CN109010925A - 一种光热化疗骨修复材料及组织工程支架的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种光热化疗骨修复材料及组织工程支架的制备方法，骨修复材料包括油溶性高分子材料、生物陶瓷粉体、油性溶剂、水溶性生物活性材料、水、乳化剂、化疗药物和光热制剂，根据所述骨修复材料制备油包水乳液，将该油包水乳液作为打印墨水移送至打印机墨水盒，在CAD应用软件中建立组织工程支架三维模型，设置打印参数，调整打印机的成型室的温度，打印得到组织工程支架预制件，待组织工程预制件内的溶剂自然挥发后即得到组织工程支架成品。本发明具有良好力学特性、可仿生骨组织结构、优异骨引导性/骨传导性和优良光热能力且无毒的组织工程支架来促进骨肿瘤切除造成的大段骨缺损的修复。

Description

一种光热化疗骨修复材料及组织工程支架的制备方法
技术领域
本发明属于生物材料与再生医学技术领域，具体地说是一种光热化疗骨修复材料及组织工程支架的制备方法。
背景技术
目前市场上已有多种用于骨肿瘤切除后诱导骨修复的材料。以磷酸三钙、羟基磷灰石和生物玻璃为原料的3D打印支架经烧结后具有良好力学性能（抗压强度高但较脆）和骨传导性，但缺乏骨引导性。水凝胶类3D打印支架虽然具有很好的生物活性但力学性能太差且无仿生骨组织结构。另一方面，为了防止切除组织周围残余肿瘤细胞复发，将多种光热制剂如氧化石墨烯、四氧化三铁等以及化疗药物分子沉积于支架表面或负载于支架内部可提高支架通过光热及化疗杀灭肿瘤能力，但大部分光热制剂毒性较大且降解困难，而小部分无毒光热制剂如黑磷的稳定性又很低。对于可烧结生物陶瓷之家来说，光热制剂和化疗药物也不能原位负载于支架内部，只能在表面进行沉积，这也严重限制了支架的长效抗癌能力。
综上所述，亟需开发具有良好力学特性、可仿生骨组织结构、优异骨引导性/骨传导性和优良光热能力且无毒的组织工程支架来促进骨肿瘤切除造成的大段骨缺损的修复。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种光热化疗骨修复材料，具有良好力学特性、可仿生骨组织结构、优异骨引导性/骨传导性和优良光热能力且无毒的组织工程支架来促进骨肿瘤切除造成的大段骨缺损的修复。
为了解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：
一种光热化疗骨修复材料，包括按照重量份数计的如下组分：
油溶性高分子材料大于0且小于等于100份，生物陶瓷粉体大于0且小于等于200份，油性溶剂大于0且小于等于200份，水溶性生物活性材料大于0且小于等于10份，水10-30份、乳化剂大于0且小于等于5份，化疗药物大于0且小于等于1份，光热制剂大于0且小于等于1份。
所述油溶性高分子材料为聚乳酸-聚三亚甲基碳酸酯（PLA-PTMC）、聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA、聚乳酸（PLLA、PDLLA）、合成可降解高分子或天然高分子，合成可降解高分子包括DLLA/GA共聚物或PCL类的聚内酯。。
所述化疗药物为水溶性化疗药物或油溶性化疗药物。
所述水溶性化疗药物为盐酸阿霉素(DOX)或环磷酰胺；油溶性化疗药物为紫杉醇（PTX）或多西紫杉醇。
所述光热制剂为黑磷纳米片层(BP)。
所述乳化剂为聚乙烯醇（PVA）、司盘、吐温或纤维素酯。
所述生物陶瓷粉体为β-磷酸三钙或微米至纳米级的羟基磷灰石，水为去离子水，油性溶剂为二氯甲烷或氯仿，水溶性生物活性材料为成骨多肽或成骨生长因子。
一种组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：
打印墨水的制备：将光热制剂分散溶于油性溶剂中形成光热制剂/油性溶剂溶液，然后将油溶性高分子材料溶于光热制剂/油性溶剂溶液中，用搅拌器搅拌至油溶性高分子材料完全溶解，形成光热制剂/油溶性高分子材料溶液，接着将生物陶瓷粉体分散溶于光热制剂/油溶性高分子材料溶液中形成光热制剂/生物陶瓷粉体/油溶性高分子材料溶液；将乳化剂溶于水中形成水溶液，将水溶液和光热制剂/生物陶瓷粉体/油溶性高分子材料溶液混合后通过超生细胞破碎仪分散获得复合油包水乳液，再将水溶性生物活性材料溶于水中形成成骨多肽水溶液，接着再将成骨多肽水溶液与复合油包水乳液搅拌混合形成油包水乳液，将该油包水乳液移送至三维打印机墨盒作为打印墨水；其中，若化疗药物为水溶性化疗药物，则将该水溶性化疗药物与乳化剂一起溶于水中，若化疗药物为油溶性化疗药物，则将该油溶性化疗药物与光热制剂一起溶于油性溶剂中；
通过CAD应用软件对组织工程支架进行建模预处理得到组织工程支架三维模型，对组织工程支架三维模型分层切片，并设置三维打印设备的打印参数；
待三维打印设备的成型室温度降至0到-80℃时，进行三维低温打印得到组织工程支架预制件；
待组织工程支架预制件内的溶剂自然挥发后得到组织工程支架成品。
所述打印墨水的制备过程中，将乳化剂溶于水中时还同步加入化疗药物，即将乳化剂与水溶性化疗物同时溶于水中形成化疗药物溶液。
所述光热制剂与油性溶剂的质量体积比大于0小于0.01g/ml；生物陶瓷粉体与油溶性高分子材料的质量比是1-2.5；水溶性生物活性材料与水的质量体积比大于0小于等于0.05 g/ml；乳化剂与水的质量体积比大于0小于0.05 g/ml，化疗药物与水或者油性溶剂的质量体积比大于0小于0.05 g/ml。
所述制备得到的组织工程支架成品的孔隙率为40～95%，一级孔径为100～2000μm，次级孔孔径为1～100μm。
本发明具有良好力学特性、可仿生骨组织结构、优异骨引导性/骨传导性和优良光热能力且无毒的组织工程支架来促进骨肿瘤切除造成的大段骨缺损的修复。具体具有以下有益效果：
1、作为打印墨水的油包水乳液配制较为简单，在-10摄氏度条件下可进行打印成型且后处理无需进行冷冻干燥即可使组织工程支架定型。
2、可个性化制备大段骨缺损组织工程支架。
3、可原位负载化疗药物、光热制剂成骨生长因子或成骨多肽，并保持其在组织工程支架中进行可控缓释。
4、制备的组织工程支架具有可降解性且力学性能优异。
5、制备的组织工程支架具有释放化疗药物的功能，释放的化疗药物可促进肿瘤细胞的凋亡。
6、具有长效光热效应可在近红外光作用下使组织工程支架升温。
7、组织工程支架升温至50度并保持10分钟仍可保持生长因子及多肽的生物活性。
8、组织工程支架在近红外光照射下具有优良的肿瘤细胞杀灭作用。
9、组织工程支架具有良好的新骨诱导再生能力。
附图说明
附图1为本发明制备的组织工程支架的形状记忆特性的实验效果图；
附图2为本发明实施例1制备得到的组织工程支架进行光热作用杀灭癌细胞示意图；
附图3为本发明实施例2制备得到的组织工程支架进行阿霉素杀灭癌细胞测试的示意图；
附图4为本发明制备的组织工程支架培养三天的生物活性测试示意图；
附图5为本发明制备的组织工程支架培养七天的生物活性测试示意图；
附图6为种植于本发明制备的组织工程支架表面的骨髓干细胞的呈现状态示意图；
附图7为种植于本发明制备的组织工程支架表面的骨髓干细胞的矿化示意图。
具体实施方式
为能进一步了解本发明的特征、技术手段以及所达到的具体目的、功能，下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述。
实施 1
一种光热化疗骨修复材料，包括油溶性高分子材料90份，生物陶瓷粉体60份，油性溶剂100份，水溶性生物活性材料1份，水18份、乳化剂4.5份，化疗药物0.6份，光热制剂0.6份。所述光热制剂与油性溶剂的质量体积比大于0小于0.01g/ml；生物陶瓷粉体与油溶性高分子材料的质量比是1-2.5；水溶性生物活性材料与水的质量体积比大于0小于等于0.05 g/ml；乳化剂与水的质量体积比大于0小于0.05 g/ml，化疗药物与水或者油性溶剂的质量体积比大于0小于0.05 g/ml。
其中，所述油溶性高分子材料为聚乳酸-聚三亚甲基碳酸酯PLA-PTMC，光热制剂为黑磷纳米片层BP，乳化剂为聚乙烯醇PVA，化疗药物为油溶性化疗药物，且该油溶性化疗药物为紫杉醇PTX,生物陶瓷粉体为β-磷酸三钙，水为去离子水，油性溶剂为二氯甲烷，水溶性生物活性材料为成骨多肽（P24,序列为：KIPKA SSVPT ELSAI STLYL SGGC），β-磷酸三钙表达式为β-TCP。
利用上述骨修复材料制备组织工程支架，具体包括以下步骤：
S1,打印墨水的制备：称量9mg BP和9mg紫杉醇PTX分散于10mL二氯甲烷中形成PTX/BP/二氯甲烷溶液；称量3g PLA-PTMC，溶于10mL PTX/BP/二氯甲烷溶液中，用磁力搅拌器搅拌该至PLA-PTMC完全溶解，形成PTX/BP/PLA-PTMC溶液；称量3g β-TCP分散于PTX/BP/PLA-PTMC溶液中,形成PTX/BP/TCP/PLA-PTMC溶液；称量50mg PVA溶于1.8mL去离子水形成水溶液，将水溶液与PTX/BP/TCP/PLA-PTMC溶液混合后通过超生细胞破碎仪分散获得复合油包水乳液；称量10 mg的成骨多肽（P24），溶于0.2mL去离子水形成成骨多肽水溶液，将成骨多肽水溶液与复合油包水乳液混合后通过磁力搅拌均匀形成油包水乳液；并将该油包水乳液作为打印墨水转移至三维打印机墨盒。
S2,通过CAD应用软件对组织工程支架进行建模预处理得到组织工程支架三维模型，对组织工程支架三维模型分层切片，并设置三维打印设备的打印参数。
S3，待三维打印设备的成型室温度降至-20℃时，进行三维低温打印得到组织工程支架预制件.
S4，待组织工程支架预制件静内的溶剂自然挥发后得到组织工程支架成品。该得到的组织工程支架成品，孔隙率为40%，一级孔径为100μm，次级孔孔径为50μm。
在应用时，将组织工程支架放入42摄氏度水中对组织工程支架进行压缩塑形及降温定型，通过微小通道植入指定位置。然后通过近红外激光穿透照射压缩材料，升高其温度促使组织工程支架形状恢复至初始状态。
如附图1所示，组织工程支架具有形状记忆特性，可在42摄氏度条件下变软并塑形成易于植入的形状，在植入体内后可通过光热作用使材料温度回升至42摄氏度并回复至初始形态，从而满足需求。
实施例2
一种光热化疗骨修复材料，包括油溶性高分子材料30份，生物陶瓷粉体60份，油性溶剂100份，水溶性生物活性材料0.1份，水20份、乳化剂1份，化疗药物0.9份，化疗药物1份，光热制剂5份。所述光热制剂与油性溶剂的质量体积比大于0小于0.01g/ml；生物陶瓷粉体与油溶性高分子材料的质量比是1-2.5；水溶性生物活性材料与水的质量体积比大于0小于等于0.05 g/ml；乳化剂与水的质量体积比大于0小于0.05 g/ml，化疗药物与水或者油性溶剂的质量体积比大于0小于0.05 g/ml。
其中，所述油溶性高分子材料为聚乳酸-羟基乙酸（PLGA），光热制剂为黑磷纳米片层BP，乳化剂为聚乙烯醇PVA，生物陶瓷粉体为β-磷酸三钙，水为去离子水，油性溶剂为二氯甲烷，水溶性生物活性材料为成骨生长因子，该成骨生长因子具体为骨形成性蛋白（rhBMP-2），β-磷酸三钙表达式为β-TCP，化疗药物为水溶性化疗药物，该水溶性化疗药物为盐酸阿霉素DOX。
利用上述骨修复材料制备组织工程支架，具体包括以下步骤：
S1,称量9mg BP分散于10mL二氯甲烷中形成BP/二氯甲烷溶液；称量2g PLGA，溶于10mLBP/二氯甲烷溶液中，用磁力搅拌器搅拌至PLGA完全溶解，形成BP/PLGA溶液；称量4gβ-TCP分散于BP/PLGA溶液中,形成BP/TCP/PLGA溶液；称量10mg 盐酸阿霉素DOX和50mg分子量1000-10万的聚乙烯醇PVA，溶于1.8mL去离子水中形成DOX水溶液，将DOX水溶液与BP/TCP/PLGA溶液混合后通过超生细胞破碎仪分散获得复合油包水乳液；称量1 mg的骨形成性蛋白（BMP-2或rhBMP-2），溶于0.2mL去离子水中形成骨形成性蛋白水溶液，将骨形成性蛋白水溶液与复合油包水乳液混合后通过磁力搅拌均匀形成油包水乳液；并将油包水乳液转移至三维打印机墨盒作为打印墨水。
S2,通过CAD应用软件对组织工程支架进行建模预处理得到组织工程支架三维模型，对组织工程支架三维模型分层切片，并设置三维打印设备的打印参数。
S3，待三维打印设备的成型室温度降至-20℃时，进行三维低温打印得到组织工程支架预制件.
S4，待组织工程支架预制件静内的溶剂自然挥发后得到组织工程支架成品。该得到的组织工程支架成品，孔隙率为95%，一级孔径为2000μm，次级孔孔径为100μm。
在光热作用下杀灭癌细胞测试。
如附图2所示，将组织工程支架通过伽马射线消毒后放置于培养基（90% DMEM,10%FBS）中浸泡2h，之后将相同密度的人骨肉瘤细胞（100微升的100000细胞/毫升细胞悬浮液）种植于细胞表面。培养一天（37摄氏度，5%二氧化碳培养箱内）后对组织工程支架进行10分钟近红外激光照射（波长808nm，功率0.8W）,然后进行细胞活性检测。在检测过程中，先用磷酸盐缓冲液冲洗细胞-材料复合体表面，然后采用死活细胞检测试剂盒，将细胞-材料复合体放置于含有工作浓度(试剂盒储存浓度在DMEM培养基中稀释1000倍)的死活细胞荧光染料的培养基中，在37摄氏度细胞培养箱中孵育半小时，然后用倒置荧光显微镜观测死活细胞，可观察到癌细胞在光热作用后全部凋亡。
阿霉素杀灭癌细胞测试。
如附图3所示，组织工程支架通过伽马射线消毒后放置于培养基（90% DMEM,10%FBS）中浸泡2h，之后将相同密度的人骨肉瘤细胞（100微升的100000细胞/毫升细胞悬浮液）种植于细胞表面。培养三天（37摄氏度，5%二氧化碳培养箱内）后进行细胞活性检测。在检测过程中，先用磷酸盐缓冲液冲洗细胞-材料复合体表面，然后采用死活细胞检测试剂盒，将细胞-材料复合体放置于含有工作浓度(试剂盒储存浓度在DMEM培养基中稀释1000倍)的死活细胞荧光染料的培养基中，在37摄氏度细胞培养箱中孵育半小时，然后用倒置荧光显微镜观测死活细胞，可观察到癌细胞全部凋亡。
生物活性测试。
组织工程支架通过伽马射线消毒后放置于培养基（90% DMEM,10% FBS）中浸泡3天后，将相同密度的骨髓间充质干细胞（100微升的1000000细胞/毫升细胞悬浮液）种植于细胞表面。培养三天（37摄氏度，5%二氧化碳培养箱内）后进行细胞活性检测。在检测过程中，先用磷酸盐缓冲液冲洗细胞-材料复合体表面，然后采用死活细胞检测试剂盒，将细胞-材料复合体放置于含有工作浓度(试剂盒储存浓度在DMEM培养基中吸湿1000倍)的死活细胞荧光染料的培养基中，在37摄氏度细胞培养箱中孵育半小时，然后用倒置荧光显微镜观测死活细胞。
图4所示为经过3天培养的组织工程支架上的细胞的倒置荧光显微镜观测结果，图中绿色点状即为活细胞。图5为经过7天培养后的细胞-材料复合体的扫描电子显微镜图片，说明带有生物活性物质和生物陶瓷粉体的组织工程支架可以更好的为细胞黏附增殖、扩展提供帮助。
经过7天培养，种植于组织工程支架表面的骨髓干细胞表达出较高碱性磷酸酶浓度，如附图6所示。碱性磷酸酶的表达差异说明组织工程支架中的骨形成性蛋白很好地保持了其活性，促进了骨髓干细胞的成骨分化。同样地，骨形成性蛋白的存在也加速了细胞矿化，如附图7所示。
需要说明的是，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，但是凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种光热化疗骨修复材料，其特征在于，包括按照重量份数计的如下组分：油溶性高分子材料大于0且小于等于100份，生物陶瓷粉体大于0且小于等于200份，油性溶剂大于0且小于等于200份，水溶性生物活性材料大于0且小于等于10份，水10-30份、乳化剂大于0且小于等于5份，化疗药物大于0且小于等于1份，以及光热制剂大于0且小于等于1份。
2.根据权利要求1所述的光热化疗骨修复材料，其特征在于，所述化疗药物为水溶性化疗药物或油溶性化疗药物。
3.根据权利要求2所述的光热化疗骨修复材料，其特征在于，所述水溶性化疗药物为盐酸阿霉素(DOX)或环磷酰胺；油溶性化疗药物为紫杉醇（PTX）或多西紫杉醇。
4.根据权利要求1所述的光热化疗骨修复材料，其特征在于，所述油溶性高分子材料为聚乳酸-聚三亚甲基碳酸酯（PLA-PTMC）、聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA、聚乳酸（PLLA、PDLLA）、合成可降解高分子或天然高分子，合成可降解高分子包括DLLA/GA共聚物或PCL类的聚内酯。
5.根据权利要求1所述的光热化疗骨修复材料，其特征在于，所述光热制剂为黑磷纳米片层(BP)。
6.根据权利要求1所述的光热化疗骨修复材料，其特征在于，所述乳化剂为聚乙烯醇（PVA）、司盘、吐温或纤维素酯。
7.根据权利要求1所述的光热化疗骨修复材料，其特征在于，所述生物陶瓷粉体为β-磷酸三钙或微米至纳米级的羟基磷灰石，水为去离子水，油性溶剂为二氯甲烷或氯仿，水溶性生物活性材料为成骨多肽或成骨生长因子。
8.一种采用权利要求1-7中任一项所述的光热化疗骨修复材料的组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：
打印墨水的制备：将光热制剂分散溶于油性溶剂中形成光热制剂/油性溶剂溶液，然后将油溶性高分子材料溶于光热制剂/油性溶剂溶液中，用搅拌器搅拌至油溶性高分子材料完全溶解，形成光热制剂/油溶性高分子材料溶液，接着将生物陶瓷粉体分散溶于光热制剂/油溶性高分子材料溶液中形成光热制剂/生物陶瓷粉体/油溶性高分子材料溶液；将乳化剂溶于水中形成水溶液，将水溶液和光热制剂/生物陶瓷粉体/油溶性高分子材料溶液混合后通过超生细胞破碎仪分散获得复合油包水乳液，再将水溶性生物活性材料溶于水中形成成骨多肽水溶液，接着再将成骨多肽水溶液与复合油包水乳液搅拌混合形成油包水乳液，将该油包水乳液移送至三维打印机墨盒作为打印墨水；其中，若化疗药物为水溶性化疗药物，则将该水溶性化疗药物与乳化剂一起溶于水中，若化疗药物为油溶性化疗药物，则将该油溶性化疗药物与光热制剂一起溶于油性溶剂中；
通过CAD应用软件对组织工程支架进行建模预处理得到组织工程支架三维模型，对组织工程支架三维模型分层切片，并设置三维打印设备的打印参数；
待三维打印设备的成型室温度降至0到-80℃时，进行三维低温打印得到组织工程支架预制件；
待组织工程支架预制件内的溶剂自然挥发后得到组织工程支架成品。
9.根据权利要求8所述的组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述光热制剂与油性溶剂的质量体积比大于0小于0.01g/ml；生物陶瓷粉体与油溶性高分子材料的质量比是1-2.5；水溶性生物活性材料与水的质量体积比大于0小于等于0.05 g/ml；乳化剂与水的质量体积比大于0小于0.05 g/ml，化疗药物与水或者油性溶剂的质量体积比大于0小于0.05 g/ml。
10.根据权利要求9所述的组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述制备得到的组织工程支架成品的孔隙率为40～95%，一级孔径为100～2000μm，次级孔孔径为1～100μm。
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