蛋白/盐复合物；

4）将丝素蛋白/盐复合物在促β化溶剂中处理12小时，然后置于30℃的蒸馏水中24小时，在超声或者机械振动辅助下脱除水溶性的氯化钠，每4小时置换一次蒸馏水，最后在30℃下真空干燥获得蜂窝状丝素蛋白多孔支架。

2.根据权利要求1所述的一种蜂窝状丝素蛋白多孔支架的制备方法，其特征在于：所述的无机盐为硫氰酸锂、溴化锂、硝酸钙或氯化钙。

3.根据权利要求1所述的一种蜂窝状丝素蛋白多孔支架的制备方法，其特征在于：所述的非水相溶液为无水甲酸或六氟异丙醇。

4.根据权利要求1所述的一种蜂窝状丝素蛋白多孔支架的制备方法，其特征在于：所述的促β化溶剂为甲醇、乙醇或异丙醇。

5.一种如权利要求1所述的制备方法制成的蜂窝状丝素蛋白多孔支架，其特征在于：该支架的孔隙率大于80%，孔径范围为50μm～300μm，压缩强度为100kPa。