CN105412984A - 一种负载蛋白的3d组织工程支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种负载蛋白的3D组织工程支架及其制备方法，具体地，本发明公开的组织工程支架包括以下组分：((i)复合载体；(ii)大分子蛋白类药物；和(iii)3D打印基体。本发明所述的组织工程支架不仅能保持负载蛋白较高的活性，有利于负载蛋白的长效释放，还具有很好的孔连通性和机械性能，因此，具有广泛的应用前景。

Description

一种负载蛋白的3D组织工程支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及组织工程支架领域，具体地，涉及一种负载蛋白的3D组织工程支架及其制备方法。
背景技术
骨组织缺损的修复一直是骨科临床面临的重要难题。据不完全统计，我国每年骨缺损患者超过500万人，骨组织缺损与损伤已成为影响人们健康和生活的一种重要疾病。目前，较大区域的骨缺损需要采用骨移植的方法进行治疗。骨修复材料的活性普遍欠佳，加上人体创伤部位自身成骨相关生长因子表达缓慢及表达量的严重不足，常常导致材料植入后过慢的细胞识别和组织愈合，难以满足临床的需求。因此，开发新型高活性的骨组织修复材料/植入体，具有十分重要的社会和现实意义。
材料结构的优化和生长因子的负载是提高骨修复材料活性的有效手段。对于前者，近年来的研究主要集中在天然骨多级结构的仿生设计与构建。而对于生长因子而言，BMP-2、VEGF、FGF等的诱导成骨活性已经被充分肯定，但是在临床应用过程中也存在体内生物活性低、使用剂量大、价格昂贵等突出问题。研究表明，高活性固载BMP-2以及BMP-2在骨缺损部位的“长效保留和控释”是确保活性支架成骨活性发挥的前提和关键。
由于过程简单、打印效率高、材料孔结构容易调控等优点，3D生物打印技术已经被广泛应用于组织工程支架的制备，为骨修复支架材料的制备提供了新的手段。然而，在3D打印过程中，经常使用有机溶剂或者在高温熔融状态下快速成型，这对打印过程中生长因子的活性负载提出了挑战。
因此，本领域迫切需要开发一种适用于3D打印、并且能够保持所负载的生长因子活性的组织工程支架。
发明内容
本发明的目的是提供一种适用于适用于3D打印、并且能够保持所负载的生长因子活性的组织工程支架。
本发明第一方面提供了一种3D的组织工程支架，所述组织工程支架包括以下组分：
(i)复合载体，所述复合载体包括：羧甲基壳聚糖和介孔二氧化硅；
(ii)大分子蛋白类药物；和
(iii)3D打印基体。
在另一优选例中，所述组分(i)和组分(ii)共同组成了复合载药体系。
在另一优选例中，所述羧甲基壳聚糖经3-缩水甘油醚三甲氧基硅烷接枝到所述介孔二氧化硅的表面。
在另一优选例中，3-缩水甘油醚三甲氧基硅烷一端的环氧基团与羧甲基壳聚糖分子中的氨基相互反应，另一端的三甲氧基硅烷基团与介孔二氧化硅表面的硅羟基相互反应，从而将羧甲基壳聚糖接枝到所述介孔二氧化硅的表面，得到复合载体。
在另一优选例中，所述介孔二氧化硅的孔径为10-50nm，较佳地为20-40nm。
在另一优选例中，所述介孔二氧化硅的比表面积为300-1400m2/g。
在另一优选例中，所述介孔二氧化硅的比表面积为400-100m2/g，较佳地为450-700m2/g。
在另一优选例中，所述介孔二氧化硅粒子为大介孔二氧化硅粒子，孔径为20-50nm，比表面积为400-1400m2/g。
在另一优选例中，所述介孔二氧化硅粒子的孔径为10-20nm，比表面积为300-1000m2/g，其孔道具有典型无序介孔结构，孔径分布较小。
在另一优选例中，所述介孔二氧化硅与所述羧甲基壳聚糖的质量比为1:0.1-5，较佳地，1:0.5-1，更佳地，1：0.8-1。
在另一优选例中，所述羧甲基壳聚糖的分子量为5×104-5×105g/mol，较佳地，9×104-5×105g/mol，更佳地，1×105-4×105g/mol。
在另一优选例中，所述羧甲基壳聚糖的脱乙酰度为60％-98％，较佳地，70％-98％，更佳地，85％-96％，最佳地，90％-95％。
在另一优选例中，所述大分子蛋白类药物的重量与所述复合载体的重量比为0.005-0.200:1，较佳地，0.01-0.15:1，更佳地，0.05-0.1:1。
在另一优选例中，所述大分子蛋白类药物的分子量5×103-2×105g/mol，较佳地，8×103-1×105g/mol，更佳地，2×104-8×104g/mol，最佳地，4×104-6×104g/mol。
在另一优选例中，所述大分子蛋白类药物选自下组：骨形态发生蛋白(BMP)(如BMP-2)、牛血清白蛋白(BSA)、辣根过氧化物酶(HRP)、细胞色素C、溶菌酶、胃蛋白酶、或其组合。
在另一优选例中，所述大分子蛋白类药物装载于所述介孔二氧化硅上。
在另一优选例中，所述大分子蛋白类药物为颗粒直径为1-50nm的多肽和蛋白质类药物，较佳地，2-40nm，更佳地，1-50nm，更佳地，2-40nm，最佳地，10-30nm。
在另一优选例中，所述3D打印基体选自下组：磷酸钙骨水泥(CPC)、聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)、聚癸二酸甘油酯-肉桂酰氯/β-磷酸三钙(PGS-2CinA/β-TCP)、聚乙烯醇(PVA)、热塑性聚氨酯弹性体(TPU)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物(ABS树脂)、或其组合。
在另一优选例中，所述组分(i)、组分(ii)和组分(iii)的重量比为0.05-1：0.005-0.2：10-1000，较佳地，0.1-1：0.01-0.15：10-100，更佳地，0.2-1：0.05-0.1：20-50。
另一优选例中，所述组分(i)、组分(ii)和组分(iii)在所述组织工程支架中占的重量比为20％-100％，较佳地，50％-100％，更佳地，80％-100％，最佳地，90％-100％。
在另一优选例中，所述复合载体(或复合载药体系)为pH响应型复合载体(或pH响应型复合载药体系)。
在另一优选例中，所述pH响应型复合载体(或复合载药体系)指具有超大孔径和孔容，可以负载大分子蛋白类药物，同时还能有效维持所负载蛋白的活性，实现大尺寸蛋白类药物的装载及pH控制释放的复合载体(或复合载药体系)。
在另一优选例中，所述组织工程支架为多孔结构。
在另一优选例中，所述组织工程支架为三维多孔结构。
在另一优选例中，所述组织工程支架的孔径为100-2000μm，较佳地，200-1000μm，更佳地，300-800μm。
在另一优选例中，所述组织工程支架的纤维直径40-2000μm，较佳地，100-1000μm，更佳地，300-500μm。
在另一优选例中，所述组织工程支架的形状选自下组：立方体、圆柱体、哑铃型、中空型、组织器官形态(如颅骨组织或下颚缺损部分)、或其组合。
在另一优选例中，所述组织工程支架为多层纤维结构。
在另一优选例中，所述组织工程支架为固化的。
在另一优选例中，所述组织工程支架采用溶剂法进行打印。
在另一优选例中，所述组织工程支架具有以下一种或多种特性：
(i)孔连通性,具有三维贯通大孔结构，孔径可在100-2000μm的范围内变化；
(ii)机械性能，压缩模量0.14-6.4Mpa，断裂伸长率2％-20％；
(iii)良好的生物相容性。
本发明第二方面提供了一种用于3D打印的打印混合物，包括：
(i)复合载体，所述复合载体包括：羧甲基壳聚糖和介孔二氧化硅；
(ii)大分子蛋白类药物；和
(iii)3D打印基体。
在另一优选例中，所述羧甲基壳聚糖经3-缩水甘油醚三甲氧基硅烷接枝到所述介孔二氧化硅的表面。
在另一优选例中，所述3D打印基体选自下组：磷酸钙骨水泥(CPC)、聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)、聚癸二酸甘油酯-肉桂酰氯/β-磷酸三钙(PGS-2CinA/β-TCP)、或其组合。
在另一优选例中，所述大分子蛋白类药物为骨形态发生蛋白(BMP)(如BMP-2)、牛血清白蛋白(BSA)、辣根过氧化物酶(HRP)、细胞色素C、溶菌酶、胃蛋白酶等。
在另一优选例中，所述组分(i)、组分(ii)和组分(iii)的重量比为0.05-1：0.005-0.2：10-1000，较佳地，0.1-1：0.01-0.15：10-100，更佳地，0.2-1：0.05-0.1：20-50。
在另一优选例中，所述大分子蛋白类药物的重量与所述复合载体的重量比为0.005-0.200:1，较佳地，0.01-0.15:1，更佳地，0.05-0.1:1。
在另一优选例中，所述组分(i)、组分(ii)和组分(iii)的重量占所述打印混合物总重量的100％。
本发明第三方面提供了一种3D的组织工程支架的制法，包括步骤：
(a)提供一个本发明第二方面所述的打印混合物；
(b)将上述打印混合物用于3D打印，形成预成型的组织工程支架；
(c)使得步骤(b)所得到的预成型的组织工程支架固化，形成本发明第一方面所述的3D的组织工程支架。
在另一优选例中，所述步骤(c)中在50％-100％的湿度环境下进行，较佳地，60-100％，更佳地，80％-100％，最佳地，100％。
在另一优选例中，所述步骤(c)在低温环境下打印。
在另一优选例中，所述低温环境为0-50℃，较佳地，10-40℃，更佳地，20-30℃。
在另一优选例中，在步骤(c)中，在固化粘结液作用下，所述预成型的组织工程支架进行固化反应得到本发明第一方面所述的3D的组织工程支架。
在另一优选例中，在步骤(c)中，所述固化粘结液选自下组：水、乙醇、二氯甲烷、或其组合。
在另一优选例中，在步骤(c)中，反应时间为0.05-72小时，较佳地，0.1-1小时，更佳地，0.2-0.5小时。
在另一优选例中，所述打印支架层高为线宽的50-100％，较佳地，60-100％，更佳地，80-100％。
在另一优选例中，所述喷射速率为0.0001-0.01mm/s，较佳地，0.001-0.008mm/s，更佳地，0.002-0.005mm/s。
本发明第四方面提供了一种本发明第二方面所述打印混合物的用途，用于制备所述的3D的组织工程支架。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为介孔泡沫MCF的(a)TEM图、(b)氮气等温吸附-脱附图和(c)孔径分布图。
图2为羧甲基壳聚糖改性介孔泡沫(MCF-NOCC)表征结果图，其中(a)为TEM图，(b)为氮气等温吸附-脱附图和(c)为傅里叶红外光谱图。
图3为负载BMP-2的磷酸钙骨水泥/羧甲基壳聚糖改性介孔泡沫支架(CPC/MCF-NOCC)的数码照片及SEM照片。
图4为负载BMP-2的聚乳酸/羧甲基壳聚糖改性介孔泡沫支架(PLA/MCF-NOCC)的数码照片及SEM照片。
图5为负载BMP-2的聚己内酯/羧甲基壳聚糖改性介孔泡沫支架(PCL/MCF-NOCC)的数码照片及SEM照片。
图6为负载BMP-2的聚癸二酸甘油酯-肉桂酰氯/β-磷酸三钙/羧甲基壳聚糖改性介孔泡沫支架(PGS-2CinA/β-TCP/MCF-NOCC)的数码照片及SEM照片。
图7为骨形态发生蛋白-2(BMP-2)从支架中释放的曲线图。
图8为从支架中释放的BMP-2的圆二色谱图。
图9为碱性磷酸酶活性(ALP)的检测结果图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外的开发了一种3D的组织工程支架，其包括(i)复合载体；(ii)大分子蛋白类药物；和(iii)3D打印基体。将(i)、(ii)和(iii)以一定比例混合，采用溶剂法的3D打印技术形成的组织工程支架不仅能保持负载蛋白较高的活性，有利于负载蛋白的长效释放，还具有很好的孔连通性和机械性能。
壳聚糖及N,O-羧甲基壳聚糖
壳聚糖(Chitosan，(1,4)-2-氨基-2-脱氧-a-D-葡聚糖)是由甲壳素经过脱乙酰化得到的线性黏多糖，而且其来源广泛，价格低廉，易改性，具有良好的生物相容性，生物降解性和药物作用。
N,O-羧甲基壳聚糖(NOCC)是将壳聚糖羧甲基化改性后的产物，使其具有更好的水溶性及水溶液稳定性。
本发明中所述的“羧甲基壳聚糖”即为“N,O-羧甲基壳聚糖”。
本发明中，所述羧甲基壳聚糖的分子量为5×104-5×105g/mol，较佳为9×104-5×105g/mol，更佳为1×105-4×105g/mol。
本发明中，所述羧甲基壳聚糖的脱乙酰度为60％-98％，较佳为70％-98％，更佳为85％-96％，甚至90％-95％。
大介孔二氧化硅粒子
根据孔径分类，典型的大介孔材料孔径约在10-50nm，如介孔泡沫氧化硅材料(Mesostructurecellularfoam，MCF)或对圣芭芭拉非晶材料(SBA-15)进行扩孔等。这类材料的特点是孔径很大(10-50nm)，比表面积高，孔道不规则。
本发明中所述的“大介孔”是指介孔孔径为10-50nm的介孔，优选为20-50nm的介孔。大介孔二氧化硅粒子是指介孔孔径为10-50nm优选为20-50nm的介孔二氧化硅粒子。
介孔泡沫氧化硅材料是一种具有超大孔径(20-50nm)且孔分布窄、孔体积大(1.0-2.4cm3/g)、比表面积高(1000m2/g)、孔道之间能通过窗口(9-22nm)连接的泡沫结构的新型材料，被认为是目前孔径最大的介孔材料。特别是三维互通的孔道，十分有利于装载分子的扩散，而超大孔体积有效保证了高效装载量，同时还具有无毒、生物兼容性好等特点，使MCF用于药物、蛋白质、酶等大分子富集-固载-递送的领域内越来越受到重视。
SBA-15是硅基介孔分子筛的一种，由于具有高度有序的六边形直孔结构，孔径在10-50nm可调，孔道直径分布均一，比表面大，壁厚且水热稳定性很高，所以SBA-15在大分子蛋白类药物载体方面有广泛的应用前景。
大介孔硅基材料的孔道大多暴露在表面，并且具有大量的硅羟基，非常有利于有机硅烷的修饰，从而在孔口连接可以依据环境条件改变而改变自身状态的基团，进而调节孔口的开放/关闭状态，使大介孔硅基材料的孔道在体内特定物理或化学刺激存在的条件下打开，实现对包埋药物的定点可控释放。基于此，以大介孔硅基材料为基体构建由环境条件控制的响应释放体系，在高毒副作用药物，如癌症的化疗药物、治疗耐药性疾病或慢性病的药物，特别是大分子蛋白类药物的负载及释放方面具有很大的应用价值。
复合载体
本发明的复合载体，包括介孔二氧化硅粒子和羧甲基壳聚糖，所述羧甲基壳聚糖经3-缩水甘油醚三甲氧基硅烷接枝到所述介孔二氧化硅粒子的表面。
具体地，所述羧甲基壳聚糖用3-缩水甘油醚三甲氧基硅烷进行修饰，其中羧甲基壳聚糖分子与3-缩水甘油醚三甲氧基硅烷通过环氧基团与氨基反应而连接。修饰后的材料与大介孔二氧化硅材料反应，大介孔二氧化硅材料表面与3-缩水甘油醚三甲氧基硅烷通过Si-O-Si键连接得到复合载体。
本发明中，所述介孔二氧化硅与所述羧甲基壳聚糖的质量比为1:0.1-5，较佳为0.5-1。
本发明的复合载体，具有超大孔径及孔容，以及三维互通的孔道结构，不仅可以作为承载大分子蛋白类药物的理想载体，同时还具有良好的生物相容性，克服了传统介孔硅基载体孔道尺寸上的局限，为大尺寸的蛋白类药物的装载及响应型定点释放提供了新的选择。
复合载药体系
本发明提供的pH响应型羧甲基壳聚糖/大介孔二氧化硅纳米复合载药体系，包括本发明的复合载体和大分子蛋白类药物。
本发明中，所述大分子蛋白类药物的重量与所述复合载体的重量之比为0.005-0.200:1，较佳为0.01-0.15:1，更佳地为0.05-0.1:1。
本发明的pH响应型羧甲基壳聚糖/大介孔二氧化硅纳米复合载药体系，用于制备大分子蛋白类药物的载体，以及用于大尺寸药物的定点可控释放。
本发明的复合载药体系实现对大分子蛋白类药物的高活性装载及pH控制释放，解决了大分子蛋白类药物的装载与定点释放难题，为这类药物提供新的给药途径，避免了口服、注射等传统给药方式带来的高毒副作用，且该复合载体具有很好的生物相容性能。
本发明中，大分子蛋白药物是相对于小分子药物，如相对于地塞米松(分子量392)等而言，指的是分子量在5×103-2×105g/mol之间的蛋白药物。
3D的组织工程支架及其制备
本发明所述的“3D的组织工程支架”为能够保持负载蛋白高活性、且有利于负载蛋白长效释放的支架。在本发明中，3D的组织工程支架中所负载蛋白的释放速率及蛋白活性与组分(i)和(ii)的种类和数量直接相关。
在本发明中，所述3D的组织工程支架含有以下组分：
(i)复合载体，所述复合载体包括：羧甲基壳聚糖和介孔二氧化硅；
(ii)大分子蛋白类药物；和
(iii)3D打印基体。
其中，所述羧甲基壳聚糖经3-缩水甘油醚三甲氧基硅烷接枝到所述介孔二氧化硅的表面。
在一优选实施方式中，所述大分子蛋白类药物选自下组：骨形态发生蛋白(BMP)(如BMP-2)、牛血清白蛋白(BSA)、辣根过氧化物酶(HRP)、细胞色素C、溶菌酶、胃蛋白酶、或其组合。
在一优选实施方式中，所述3D打印基体选自下组：磷酸钙骨水泥(CPC)、聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)、聚癸二酸甘油酯-肉桂酰氯/β-磷酸三钙(PGS-2CinA/β-TCP)、或其组合。
在本发明中，所述组分(i)、(ii)和(iii)之间的重量比决定了组织工程支架所负载蛋白活性的稳定性。所述组分(i)、(ii)和(iii)之间的重量比没有特别的限制，一种典型的重量比为0.1-1：0.005-0.2：10-1000，较佳地，0.05-1：0.01-0.15：10-100，更佳地，0.2-1：0.05-0.1：20-50。一种优选的重量比为，当组分(i)、(ii)和(iii)之间的重量比为0.2-1：0.05-0.1：20-50时，组织工程支架所负载蛋白活性的稳定性最为显著。
本发明所述的组织工程支架可以为三维多孔结构，所述孔径的大小没有特别的限制，一种典型的孔径为100-2000μm，较佳地，200-1000μm，更佳地，300-800μm。一种优选的孔径为300-500μm，并且孔的形状没有特别的限制，一种典型的孔的形状为正三角形、斜三角形、四方形、六方形、菱形、或其组合。一种优选的孔的形状为四方形孔。
在本发明中，打印的纤维直径没有特别限制。一种典型的纤维直径为40-2000μm，较佳地，100-1000μm，更佳地，300-500μm。一种优选的直径为300—500μm。
在本发明中，打印支架层高△hn没有特别限制。一种典型的打印支架层高△hn为线宽的50-100％，较佳地，60-100％，更佳地，80-100％。一种优选的打印支架层高△hn为线宽的80-100％。
在本发明中，所述3D组织工程支架用如下方法制备：
(a)提供一个打印混合物(含有复合载体、大分子蛋白类药物和3D打印基体)
(b)将上述打印混合物用于3D打印，形成预成型的组织工程支架；
(c)在固化粘结液(如水、乙醇、二氯甲烷)作用下，使得步骤(b)所得到的预成型的组织工程支架固化，形成本发明第一方面所述3D的组织工程支架。
在一优选实施方式中，所述3D组织工程支架用如下方法制备：
(1)将大分子蛋白类药物分散在水中，加入孔泡沫氧化硅材料(MCF)粉末，室温负载0.5-4h，离心后，置于冻干机中冻干，得到负载蛋白的MCF。
(2)在塑料瓶中将羧甲基壳聚糖(NOCC)配置成一定溶度的水溶液，加入3-缩水甘油醚三甲氧基硅烷(GPTMS)，将3-缩水甘油醚三甲氧基硅烷接到羧甲基壳聚糖的分子链上得到复合物。
(3)步骤2)得到的复合物与负载蛋白的介孔泡沫反应，所述羧甲基壳聚糖经3-缩水甘油醚三甲氧基硅烷接枝到所述介孔泡沫的表面，得到所述复合蛋白载体。
(4)该步骤3)得到的复合蛋白载体与打印基体混合后低温打印，在固化粘结液(如水、乙醇、二氯甲烷)作用下，最终得到本发明第一方面所述3D组织工程支架。
本发明制备的3D组织工程支架具有良好的孔连通性和机械性能，而且大分子蛋白类药物直接在3D打印过程中加入到支架中，有利于大分子蛋白类药物的长效释放和维持其高活性。
打印混合物
如本文所用，所述“打印混合物”为油墨混合物，指由打印机分配的任意材料，并可包括落入本发明保护范围内的任意化合物或混合物。
在一优选实施方式中，所述“打印混合物”包括：
(i)复合载体，所述复合载体包括：羧甲基壳聚糖和介孔二氧化硅；
(ii)大分子蛋白类药物；和
(iii)3D打印基体。
在一优选实施方式中，所述“打印混合物”还可以包括细胞、材料增强剂、光催化剂等。
应用
本发明所述的3D组织工程支架可以用于多种组织或器官的修复和再生，所述组织包括：较硬的软骨组织、骨组织、牙齿和较柔软的血管、肌肉组织。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明通过溶剂法的生物3D低温打印技术，采用复合载体、大分子蛋白类药物和3D打印基体混合打印的方法，得到的3D组织工程支架能够保持负载蛋白的活性、有利于大分子蛋白类药物的长效释放。
(2)本发明的3D组织工程支架具有具有良好的孔连通性和机械性能。
(3)本发明的3D组织工程支架能够快速固化成型。
(4)本发明的3D组织工程支架具有与缺损部位完全匹配的形貌和结构。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1
溶胶-凝胶法制备介孔泡沫材料MCF
将10ml质量分数为37％的浓盐酸与65ml超纯水加入反应容器中混合均匀，并保持40℃水浴。
然后将4g聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物(P123)缓慢加入混合液中并剧烈搅拌约1h，至其完全溶解，此时溶液为澄清状态。
溶解完全后，向混合物中加入4g三羟甲基丙烷(TMP)，保持40℃水浴搅拌2h。之后，逐滴加入9.2ml正硅酸乙酯(TEOS)并强烈搅拌，加料完毕后再继续搅拌5min。
第一阶段加料完成，将体系在40℃水浴中陈化20h。然后加入46mgNH4F，轻微搅拌使其溶解。
第二阶段加料完成，去掉烧杯或离心瓶中上层清液，将剩余产物倒入高压反应釜，放入100℃恒温箱，保持恒温24h。
水热反应完毕后，将反应产物离心(8000rp/m，10min)，水洗、醇洗各两遍，置于60℃恒温箱中烘干。
最后，将烘干后的产物置于马弗炉中900℃煅烧6h，得到白色粉末1-MCF。
采用透射电子显微镜、氮气等温吸附-脱附等对材料的微观结构、形貌特征进行观察，并通过BET计算材料的比表面积和孔容。
结果如图1所示。
从图1a中可以看出MCF样品具有三维连通的泡沫状孔道结构，并且其孔道排列是无序的，但在一定程度上也表现出均一的笼状孔。孔径约在30-40nm，远大于其他有序介孔材料，且其边缘区域孔道结构大多不完整，孔道外露，非常开放。
图1b氮气等温吸附-脱附表明，该材料相对压力P/P0为0.4-0.90范围有H1型迟滞环，同样说明样品存在介孔结构。在P/P0<0.5的分压内没有明显氮气吸附，在高分压区(P/P0>0.5)可观察到明显的吸附段，说明材料具有很大的孔径。迟滞现象的迟滞环底部的相对压力值较大，约为0.8，这也说明样品孔径较大，毛细管凝聚现象发生的压力较高。如图1c所示，材料的孔径大小为39.5nm，采用BET计算材料的比表面积为624m2/g，孔容为2.01cm3/g。
实施例2
N,O-羧甲基壳聚糖改性介孔泡沫(MCF-NOCC)载体的制备
配制质量分数为0.5％的NOCC水溶液，然后在塑料瓶中将20mlNOCC水溶液与0.5毫升3-缩水甘油醚三甲氧基硅烷(GPTMS)混合，搅拌2h后置于冰箱中过夜，制得改性羧甲基壳聚糖NOCC-GPTMS。
过夜后，将0.5g实施例1中制备的MCF加入过夜的液体中，室温搅拌6-8h。反应完毕后将产物离心(8000rp/m，10min)，并用超纯水冲洗2遍。最后将所得产物MCF-NOCC置于冻干机中冻干。
如图2中(a)所示，在TEM图中，经改性后MCF泡沫状孔道结构未发生太大变化。从图中观察到笼状孔尺寸和孔道连通性也得到保持，但孔道结构清晰度下降，纳米粒子表面存在覆盖层，表明NOCC成功改性到MCF表面。
由图2中(b)氮气等温吸附-脱附等温线可以看出，滞后环几乎消失，且BET计算的比表面积为64.2m2/g，相比MCF的比表面积大大降低。表明在此过程中材料的表面介孔被NOCC所覆盖，介孔孔道消失。
由图2中(c)的傅里叶红外光谱图中可以看出，除了有分别代表Si-O-Si键的不对称伸缩振动和对称伸缩振动峰(分别为1091.4cm-1、802cm-1)，还在2856cm-1和2936cm-1处出现吸收峰，这是C-C键所特有的吸收峰，这一新出现的特征峰说明MCF材料表面接枝上了含C-C键的有机物NOCC，即已被NOCC成功改性。
实施例3
复合载药体系的制备
将0.1gMCF分散于2ml超纯水中并超声，同时将2mgBMP-2溶解于4mL超纯水中并搅拌。
将分散均匀的MCF加入BMP-2溶液中，并于室温下搅拌4h，得到载BMP-2的MCF。
然后加入实施例2中的NOCC改性后的过夜液体，继续搅拌6-8h。
反应完毕后，将产物离心分离(8000rp/m，10min)，并用超纯水冲洗2遍。
最后，将所得产物置于冻干机中冻干，制得MCF-NOCC-BMP-2样品。
实施例4
负载BMP-2蛋白的磷酸钙骨水泥/羧甲基壳聚糖改性介孔泡沫支架的3D生物打印
磷酸钙骨水泥(CPC，上海瑞邦生物材料有限公司)粉末气流粉碎，过400目筛。将CPC与实施例3制得的MCF-NOCC-BMP-2粉末均匀混合后，过400目筛。使用电机助推式微注射器多喷头自由成型系统(简称，3D打印机)，以CPC和MCF-NOCC-BMP-2的混合物为原料，水为固化粘结液，3D打印制备支架。具体打印参数为：喷射速度0.001-0.006mm/s，喷嘴直径0.26-0.52mm，打印支架层高△hn为线宽的80％-100％。将制备得到的预成型支架放置于37℃，100％湿度环境中进行水化固化反应72h，得到最终的CPC/MCF-NOCC/BMP-2支架。如图3所示，支架具有规则的孔道结构，孔道连通性良好，分布均匀，外形规则。扫描电镜照片显示，支架孔道规则，表面粗糙，孔径约300μm，纤维直径约400μm。层间排布均匀，结合良好，无分裂和塌陷现象。
实施例5
负载BMP-2蛋白的聚乳酸/羧甲基壳聚糖改性介孔泡沫支架的3D生物打印
将实施例3制得的MCF-NOCC-BMP-2粉末过400目筛。聚乳酸(PLA)溶解在二氯甲烷中，并将过筛后的粉末加入聚乳酸的二氯甲烷溶液。使用机械搅拌，持续搅拌至粉末混合均匀，且混合物成较粘稠状，加入3D打印机的料筒中，调节打印参数，进行3D打印制备支架。具体打印参数为：喷射速度0.001-0.006mm/s，喷嘴直径0.26-0.52mm，打印支架层高△hn为线宽的80％-100％。在得到最终的PLA/MCF-NOCC/BMP-2支架。如图4所示，支架具有规则的孔道结构，孔道连通性良好，分布均匀，外形规则。扫描电镜照片显示，支架孔道整体规则，有流动状突起，表面有少量颗粒状突起。孔径约500μm，纤维直径约600μm。层间排布均匀，结合良好，无分裂和塌陷现象。
实施例6
负载BMP-2蛋白的聚己内酯/羧甲基壳聚糖改性介孔泡沫支架的3D生物打印
将实施例3制得的MCF-NOCC-BMP-2粉末过400目筛。聚己内酯(PCL)溶解在二氯甲烷中，并将过筛后的粉末加入聚己内酯的二氯甲烷溶液。使用机械搅拌，持续搅拌至粉末混合均匀，且混合物成较粘稠状，加入3D打印机的料筒中，调节打印参数，进行3D打印制备支架。具体打印参数为：喷射速度0.001-0.006mm/s，喷嘴直径0.26-0.52mm，打印支架层高△hn为线宽的80％-100％。在得到最终的PCL/MCF-NOCC/BMP-2支架。如图5所示，支架具有规则的孔道结构，孔道连通性良好，分布均匀，外形规则。扫描电镜照片显示，支架孔道规则，表面光滑，有少量颗粒状突起。孔径约500μm，纤维直径约500μm。层间排布均匀，结合良好，无分裂和塌陷现象。
实施例7
负载BMP-2蛋白的聚癸二酸甘油酯-肉桂酰氯/β-磷酸三钙/羧甲基壳聚糖改性介孔泡沫支架的3D生物打印
取20.2g癸二酸和9.2g丙三醇(甘油)加入三口烧瓶(各0.1mol)，加热至130℃，在氩气保护下反应24h，得到聚癸二酸甘油酯的预聚体。将聚癸二酸甘油酯预聚体溶解在30ml无水二氯甲烷中，通氮气3h，加入20mg的4-二甲基氨基吡啶，将装置冷却到0℃，滴加三乙胺0.79ml，再将溶解在二氯甲烷中的2氯-肉桂酰氯1.96g滴加进去。继续反应24h，加30ml乙酸乙酯，旋蒸干燥，得到聚癸二酸甘油酯-肉桂酰氯预聚体。
将聚癸二酸甘油酯-肉桂酰氯预聚体溶解在乙醇中，加入过400目筛的β-TCP和实施例3制得的MCF-NOCC-BMP-2粉末。使用机械搅拌，持续搅拌至粉末混合均匀，且混合物成较粘稠状(乙醇已大部分挥发)，加入3D打印机的料筒中，调节打印参数，进行3D打印制备支架。具体打印参数为：喷射速度0.001-0.006mm/s，喷嘴直径0.26-0.52mm，打印支架层高△hn为线宽的80％-100％。在得到最终的PGS-2cinA/β-TCP/MCF-NOCC/BMP-2支架。如图6所示，支架具有规则的孔道结构，孔道连通性良好，分布均匀，外形规则。扫描电镜照片显示，支架孔道规则，表面较为粗糙。孔径约800μm，纤维直径约700μm。层间排布均匀，结合良好，有少许坍塌现象。
对比例
负载BMP-2蛋白的聚癸二酸甘油酯-肉桂酰氯/β-磷酸三钙支架的3D生物打印
取20.2g癸二酸和9.2g丙三醇(甘油)加入三口烧瓶(各0.1mol)，加热至130℃，在氩气保护下反应24h，得到聚癸二酸甘油酯的预聚体。将聚癸二酸甘油酯预聚体溶解在30ml无水二氯甲烷中，通氮气3h，加入20mg的4-二甲基氨基吡啶，将装置冷却到0℃，滴加三乙胺0.79ml，再将溶解在二氯甲烷中的2氯-肉桂酰氯1.96g滴加进去。继续反应24h，加30ml乙酸乙酯，旋蒸干燥，得到聚癸二酸甘油酯-肉桂酰氯预聚体。
将聚癸二酸甘油酯-肉桂酰氯预聚体溶解在乙醇中，加入过400目筛的β-TCP粉末。使用机械搅拌，持续搅拌至粉末混合均匀，且乙醇挥发较完全，混合物成较粘稠状，与BMP-2溶液一起加入3D打印机的料筒中，调节打印参数，进行3D打印制备支架。具体打印参数为：喷射速度0.001-0.006mm/s，喷嘴直径0.26-0.52mm，打印支架层高△hn为线宽的80％-100％。在得到最终的PGS-2cinA/β-TCP/BMP-2支架。孔径约800μm，纤维直径约700μm。
测定实施例1
BMP-2从支架(如PGS-2cinA/β-TCP/MCF-NOCC/BMP-2)中的体外释放性能
分别取实施例4-7和对比例中制备的3D组织工程支架，置于10ml玻璃瓶中，每组样品取3个。
向每组样品中分别加入pH6.0的tris-HCl溶液2ml，置于37℃震荡箱中持续震荡，震荡速度设定为100rpm。释放至少持续30天。
在每个特定时间点，取20μl取样溶液，用BCA蛋白试剂盒检测溶液中的蛋白浓度。以负载BMP-2的PGS-2cinA/β-TCP支架作为对照组。
以时间为X轴，累积释放量为Y轴作图，得到图7。
BMP-2从实施例7制备的支架释放的结果如图7所示。
结果表明，BMP-2从实施例7制备的组织工程支架中的释放较为平缓，没有明显的突释，30天释放出大概55％的负载蛋白；对比例制备的组织工程支架，BMP-2的释放相对较快，30天释放了大概70％的总负载蛋白。
在上述相同条件下，实施例4-6的负载蛋白释放率与实施例7相似，30天释放出大概30-50％的负载蛋白。
测定实施例2释放出的蛋白的构象检测
将释放出来的BMP-2以及BMP-2原液配置成10μg/ml的待测溶液。圆二色谱的扫面范围设置为190nm-260nm，重复扫描三次取平均值。选择光径为0.2cm的比色皿，放入样品池中，点击―开始―扫描空气背景。取出比色皿，向比色皿中加入400μLtris-HCl溶液(分散液)，放入样品池中，并减去空气背景，扫描分散液背景。取出比色皿，倒掉tris-HCl溶液，用待测样品反复润洗比色皿，最后加入400μL待测样品，扣除tris-HCl溶液背景，扫描样品谱图。最后所得即为样品的圆二色谱谱图。圆二色谱随机附带的CDNN软件可用来分析圆二色谱谱图中所对应的α-螺旋结构和β-折叠/β-转角结构。
结果如图8所示。结果表明，从实施例7制备的支架中释放的BMP-2的圆二色谱图与负载前BMP-2的结果保持较好，而从对比例制备的支架中释放的BMP-2的圆二色谱图像与负载前BMP-2的结果相差较大。
用上述相同条件，测得实施例4-6支架中释放的BMP-2的圆二色谱图与实施例7释放的BMP-2的圆二色谱图相似，与负载前BMP-2的结果保持较好。
测定实施例3释放出的蛋白活性检测
BMP-2在体外细胞试验中具有促进BMSCs骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的能力。
BMP-2的蛋白活性可以通过BMSCs的碱性磷酸酶活性(ALP)来定量检测。
选择实施例7制备的PGS-2cinA/β-TCP/MCF-NOCC支架(实验组)和对比例制备的PGS-2cinA/β-TCP支架(对照组)中释放的BMP-2，以及BMP-2原液，检测其生物活性。将所收集的BMP-2释放液使用无菌过滤膜过滤灭菌，用培养基稀释到指定浓度与细胞共培养。
将BMSCs细胞以1.2×104/孔的密度接种在96孔板上，于37℃、5％CO2的培养箱培养1天，并用PBS清洗两次。
将BMP-2待测溶液以1μg/mL的浓度分散在细胞培养液中。以原BMP-2溶液配成1μg/mL的浓度作为阳性对照组，另外做5组空白样作为阴性对照组，加入200μl培养液。同时接2块板置于37℃、5％CO2的培养箱培养4天、7天。
培养结束后，小心吸掉培基，用PBS润洗一次，每孔加入50μlNP-40(细胞裂解液)，置于37℃恒温震荡箱1h。每组的5个平行样中，分别从每个孔中吸取2μl(共10μl)清液于一块新的96孔板中，并加入10μlPBS，以及200μlBCA试剂，置于37℃恒温箱中30min，使用酶标仪在562nm下测OD值，计算总蛋白量。
同时，向细胞裂解液中100μl/孔，2.5％的PNPP-NaALP底物显色液，避光置于37℃恒温箱中1h。
最后加入100μl/孔，0.1MNaOH终止显色反应，用酶标仪测定波长为405nm的OD值。
通过公式ALP＝OD值/时间/总蛋白含量(mg)计算碱性磷酸酶活性，进而比较释放前后的BMP-2蛋白活性。
结果如图9所示。结果表明，相对于阳性对照BMP-2，从PGS-2cinA/β-TCP/MCF-NOCC支架中释放出来的BMP-2的ALP活性几乎没有变化，但从PGS-2cinA/β-TCP支架中释放出来的BMP-2的ALP活性有明显下降，4天和7天的ALP活性仅为阳性对照组的40％左右，与空白对照组接近。说明对照组的BMP-2的活性下降非常明显，而实验组的BMP-2的生物活性保持的比较好。
测定实施例4机械性能测试
将实施例4-7得到的3D打印组织工程支架分为4组，每组选取三个试样进行力学测试，取平均值。
在实际应用中，材料的压缩模量越大，说明材料越坚硬，越难以被压缩，常用于需要力学支撑的地方，比如硬骨组织修复等；而材料的断裂伸长率越大，说明材料柔韧性好，常用于软组织或软骨等的修复。
结果如表1所示。结果显示，实施例4-6得到的3D打印组织工程支架具有较高的压缩模量，可用于硬组织的修复应用，而实施例7得到的组织工程支架具有较高的断裂伸长率，可用于软骨等组织的修复应用。
结果表明，本发明可以根据需求打印出不同性能的3D的组织工程支架，并且所得到的3D打印组织工程支架具有优良的机械性能。
表1
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种3D的组织工程支架，其特征在于，所述组织工程支架包括以下组分：
(i)复合载体，所述复合载体包括：羧甲基壳聚糖和介孔二氧化硅；
(ii)大分子蛋白类药物；和
(iii)3D打印基体。
2.如权利要求1所述的3D的组织工程支架，其特征在于，所述羧甲基壳聚糖经3-缩水甘油醚三甲氧基硅烷接枝到所述介孔二氧化硅的表面。
3.如权利要求1所述的3D的组织工程支架，其特征在于，所述介孔二氧化硅与所述羧甲基壳聚糖的质量比为1:0.1-5，较佳地，1:0.5-1，更佳地，1：0.8-1。
4.如权利要求1所述的3D的组织工程支架，其特征在于，所述大分子蛋白类药物的重量与所述复合载体的重量比为0.005-0.200:1，较佳地，0.01-0.15:1，更佳地，0.05-0.1:1。
5.如权利要求1所述的3D的组织工程支架，其特征在于，所述组分(i)、组分(ii)和组分(iii)的重量比为0.05-1：0.005-0.2：10-1000，较佳地，0.1-1：0.01-0.15：10-100，更佳地，0.2-1：0.05-0.1：20-50。
6.如权利要求1所述的3D的组织工程支架，其特征在于，所述组织工程支架为多孔结构。
7.一种用于3D打印的打印混合物，其特征在于，包括：
(i)复合载体，所述复合载体包括：羧甲基壳聚糖和介孔二氧化硅；
(ii)大分子蛋白类药物；和
(iii)3D打印基体。
8.如权利要求7所述的打印混合物，其特征在于，所述组分(i)、组分(ii)和组分(iii)的重量比为0.05-1：0.005-0.2：10-1000，较佳地，0.1-1：0.01-0.15：10-100，更佳地，0.2-1：0.05-0.1：20-50。
9.一种3D的组织工程支架的制法，其特征在于，包括步骤：
(a)提供一个权利要求7所述的打印混合物；
(b)将上述打印混合物用于3D打印，形成预成型的组织工程支架；
(c)使得步骤(b)所得到的预成型的组织工程支架固化，形成权利要求1所述的3D的组织工程支架。
10.一种权利要求7所述打印混合物的用途，其特征在于，用于制备所述的3D的组织工程支架。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106267340A (zh) * 2016-08-12 2017-01-04 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种泡沫支架及其制备方法
CN106726010A (zh) * 2016-12-14 2017-05-31 深圳先进技术研究院 具有微沟槽的三维骨修复支架及其制备方法和应用
CN109276753A (zh) * 2018-11-30 2019-01-29 上海交通大学医学院附属第九人民医院 负载高铁酸钾的介孔生物活性玻璃修饰的医用钛合金支架及其制备方法
CN111617317A (zh) * 2020-04-10 2020-09-04 四川大学 一种生物组织的交联固定方法
CN114907606A (zh) * 2022-06-21 2022-08-16 华东理工大学 一种用于活性固载蛋白的聚合物刷表面改性方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6103255A (en) * 1999-04-16 2000-08-15 Rutgers, The State University Porous polymer scaffolds for tissue engineering
CN102961780A (zh) * 2012-12-17 2013-03-13 江苏科技大学 一种具有缓释性能的骨修复材料的制备方法
CN103191470A (zh) * 2013-04-03 2013-07-10 中国科学院上海硅酸盐研究所 具有药物缓释作用的有机/无机复合三维多孔支架及其制备方法
CN104548111A (zh) * 2015-01-26 2015-04-29 华东理工大学 复合载体、pH响应型复合载药体系及其制备方法
CN105031718A (zh) * 2015-08-27 2015-11-11 华南理工大学 基于3D-Bioplotter打印技术的骨修复多孔复合支架及其制备方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6103255A (en) * 1999-04-16 2000-08-15 Rutgers, The State University Porous polymer scaffolds for tissue engineering
CN102961780A (zh) * 2012-12-17 2013-03-13 江苏科技大学 一种具有缓释性能的骨修复材料的制备方法
CN103191470A (zh) * 2013-04-03 2013-07-10 中国科学院上海硅酸盐研究所 具有药物缓释作用的有机/无机复合三维多孔支架及其制备方法
CN104548111A (zh) * 2015-01-26 2015-04-29 华东理工大学 复合载体、pH响应型复合载药体系及其制备方法
CN105031718A (zh) * 2015-08-27 2015-11-11 华南理工大学 基于3D-Bioplotter打印技术的骨修复多孔复合支架及其制备方法

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106267340A (zh) * 2016-08-12 2017-01-04 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种泡沫支架及其制备方法
CN106726010A (zh) * 2016-12-14 2017-05-31 深圳先进技术研究院 具有微沟槽的三维骨修复支架及其制备方法和应用
CN106726010B (zh) * 2016-12-14 2018-07-24 深圳先进技术研究院 具有微沟槽的三维骨修复支架及其制备方法和应用
CN109276753A (zh) * 2018-11-30 2019-01-29 上海交通大学医学院附属第九人民医院 负载高铁酸钾的介孔生物活性玻璃修饰的医用钛合金支架及其制备方法
CN111617317A (zh) * 2020-04-10 2020-09-04 四川大学 一种生物组织的交联固定方法
CN111617317B (zh) * 2020-04-10 2021-11-23 四川大学 一种生物组织的交联固定方法
CN114907606A (zh) * 2022-06-21 2022-08-16 华东理工大学 一种用于活性固载蛋白的聚合物刷表面改性方法
CN114907606B (zh) * 2022-06-21 2023-11-17 华东理工大学 一种用于活性固载蛋白的聚合物刷表面改性方法

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