CN109806443A - 骨支架材料及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及骨组织工程支架材料领域，公开了骨支架材料及其制备方法和应用。一种骨支架材料的制备方法，其中，该方法包括以下步骤：(A)将生物相容性材料进行3D直写打印，制成骨支架结构；(B)将得到的骨支架结构进行成型、干燥和改性处理，得到骨支架材料，其中，所述生物相容性材料，以材料的总重量为基准，含有12‑26重量％的羟基磷灰石、3‑16重量％的丝素蛋白、0.5‑2重量％的海藻酸钠和65‑75重量％的水。制备的骨支架材料具有耐水性和较高的压缩强度，本发明整个制备过程在室温条件下进行，并且未使用对身体有害的有机溶剂，具有良好的生物活性和生物相容性，制备方法简便。

Description

骨支架材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及骨组织工程支架材料领域，具体涉及高强度骨支架材料及其制备方法和应用。

背景技术

骨缺损修复一直是临床骨科难题，骨组织工程学的发展为骨缺损修复提供了新思路。骨组织工程支架在体内除起结构支撑作用外，还起着细胞粘附、生长、繁殖以及为组织再生和塑性提供场所的作用，因此骨组织工程支架材料要具有良好的生物相容性、可降解性和骨传导性；具有一定的机械强度和韧性；具有适当的孔隙结构满足细胞在材料表面的增殖和分化要求。目前骨组织工程支架材料的研究主要集中在无机材料、高分子材料和复合材料三方面。在无机材料中，羟基磷灰石是人体骨骼和牙齿的主要组成部分，具有良好的生物相容性，能与人体骨骼相结合并诱导新骨的形成，是目前常用的硬组织材料。但单一的羟基磷灰石在应用中存在脆性大，材料的抗弯强度低等缺陷，这限制了其在骨组织工程领域中的应用，因此常将其与金属、陶瓷、聚合物组合成复合材料。羟基磷灰石与金属复合存在金属腐蚀、在骨移植体界面可能形成密集纤维组织和应力屏蔽问题；羟基磷灰石与陶瓷复合后，仍存在脆性大，断裂特性比人骨差等缺陷；而羟基磷灰石与聚合物复合具有无需二次手术取出，机械强度逐渐衰减，不抑制骨骼生长，无金属腐蚀引发的组织反应等优点，是目前研究的热点。

CN1546180A公开了一种无机/有机可降解复合多孔支架材料及制备方法，其特征在于它在降解聚合物和磷酸三钙中添加有非烧结、低结晶度纳米羟基磷灰石，使材料中无机和有机成分的降解吸收速度均可控。该工艺步骤是采用碾混方法制得纳米羟基磷灰石和β-磷酸三钙的组合物，将其加入到可降解聚合物溶液中超声处理得到混合液，再通过溶剂浇铸-颗粒滤沥工艺制得复合多孔支架材料。该专利中使用了非水溶性的降解聚合物聚D、L-乳酸PDLLA、聚L-乳酸PLLA、聚乙醇酸PGA、聚己内酯PCL中的任意一种及多种共混物或共聚物，需要有机溶剂将其溶解，故在制备过程中需除去对人体有害的有机溶剂，在生物性能方面还无法达到令人满意的效果。

水溶性天然高分子材料与无机材料复合制备支架材料可克服制备支架过程中引进有毒的溶剂损害材料生物活性，不利于细胞粘附、分化、增殖等缺点，但该复合材料的力学性能差制约着它的发展。为提高无机材料与天然高分子材料的力学性能，研究者开始采用原位合成法合成无机/天然高分子复合材料，该方法可有效改善无机有机两相之间的界面相容性，提高界面结合力，从而改善支架材料的力学性能。CN101474429B首先采用原位合成法合成羟基磷灰石-丝素蛋白混合泥浆，随后将其与丝素蛋白溶液混合均匀，注入模具冷冻干燥得到支架材料。该发明的支架材料与现有共混法直接制备的羟基磷灰石-丝素蛋白复合支架相比，具有良好的力学性能，其压缩强度可到350KPa左右。CN1843515A采用冷冻干燥法制备的纳米羟基磷灰石/丝素蛋白/壳聚糖复合支架，该支架材料的抗压强度为0.85-1.85MPa。文献Bioactive macro/micro porous silk fbroin/nano-sized calciumphosphate scaffolds with potential for bone-tissue-engineering applications,Nanomedicine,2013,8(3),359–378采用原位合成法合成了丝素蛋白与磷酸钙的复合材料，并采用溶盐致孔法与冷冻干燥法相结合的方法制备了具有大孔与微孔结构的丝素蛋白与纳米磷酸钙复合支架。溶盐致孔法与冷冻干燥法相结合制备的支架具有高度互通的大孔，且孔隙分布均匀，但该支架的压缩强度为0.62MPa，压缩强度较小，会为后续操作带来不便。为进一步增强骨支架材料的强度，CN104043149A和CN105688283A分别公开了采用在磷酸钙骨水泥中加入羟基磷灰石-丝素蛋白复合物和使用碱改性的不同PH值的丝素蛋白溶液作为固化剂改善陶瓷骨水泥支架强度。研究表明当羟基磷灰石-丝素蛋白复合物的添加量为3％时强度最大达到50.2±1.9MPa；经碱处理的改性丝素溶液作为固化液加入到磷酸钙骨水泥中，最终固化压缩强度在固化液pH为7-8.5时有显著提升，当固化液的pH值在8.5时，强度达到54.35±1.4MPa。随着生物材料的开发与制备工艺的改进，人工骨架材料的强度有所改善，但其强度仍不能满足临床需求。

目前天然高分子材料与无机材料复合支架多采用冷冻干燥法、溶盐致孔法和模具浇铸法制备，存在制备时间冗长、模具制备成本高、孔径大小及形状不易控制等缺点。

CN105342731A公开了一种比格犬脊髓定向通道支架及其制备方法。该发明首先根据比格犬脊髓神经结构设计比格犬脊髓定向通道支架3D模型，将脊髓定向通道支架3D模型导入3D生物打印机中，用3D打印机快速低温成型形成脊髓定向通道支架，将制备的脊髓定向通道置于-20℃低温冷冻干燥成型。该方法是利用材料低温成型特性在低温下迅速凝固，堆积成目标物。该方法对成型温度要求较高，增加了骨支架材料的制备难度和制备成本，并且采用冷冻干燥法成型的样品强度低，会对后续操作带来不便。

CN102274544A和CN102499794A通过三维打印机喷洒生物胶粘剂的粘结陶瓷颗粒的方法，实现了人工骨支架材料的制备。但该方法胶粘剂喷洒量的控制难度较高，不能实现力学性能精确控制；在长期运行过成中，胶粘剂有可能影响3D打印机的部件；也没有充分考虑到材料的生物相容性。

综上所述，在现有技术中，制备骨支架材料过程中存在使用对身体有害的有机溶剂、制备成本高、不能实现力学性能精准控制，在常用运行过程中，打印机容易损坏。而且，制备的骨支架材料压缩强度低、不具有良好的生物相容性的问题。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的骨支架材料压缩强度低，大多为60MPa以下、含有有机溶剂、制备成本高等问题，提供高强度骨支架材料及其制备方法和应用。本发明整个制备过程在室温条件下进行，并且未使用对身体有害的有机溶剂；本发明采用操作简便，对环境、温度等要求不高的3D直写打印技术将上述复合材料逐层打印，打印的样品经2％的氯化钙水溶液固化成型、75％乙醇溶液处理后，具有耐水性和超高压缩强度，且压缩后样品无损坏。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供了一种骨支架材料的制备方法，其中，该方法包括以下步骤：

(A)将生物相容性材料进行3D直写打印，制成骨支架结构；

(B)将得到的骨支架结构进行成型、干燥和改性处理，得到骨支架材料，

其中，所述生物相容性材料，以材料的总重量为基准，含有12-26重量％的羟基磷灰石、3-16重量％的丝素蛋白、0.5-2重量％的海藻酸钠和65-75重量％的水。

优选地，所述生物相容性材料的制备方法包括：将15-32.5重量份的丝素蛋白和羟基磷灰石的复合材料、0.5-2重量份的海藻酸钠、2-8重量份的丝素蛋白和65-75重量份的水进行混合、搅拌。

优选地，所述丝素蛋白和羟基磷灰石的复合材料含有10-30重量％的丝素蛋白和70-90重量％的羟基磷灰石；所述丝素蛋白和羟基磷灰石的复合材料包括丝素蛋白基底，以及在所述基底上生长的多个羟基磷灰石纳米棒，其中，单根纳米棒的长度为200-500nm，直径为10-30nm。

优选地，所述丝素蛋白和羟基磷灰石的复合材料的制备方法包括以下步骤：

(1)将脱胶的丝素蛋白与蛋白溶解剂进行接触，得到含有溶解的丝素蛋白的溶液；其中，所述蛋白溶解剂包含氯化钙、乙醇和水；

(2)将溶解的丝素蛋白与磷酸氢二铵水溶液进行反应，并将反应体系调为碱性，将反应产物进行洗涤、冷冻干燥，得到丝素蛋白和羟基磷灰石的复合材料。

本发明第二方面提供了上述的方法制备的骨支架材料，其中，所述骨支架材料含有59-77重量％的羟基磷灰石、19-36重量％的丝素蛋白和3-5重量％的海藻酸钠；该骨支架材料具有100-150MPa的压缩强度。

本发明第三方面提供了上述的骨支架材料在骨组织工程中的应用。

本发明通过在羟基磷灰石的合成过程加入脱胶后的丝素，得到丝素蛋白和羟基磷灰石的复合材料。该复合材料中的羟基磷灰石为棒状结构聚集在丝素蛋白基底上，能有效改善有机无机两相之间的界面相容性，提高界面结合力。所述的丝素蛋白是由丙氨酸、丝氨酸、络氨酸等18种氨基酸组成的纤维蛋白，具有生物相容性，可降解性，有利于细胞粘附、扩散和分化，适用于组织工程支架材料。丝素蛋白在该制备过程中能够起到两种作用：一方面为纳米棒状羟基磷灰石的生长提供基底；另一方面丝素蛋白起到粘结剂的作用。

本发明通过使用海藻酸钠，利用海藻酸钠的无毒性、具有生物相容性和生物活性、生物可降解性、水溶性、营养物质容易扩散渗透、可塑性等特点。从而在制备骨支架材料过程中起到增稠和增塑的作用，能够避免引入对人体有害的、不具有生物相容性的有机溶剂。

本发明在室温条件下，采用磁力搅拌的方式将素蛋白与羟基磷灰石复合材料、丝素蛋白、海藻酸钠和去离子水混合均匀，没有改变三者的化学结构，维持了材料的原有特性。

本发明通过使用3D直写打印技术将共混的多种材料逐层打印得到所需的样品。直写打印具有耗时短、成本低、可控制支架的孔隙大小、形状及其连通性，且该技术对温度、环境的要求不高，操作简单，克服了选择性激光烧结、熔融沉积、光固化成型、三维打印法等其他3D打印技术中加工成本高、原料受限制、需经后处理强化等缺点。本发明的生物相容性材料更利于3D直写打印出无需煅烧强化的高强度骨支架材料，而且3D直写打印方法简单易行，整个过程在室温条件下进行，对温度、环境要求不苛刻。

在本发明中，3D直写打印的骨支架结构经2％氯化钙水溶液浸泡定型后海藻酸钠变为海藻酸钙，使其失去水溶性。骨支架结构经氯化钙处理，干燥后，浸渍到75％的乙醇溶液中，使丝素蛋白变性，样品自然干燥后具有抗水溶性和超高的压缩强度，压缩强度可以达到100MPa以上，达到皮质骨要求。

附图说明

图1a是本发明的2万放大倍数下的复合材料的扫描电镜照片；

图1b是本发明的8万放大倍数下的复合材料的扫描电镜照片；

图2是本发明的丝素蛋白和羟基磷灰石复合材料、购买的纯羟基磷灰石的XRD图；

图3是丝素蛋白和羟基磷灰石复合材料、羟基磷灰石、丝素蛋白的红外谱图；

图4a是本发明的实施例1的田字格骨支架材料的照片；

图4b是不同孔径的空心圆柱体骨支架材料的照片；

图4c是不同高度的空心圆柱体骨支架材料的照片；

图5是本发明的实施例1的骨支架材料的扫描电镜图；

图6是本发明的实施例1的骨支架材料的压缩应变与压缩强度图。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明第一方面提供了一种骨支架材料的制备方法，其中，该方法包括以下步骤：

(A)将生物相容性材料进行3D直写打印，制成骨支架结构；

(B)将得到的骨支架结构进行成型、干燥和改性处理，得到骨支架材料，

其中，所述生物相容性材料，以材料的总重量为基准，含有12-26重量％的羟基磷灰石、3-16重量％的丝素蛋白、0.5-2重量％的海藻酸钠和65-75重量％的水。

根据本发明的方法，所述生物相容性材料的制备方法包括：将15-32.5重量份的丝素蛋白和羟基磷灰石的复合材料、0.5-2重量份的海藻酸钠、2-8重量份的丝素蛋白和65-75重量份的水进行混合、搅拌。

根据本发明的方法，所述丝素蛋白和羟基磷灰石的复合材料含有10-30重量％的丝素蛋白和70-90重量％的羟基磷灰石；所述丝素蛋白和羟基磷灰石的复合材料包括丝素蛋白基底，以及在所述基底上生长的多个羟基磷灰石纳米棒，其中，单根纳米棒的长度为200-500nm，优选为300-400nm，直径为10-30nm，优选为20-30nm，该丝素蛋白和羟基磷灰石的复合材料的扫描电镜图如图1a和图1b所示、丝素蛋白和羟基磷灰石的复合材料与购买的纯羟基磷灰石的XRD图如图2所示，丝素蛋白和羟基磷灰石的复合材料、羟基磷灰石、丝素蛋白的红外谱图如图3所示。

根据本发明的方法，所述丝素蛋白和羟基磷灰石的复合材料的制备方法包括以下步骤：

(1)将脱胶的丝素蛋白与蛋白溶解剂进行接触，得到含有溶解的丝素蛋白的溶液；其中，所述蛋白溶解剂包含氯化钙、乙醇和水；

(2)将溶解的丝素蛋白与磷酸氢二铵水溶液进行反应，并将反应体系调为碱性，将反应产物进行洗涤、冷冻干燥，得到丝素蛋白和羟基磷灰石的复合材料。

所述脱胶的丝素蛋白是将质量分数为0.5％的碳酸钠溶液加热至微沸，随后加入蚕丝，用玻璃棒搅拌0.5h，脱胶后用大量去离子水冲洗，重复上述工作进行二次脱胶处理，脱胶完成后进行晾干。

根据本发明的方法，在蛋白溶解剂中，氯化钙、乙醇和水的摩尔比可以为1:(1.8-2.2):(7.5-8.5)，例如可以为1:2:8。

根据本发明的方法，所述脱胶的丝素蛋白与蛋白溶解剂的重量比可以为1:(8-32)。

根据本发明的方法，在步骤(1)中，所述接触的温度以使脱胶的丝素蛋白溶解于三元体系中为目的，例如可以为但不限于55-80℃。

根据本发明的方法，在步骤(2)中，以溶解的丝素蛋白中含有的Ca元素计，以磷酸氢二铵水溶液中的P元素计，磷酸氢二铵水溶液的用量满足Ca/P摩尔比为(1.65-1.69):1，例如可以为1.67:1。

根据本发明的方法，所述碱性的pH值可以为9-10，优选地，使用氨水进行pH值调节。

根据本发明的方法，所述反应的时间可以为但不限于3-24h。

根据本发明的方法，在步骤(2)中，所述洗涤的溶剂可以为去离子水，将产物洗至中性。

在本发明中，该生物相容材料保持了原材料自有的性质和结构。具有良好的生物活性和生物相容性、可降解性、无毒等特点。

在本发明中，上述的生物相容性材料的制备方法可以为但不限于：将上述的复合材料、海藻酸钠、丝素蛋白和水进行混合、搅拌。

在本发明中，上述的生物相容性材料的制备方法可以在室温下进行，对温度、环境要求不苛刻，而且还保证了原材料自有的性质和结构。

根据本发明的方法，所述3D直写打印又称为3D逐层打印。打印机的运动通过多轴的移动平台控制(EFD公司生产，型号为2400)，打印参数通过气动的流体点胶系统(EFD公司生产，型号为Ultimus I)进行设定。直写打印具有耗时短、成本低、可控制支架的孔隙大小、形状及其连通性，且该技术对温度、环境的要求不高，操作简单，克服了选择性激光烧结、熔融沉积、光固化成型、三维打印法等其他3D打印技术中加工成本高、原料受限制、需经后处理强化等缺点。

根据本发明的方法，打印的形状和尺寸以目标产物而定，例如可以为空心圆柱体、田字格形状等。例如图4a为田字格形状，图4b和图4c为不同孔径、不同高度的空心圆柱体。

根据本发明的方法，在步骤(B)中，所述成型的过程包括将骨支架结构在第一溶液中浸泡。

根据本发明的方法，所述第一溶液为含有Ca²⁺的无机盐水溶液，优选地，所述第一溶液为氯化钙水溶液，进一步优选为浓度为2％的氯化钙水溶液。骨支架结构在浓度为2％的氯化钙水溶液中浸泡后，海藻酸钠变为海藻酸钙，使其失去水溶性。

根据本发明的方法，浸泡时间可以为0.5-24h，优选为0.5-4h。

根据本发明的方法，在步骤(B)中，所述干燥可以为但不限于自然干燥和冷却干燥。在优选的情况下，所述干燥为自然干燥。

根据本发明的方法，在步骤(B)中，所述改性的过程包括：将干燥后的骨支架结构在第二溶液中浸泡。优选地，所述第二溶液为乙醇，进一步优选为浓度为75％的乙醇溶液。干燥后的支架结构在75％的乙醇溶液中浸渍后，丝素蛋白变性，样品自然干燥后具有抗水溶性和高压缩强度。

根据本发明的方法，浸泡时间可以为0.5-24h，优选为0.5-4h。

本发明第二方面提供了上述的方法制备的骨支架材料，其中，所述骨支架材料含有59-77重量％的羟基磷灰石、19-36重量％的丝素蛋白和3-5重量％的海藻酸钠；该骨支架材料具有100-150MPa的压缩强度。

在本发明中，该骨支架材料经过100-150MPa的压缩强度测试之后，该骨支架材料完好无损。

在本发明中，该骨支架材料可以为任意大小、任意形状，例如可以为图4a、4b、4c所示，骨支架材料可以完全按照需要进行制备，无特别限定，增加了可操作性和实用性。

本发明第三方面提供了上述的骨支架材料在骨组织工程中的应用。

例如作为假肢的外骨、骨缺陷支架、骨修复材料等。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

在以下实施例中，氯化钙、磷酸氢二铵和海藻酸钠均购自国药集团化学试剂有限公司。

制备例1

制备丝素蛋白：

在烧杯配制1500ml质量分数为0.5％的碳酸钠溶液，加热至溶液微沸，加入15g蚕丝，用玻璃棒搅拌0.5h，用去离子水冲洗直至不粘滑，重复上述过程进行二次脱胶，脱胶后自然晾干。称取脱胶后的重量。随后将13.8g脱胶丝素蛋白加入到摩尔比为1：2：8的氯化钙、乙醇、水的三元体系中，恒温60℃溶解2h，溶解后加入1.5倍去离子水(提前加热到60℃)，冷却至室温，用滤膜过滤，装入透析袋透析3-5天。

制备例2

制备丝素蛋白和羟基磷灰石的复合材料(SF-HAP)

将15g蚕丝经质量分数为0.5％的碳酸钠溶液(温度为90℃)浸泡0.5h后、用去离子水冲洗；重复上述工作进行二次脱胶，脱胶完成后，自然晾干，得到脱胶后的丝素蛋白。称取3.25g的脱胶后的丝素蛋白溶于36.5ml的温度为60℃的摩尔比为1：2：8的氯化钙、乙醇、水的三元体系中；待脱胶后的丝素蛋白完全溶解后，将温度调到75℃，逐滴加入磷酸氢二铵水溶液。磷酸氢二铵水溶液的加入量满足：以氯化钙中的Ca元素计，以磷酸氢二铵水溶液中的P元素计，磷酸氢二铵水溶液的用量满足Ca/P为1.67的摩尔比。随着不断加入磷酸氢二铵水溶液，溶液出现白色浑浊物，用氨水调pH至10；反应24h后，将产物水洗至中性，冷冻干燥，得到丝素蛋白和羟基磷灰石的复合材料(SF-HAP)。

将该复合材料(SF-HAP)在扫描电镜(购自日本电子公司，型号为JSM-7500)下进行观察，如图1a和1b所示，由电镜照片可知在丝素蛋白基底上生成了长为400nm，宽为24nm的棒状羟基磷灰石。

将SF-HAP与购买的纯羟基磷灰石(HAP)在XRD(购自荷兰帕纳科公司，型号为Empyrean)进行表征，如图2所示，由XRD图可知SF-HAP的峰位置与HAP的峰位置相同，说明生成了羟基磷灰石。

将SF-HAP与HAP、丝素蛋白(SF)进行红外(购自赛默飞世尔科技公司，型号为iS10)表征，如图3所示，由图可知SF-HAP的红外谱图中具有HAP的特征峰也有SF的特征峰，说明生成了SF-HAP复合材料。其中1053cm^-1、602cm^-1和563cm^-1对应的是磷酸根的特征峰；1641cm^-1、1520cm^-1与1234cm^-1对应的是丝素蛋白特征峰。

实施例1

(1)制备生物相容性材料

称取0.5g丝素蛋白(制备例1得到)溶于16g的水中，随后加入0.4g的海藻酸钠，待海藻酸钠溶解后，加入5g丝素蛋白和羟基磷灰石的复合材料(制备例2得到)，室温条件下搅拌，待丝素蛋白与羟基磷灰石复合材料分散均匀，得到生物相容性材料A。

(2)制备骨支架材料

在打印机(打印机的运动通过多轴的移动平台控制(EFD公司生产，型号为2400)，打印参数通过气动的流体点胶系统(EFD公司生产，型号为Ultimus I)进行设定)上编写10mm(长)×10mm(宽)×4mm(高)的田字格程序，将步骤(1)得到的生物相容性材料装入针筒中，离心排空气；在压力为15Psi，线度为8mm/s条件下进行3D直写打印，制成骨支架结构。

将得到的骨支架结构在2％的氯化钙水溶液中浸泡4h，成型后，自然干燥，将干燥后的骨支架用75％乙醇浸泡4h后取出，得到骨支架材料，如图4(a)所示。

(3)压缩强度测试

将骨支架材料在扫描电镜(购自日本电子公司，型号为JSM-7500)下进行表征，扫描电镜图如图5所示，说明得到了紧密的骨支架材料。

骨支架材料通过电子万能材料试验机(购自英斯特朗公司，型号为INSTRON 3365)进行压缩测试，测得的压缩强度为128MPa，且经压缩测试后，样品没有被损坏，压缩应变与压缩强度的关系如图6所示。

实施例2

按照实施例2的方法，不同的是，使用生物相容性材料B。生物相容性材料B的制备方法为：

称取2g丝素蛋白(制备例1得到)溶于20g的水中，随后加入0.4g的海藻酸钠，待海藻酸钠溶解后，加入5g丝素蛋白和羟基磷灰石的复合材料(制备例2得到)，室温条件下搅拌，待丝素蛋白与羟基磷灰石复合材料分散均匀，得到生物相容性材料B。

按照实施例1的方法对骨支架材料进行压缩测试，测得的压缩强度为130MPa，且经压缩测试后，样品没有被损坏。

实施例3

按照实施例1的方法，不同的是，使用生物相容性材料C。生物相容性材料C的制备方法为：

称取1g丝素蛋白(制备例1得到)溶于12g的水中，随后加入0.2g的海藻酸钠，待海藻酸钠溶解后，加入5g丝素蛋白和羟基磷灰石的复合材料(制备例2得到)，室温条件下搅拌，待丝素蛋白与羟基磷灰石复合材料分散均匀，得到生物相容性材料C。

按照实施例1的方法对骨支架材料进行压缩测试，测得的压缩强度为100MPa，且经压缩测试后，样品没有被损坏。

对比例1

按照实施例1的方法，不同的是，使用生物相容性材料D1。生物相容性材料D1的制备方法为：

称取0.4g丝素蛋白(制备例1得到)溶于12g的水中，随后加入0.01g的海藻酸钠，待海藻酸钠溶解后，加入5g丝素蛋白和羟基磷灰石的复合材料(制备例2得到)，室温条件下搅拌，待丝素蛋白与羟基磷灰石复合材料分散均匀，得到生物相容性材料D1。

按照实施例1的方法对骨支架材料进行压缩测试，测得的压缩强度为51MPa，且经压缩测试后，样品有损坏。

对比例2

按照实施例1的方法，不同的是，使用生物相容性材料D2。生物相容性材料D2的制备方法为：

称取20g的水中，随后加入0.4g的海藻酸钠，待海藻酸钠溶解后，加入6g丝素蛋白和羟基磷灰石的复合材料(制备例2得到)，室温条件下搅拌，待丝素蛋白与羟基磷灰石复合材料分散均匀，得到生物相容性材料D2。

按照实施例1的方法对骨支架材料进行压缩测试，测得的压缩强度为60MPa，且经压缩测试后，样品有损坏。

对比例3

按照实施例1的方法，不同的是，生物相容性材料为D3。生物相容性材料D3的制备方法为：

称取0.5g丝素蛋白(制备例1得到)溶于16g的水中，随后加入0.4g的海藻酸钠，待海藻酸钠溶解后，加入5g纳米针状羟基磷灰石(北京德科岛金科技有限公司购买)，室温条件下搅拌，待分散均匀，得到生物相容性材料D3。

按照实施例1的方法对骨支架材料进行压缩测试，测得的压缩强度为45MPa，且经压缩测试后，样品有损坏。

对比例4

按照实施例1的方法，不同的是，生物相容性材料D4为0.8g海藻酸钠与10g水，室温条件下搅拌，分散均匀。

按照实施例1的方法对骨支架材料进行压缩测试，测得的压缩强度为0.3MPa，且经压缩测试后，样品有损坏。

对比例5

按照实施例1的方法，不同的是，生物相容性材料D5为5g丝素蛋白和羟基磷灰石的复合材料(制备例2得到)与16g水，室温条件下搅拌，分散均匀。

按照实施例1的方法对骨支架材料进行压缩测试，测得的压缩强度为49MPa，且经压缩测试后，样品有损坏。

通过上述实施例和对比例的结果可以看出，采用本发明方法制备的对骨支架材料具有明显更好的压缩强度，可以达到100MPa以上，而且测试之后骨支架材料没有损坏。而未采用本发明的生物相容性材料，或者没有按照本发明的含量进行制备，得到的骨支架材料的压缩强度明显不好，在较低的测试压力下就会损坏。

本发明整个制备过程在室温条件下进行，并且未使用对身体有害的有机溶剂，通过组合使用丝素蛋白与羟基磷灰石复合材料、丝素蛋白、海藻酸钠，并限定其含量关系，从而制备的骨支架材料具有生物相容性和生物活性、生物可降解性、水溶性、营养物质容易扩散渗透、可塑性等优点。

本发明的生物相容性材料更利于3D直写打印出无需煅烧强化的高强度骨支架材料，整个过程在室温条件下进行，对温度、环境要求不苛刻。

以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种骨支架材料的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(A)将生物相容性材料进行3D直写打印，制成骨支架结构；

(B)将得到的骨支架结构进行成型、干燥和改性处理，得到骨支架材料，

其中，所述生物相容性材料，以材料的总重量为基准，含有12-26重量％的羟基磷灰石、3-16重量％的丝素蛋白、0.5-2重量％的海藻酸钠和65-75重量％的水。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述生物相容性材料的制备方法包括：将15-32.5重量份的丝素蛋白和羟基磷灰石的复合材料、0.5-2重量份的海藻酸钠、2-8重量份的丝素蛋白和65-75重量份的水进行混合、搅拌。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述丝素蛋白和羟基磷灰石的复合材料含有10-30重量％的丝素蛋白和70-90重量％的羟基磷灰石；所述丝素蛋白和羟基磷灰石的复合材料包括丝素蛋白基底，以及在所述基底上生长的多个羟基磷灰石纳米棒，其中，单根纳米棒的长度为200-500nm，直径为10-30nm。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述丝素蛋白和羟基磷灰石的复合材料的制备方法包括以下步骤：

(1)将脱胶的丝素蛋白与蛋白溶解剂进行接触，得到含有溶解的丝素蛋白的溶液；其中，所述蛋白溶解剂包含氯化钙、乙醇和水；

(2)将溶解的丝素蛋白与磷酸氢二铵水溶液进行反应，并将反应体系调为碱性，将反应产物进行洗涤、冷冻干燥，得到丝素蛋白和羟基磷灰石的复合材料。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，在蛋白溶解剂中，氯化钙、乙醇和水的摩尔比为1:(1.8-2.2):(7.5-8.5)；

优选地，所述脱胶的丝素蛋白与蛋白溶解剂的重量比为1:(8-32)；

优选地，在步骤(1)中，所述接触的温度为55-80℃。

6.根据权利要求4所述的方法，其中，在步骤(2)中，以溶解的丝素蛋白中含有的Ca元素计，以磷酸氢二铵水溶液中的P元素计，磷酸氢二铵水溶液的用量满足Ca/P摩尔比为(1.65-1.69):1；

优选地，所述碱性的pH值为9-10；

优选地，所述反应的时间为3-24h。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(B)中，所述成型的过程包括将骨支架结构在第一溶液中浸泡；优选地，所述第一溶液为含有Ca²⁺的无机盐水溶液，优选地，所述第一溶液为氯化钙水溶液；浸泡时间为0.5-24h，优选为0.5-4h。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(B)中，所述改性的过程包括：将干燥后的骨支架结构在第二溶液中浸泡；优选地，所述第二溶液为乙醇；浸泡时间为0.5-24h，优选为0.5-4h。

9.权利要求1-8中任意一项所述的方法制备的骨支架材料，其中，所述骨支架材料含有59-77重量％的羟基磷灰石、19-36重量％的丝素蛋白和3-5重量％的海藻酸钠；

该骨支架材料具有100-150MPa的压缩强度。

10.权利要求9所述的骨支架材料在骨组织工程中的应用。