CN102188747A - 一种含有plga加强网的复合型组织工程支架及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及组织工程构建的支架材料及其制备方法，具体得说是涉及一种含有PLGA加强网的复合型组织工程支架及其制备方法和应用。含有PLGA加强网的复合型组织工程支架，该组织工程支架包括具有良好生物相容性的多孔支架和PLGA加强网，所述的PLGA加强网由PLGA纤维编织而成，PLGA加强网与多孔支架紧密结合在一起。本发明制备的PLGA加强网的复合型组织工程支架具有与脱细胞真皮基质相似的机械性能，更有利于支架三维多孔结构的维系，从而更有利于细胞、血管及组织的长入；而胶原、壳聚糖等天然来源的大分子其优良的生物相容性使复合支架本身的生物学性能得以保持，有利于细胞的粘附、增殖和分泌，是一种适用于组织工程组织、器官构建的优良的再生材料。

Description

一种含有PLGA加强网的复合型组织工程支架及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及组织工程构建的支架材料及其制备方法，具体得说是涉及一种含有PLGA加强网的复合型组织工程支架及其制备方法和应用。

背景技术

各种致伤因素导致的组织缺损或器官衰竭，是人类健康的大敌。以真皮组织为例，真皮组织位于表皮与皮下组织之间，对维持正常皮肤的弹性、韧性具有重要作用。真皮组织一旦遭受严重损伤，则无法再生。临床上，单纯的自体刃厚皮移植和单纯的表皮细胞膜片移植后期大量的瘢痕形成和瘢痕挛缩也从另一个角度证明真皮组织的重要作用。

目前，应对组织缺损的方式主要有三种，即：自体组织移植、异体/异种组织移植、人工材料替代。自体组织移植虽然临床效果好，但是自体组织供区有限，且是一种“以伤治伤”的办法；而异体或异种组织移植又受到免疫排斥反应的限制，都不是理想的治疗方式。组织工程和再生医学的兴起为克服组织缺损提供了第三条途径。以组织工程软骨为例，组织工程软骨的发展通过重建受损的软骨组织使软骨再生成为可能。

中国发明专利申请(申请号：02112498.1申请日：2002-07-10)公开了一种采用天然生物材料胶原和壳聚糖为原料，通过冷冻-冻干，再进一步通过真空干热法、醛类化合物或碳化二亚胺类化合物交联，制备具有微结构可控、适宜降解速率和良好生物相容性的多孔支架。该发明的胶原/壳聚糖支架的生物相容性好，降解速率可控，且材料来源广泛，成本低，制备工艺简单可行，重复性好，所构建的支架可以广泛地应用于组织工程领域，具有良好的临床应用前景。

中国发明专利申请(申请号：200610041912.9，申请日：2006-03-13)公开了一种制备可生物降解的组织工程用支架材料的方法。该发明提供的可生物降解组织工程用支架材料具有适宜的微观结构和空隙率，具有优良的机械强度和可控的降解速率，可广泛应用于皮肤、神经修复管、血管以及心脏瓣膜等多种组织的修复与重建。

中国发明专利申请(申请号：200510061872.X，申请日：2005-12-07)公开了一种胶原-壳聚糖和硅橡胶双层皮肤再生支架及其制备方法。该皮肤再生支架由胶原/壳聚糖多孔支架和硅橡胶薄膜通过生物相容性良好的胶粘剂粘结而成。其中胶原/壳聚糖多孔支架可以有效诱导缺损组织处细胞的迁移、增殖和分化，原位诱导缺损真皮组织的再生；硅橡胶薄膜则起到了临时表皮层的作用，可以有效控制水分的挥发和防止细菌的侵入等，对创面起到了临时保护作用。本发明所制备的胶原-壳聚糖/硅橡胶复合支架具有良好的生物相容性，可控的降解速率和优异的创面修复能力，具有较良好的临床应用前景。

中国发明专利(申请号：200710068310.7，申请日：2007-04-25)公开了胶原-壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架，该不对称支架包括胶原-壳聚糖多孔材料层和纤维蛋白胶层，纤维蛋白胶层均匀设置在胶原-壳聚糖多孔材料层的表面，两者之间形成有交界面。本发明所制备的胶原-壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架具有良好的细胞相容性，是一种适应组织工程皮肤尤其是复合皮肤构建的皮肤再生材料。

但是理想的组织工程支架，除了具有良好的生物相容性和可降解性之外，还应具有良好的机械性能，从而不但可以在体内起到良好的支撑作用，而且也有利于临床上的操作和应用。有研究者甚至将力学性能作为材料生物相容性的重要方面之一。

发明内容

为了解决现有组织工程支架的机械性能问题，本发明的第一个目的是提供一种生物相容性良好，机械性能优良，并具有特定的三维多孔结构，能够完好地满足组织工程组织、器官构建，进而促进组织缺损的填充、愈合并提高愈合质量的含有PLGA加强网的复合型组织工程支架。

本发明的第二个目的是提供上述的复合型组织工程支架的制备方法。

本发明的第三个目的是提供上述的复合型组织工程支架的应用。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下技术方案：

含有PLGA加强网的复合型组织工程支架，该组织工程支架包括具有良好生物相容性的多孔支架和PLGA加强网，所述的PLGA加强网由PLGA纤维编织而成，PLGA加强网与多孔支架紧密结合在一起。

作为优选，上述的复合型组织工程支架至少包括以下三种结构：

①PLGA加强网位于多孔支架的一侧形成“偏心”型结构；

②或者，PLGA加强网位于多孔支架的中间构成“夹心”型的结构；

③或者，在PLGA加强网的网孔结构中形成多孔支架的三维多孔结构。

作为优选，上述的多孔支架具有30～500μm的孔径结构。

作为优选，上述的PLGA加强网具有200～3000μm的网孔，单根PLGA编织线的直径在10～200μm之间。

作为优选，上述的多孔支架采用胶原/壳聚糖复合型多孔支架或胶原多孔支架，其中胶原的重量百分比含量为80％～100％。胶原材料可以是牛、羊或猪腱胶原，牛、羊或猪皮胶原或鼠尾胶原。当然，本发明的多孔支架的材料也可以采用现有的适用于组织工程用多孔支架材料，如可降解聚酯或者背景技术中提到的多孔支架，所属领域技术人员可以通过合理推断并多次实验获得。

作为优选，上述的所述的PLGA纤维中聚乳酸单体和聚乙醇酸单体的摩尔数量之比为50∶50～1∶99。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下技术方案：

一种制备上述的含有PLGA加强网的复合型组织工程支架的制备方法，该方法包括如下步骤：

①配制质量浓度为0.05％～5％的多孔支架材料溶液；

②将PLGA纤维编织，再经丙酮清洗、纯净水超声波清洗和真空热定型后得到PLGA加强网；上述的PLGA纤维由聚乳酸(LA)和聚乙醇酸(GA)单体充分混合后在高温下行本体混合，经熔融纺丝制得；

③将PLGA加强网裁剪成一定的形状并平展地放入模具中并固定，然后将多孔支架材料溶液注入模具中，于1℃～5℃下充分作用，采用冷冻-冻干法制备得到预交联复合型组织工程支架；

④将上述所得的预交联复合型组织工程支架根据需要选择或者不选择进行以下一种或两种交联反应，交联反应后清洗，再次冷冻-冻干：

I、真空干热交联，置于80℃～180℃下真空干热交联处理；

II、化学交联，置于醛类化合物或碳化二亚胺类化合物中化学交联12～48小时。

作为优选，上述的步骤①采用酸性溶液配置多孔支架材料溶液，所述的多孔支架材料采用胶原或者胶原和壳聚糖混合溶液，其中胶原的重量百分比含量为80％～100％。作为再优选，上述的酸性溶液为0.5M～2.5M乙酸、甲酸、盐酸中的一种或几种，pH为2.0～3.0。

作为优选，上述的步骤③和④冷冻-冻干法的温度为-5℃～-80℃。

作为优选，上述的步骤④醛类化合物甲醛或戊二醛，碳化二亚胺类化合物为1-乙基-3-3-(二甲基胺丙基)-碳化二亚胺。

本发明三种具体的复合型组织工程支架的制备方法如下：

(一)“偏心”型含有PLGA加强网的复合型组织工程支架的制备方法

1)将PLGA加强网裁剪成合适的形状后，平展地铺在一块平板模具上；

2)将一块具有一定厚度的“框”型模具紧密压在PLGA加强网上，以四周刚好将网压住为好；

3)将一定量的多孔支架材料溶液注入“框”型模具中，使溶液平展地分布在PLGA加强网的上方并将网完全浸润，然后冷冻、冻干，复合型支架在80℃-130℃下真空干热交联处理，再经醛类化合物或碳化二亚胺类化合物中化学交联12-48小时、经去离子水充分漂洗后，再次冷冻-冻干后得到“偏心”型含有PLGA加强网的复合型组织工程支架。

(二)“夹心”型含有PLGA加强网的复合型组织工程支架的制备方法

1)将一块特定厚度的“框”型模具置于一块平板模具上，然后注满多孔支架材料溶液并将液面推平；

2)将PLGA加强网裁剪成合适的形状后，平展地铺在第一块模具及多孔支架材料溶液的液面上；

3)将另一块相同大小的“框”型模具紧密压在PLGA加强网上，使上下两块“框”型模具对齐且其四周刚好将网压住为好；

4)将一定量的多孔支架材料溶液注入“框”型模具中，使溶液平展地分布在PLGA加强网的上方，然后冷冻、冻干，经干热和化学交联、去离子水充分漂洗、再次冷冻-冻干后得到“夹心”型含有PLGA加强网的复合型组织工程支架。

(三)“简单”型含有PLGA加强网的复合型组织工程支架的制备方法

将PLGA加强网裁剪成合适的形状后浸入多孔支架材料溶液中，一定时间后取出平展地铺在平板模具上，并将PLGA加强网上多余的溶液成分轻轻刮去，经冷冻-冻干、物理化学交联、去离子水充分漂洗和再冷冻-冻干后得到“简单”型含有PLGA加强网的复合型组织工程支架。

上述的平板模具和“框”型模具均为医用级的材料制备而成，其材质可以是玻璃、聚氨酯、聚酯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、硅胶、金属等。

当然上述的复合型支架在应用于细胞培养或体内移植前，可以不经过交联处理，或者是只进行某一种方式的交联(真空干热交联或化学交联)，或者是理化交联方式联合应用。

为了实现第三个目的，本发明公开了上述复合型组织工程支架(“夹心”型、“偏心”型和“简单”型)用于构建组织工程皮肤、骨、软骨、肌腱、腹膜、硬脑膜、黏膜、血管中的应用。

本发明制备的PLGA加强网的复合型组织工程支架因为含有PLGA加强网而具有与脱细胞真皮基质相似的机械性能，更有利于支架三维多孔结构的维系，从而更有利于细胞、血管及组织的长入；而胶原、壳聚糖等天然来源的大分子其优良的生物相容性使复合支架本身的生物学性能得以保持，有利于细胞的粘附、增殖和分泌。因此，本发明制备的含有PLGA加强网的复合型组织工程支架(“夹心”型、“偏心”型和“简单”型)是一种适用于组织工程组织、器官构建的优良的再生材料。

附图说明

图1是本发明含有PLGA加强网的复合型组织工程支架横断面的扫描电镜(SEM)照片。

图2是本发明含有PLGA加强网的复合型组织工程支架PLGA加强网一侧的扫描电镜(SEM)照片。

图3是本发明含有PLGA加强网的复合型组织工程支架在SD大鼠体内埋植的手术照片。

图4是本发明含有PLGA加强网的复合型组织工程支架体内埋植2周的病理切片照片，Masson染色×40。

图5是本发明含有PLGA加强网的复合型组织工程支架体内埋植4周的病理切片照片，Masson染色×40。

图6是本发明含有PLGA加强网的复合型组织工程支架体内埋植4周的病理切片照片，Masson染色×40。

图7是本发明含有PLGA加强网的复合型组织工程支架在SD大鼠体内移植的手术照片。

图8是本发明含有PLGA加强网的复合型组织工程支架体内移植2周的病理切片照片，HE染色×40。

图9是本发明含有PLGA加强网的复合型组织工程支架体内移植4周的病理切片照片，HE染色×40。

具体实施方式

实施例1PLGA加强网的制备

聚乳酸(LA)和聚乙醇酸(GA)单体按摩尔1∶1，充分混合后在高温下行本体混合，经熔融纺丝成线后，编织得到PLGA加强网，PLGA加强网具有200～3000μm的网孔，单根PLGA编织线的直径在10～200μm之间；该网经丙酮清洗、纯净水超声波清洗和真空热定型后得到PLGA加强网。

上述的聚乳酸(LA)和聚乙醇酸(GA)单体按摩尔也可以选择1∶1～1∶99中任意一个组分比。

实施例2含有PLGA加强网的复合型组织工程支架扫描电镜下的超微结构观察

将胶原和壳聚糖分别配成质量分数为0.5％乙酸溶液，然后将胶原溶液和壳聚糖溶液按照9∶1的体积比混合后，充分搅拌均匀，备用；将PLGA加强网裁剪成4.5cm×4.5cm大小，并平展地铺在平板上，再将一块厚度为1cm大小为4cm×4cm的“框”型模具紧密地压在网上，然后注入胶原/壳聚糖溶液3.2mL使其均匀地将PLGA加强网浸润；将PLGA加强网、胶原/壳聚糖溶液连同模具共同置于4℃下24小时后，于-20℃冷冻24小时，然后置于冻干机中冻干16小时；冻干的复合支架于105℃下真空干热交联24小时，再置于摩尔浓度比为2∶1的EDAC(40mmmol)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)混合溶液中交联24小时，经三蒸水反复清洗后再次冷冻-冻干得到交联后的“偏心”型含有PLGA加强网的复合型组织工程支架。

将制备的“偏心”型含有PLGA加强网的复合型组织工程支架表面喷金处理后，做扫描电镜观察。由复合支架的横断面和侧面可见胶原/壳聚糖支架与PLGA加强网紧密地结合在一起，并保持本身的三维多孔结构(孔径为80μm-200μm)；通过PLGA加强网的网孔可见胶原/壳聚糖的三维结构。见图1，图2。

实施例3含有PLGA加强网的复合型组织工程支架体内埋植实验

将胶原和壳聚糖分别配成质量分数为0.5％乙酸溶液，然后将胶原溶液和壳聚糖溶液按照9∶1的体积比混合后，充分搅拌均匀，备用；将PLGA加强网裁剪成4.5cm×4.5cm大小，并平展地铺在平板上，再将一块厚度为1cm大小为4cm×4cm的“框”型模具紧密地压在网上，然后注入胶原/壳聚糖溶液3.2mL使其均匀地将PLGA加强网浸润；将PLGA加强网、胶原/壳聚糖溶液连同模具一起置于4℃下24小时后，于-20℃冷冻24小时，然后置于冻干机中冻干16小时；冻干的复合支架于105℃下真空干热交联24小时，再置于摩尔浓度比为2∶1的EDAC(40mmmol)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)混合溶液中交联24小时，经三蒸水反复清洗后再次冷冻-冻干得到交联后的“偏心”型含有PLGA加强网的复合型组织工程支架。

将含有PLGA加强网的复合型组织工程支架裁剪成1cm×1cm的小片，置入70％乙醇溶液中浸泡消毒24小时后，用生理盐水充分漂洗，备用；手术前一天，将SD大鼠背部的鼠毛剪去，然后用脱毛剂脱毛；手术时，在SD大鼠的脊柱两侧各做两个“囊”(见图3)，然后将复合支架平展地植入，缝合，伤口用聚维酮碘擦拭并腹腔注射庆大霉素抗感染。于术后2周、4周、8周取材，Masson染色观察复合支架在体内的生物学特征，见图4，图5，图6。

实施例4含有PLGA加强网的复合型组织工程支架体内移植实验

将胶原和壳聚糖分别配成质量分数为0.5％乙酸溶液，然后将胶原溶液和壳聚糖溶液按照9∶1的体积比混合后，充分搅拌均匀，备用；将PLGA加强网裁剪成直径为2.0cm的圆形，然后浸入配制好的胶原/壳聚糖溶液中充分作用12h。取出PLGA加强网后平展地铺在平板模具上，并将PLGA加强网上多余的溶液成分轻轻刮去，共同置于-20℃冷冻24小时，然后置于冻干机中冻干16小时；冻干的复合支架于105℃下真空干热交联24小时，再置于摩尔浓度比为2∶1的EDAC(40mmmol)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)混合溶液中交联24小时，经三蒸水反复清洗后再次冷冻-冻干得到交联后的“简单”型含有PLGA加强网的复合型组织工程支架。

将含有PLGA加强网的复合型组织工程支架置入70％乙醇溶液中浸泡消毒24小时后，用生理盐水充分漂洗，备用；手术前一天，将SD大鼠背部的鼠毛剪去，然后用脱毛剂脱毛；手术时，在SD大鼠的脊柱两侧各做一直径为2.0cm的圆形的全层缺损，然后将复合支架平展地铺在创面上，再将切下的皮肤剪成刃厚皮后置于复合支架上，缝合，伤口用聚维酮碘擦拭并腹腔注射庆大霉素抗感染。于术后2周、4周取材，HE染色观察复合支架在体内的生物学特征，见图7，图8，图9。

实施例5

将胶原配成质量分数为1％乙酸溶液，充分搅拌均匀，备用；将PLGA加强网裁剪成4.5cm×4.5cm大小，并平展地铺在平板上，再将一块厚度为1cm大小为4cm×4cm的“框”型模具紧密地压在网上，然后注入胶原溶液3.2mL使其均匀地将PLGA加强网浸润；将PLGA加强网、胶原溶液连同模具共同置于4℃下24小时后，于-10℃冷冻24小时，然后置于冻干机中冻干24小时；冻干的复合支架于105℃下真空干热交联24小时，再置于摩尔浓度比为2∶1的EDAC(40mmmol)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)混合溶液中交联24小时，经三蒸水反复清洗后再次冷冻-冻干得到交联后的“偏心”型含有PLGA加强网的复合型组织工程支架。

实施例6

将胶原和壳聚糖分别配成质量分数为0.5％乙酸溶液，然后将胶原溶液和壳聚糖溶液按照8∶2的体积比混合后，充分搅拌均匀，备用；将PLGA加强网裁剪成4.5cm×4.5cm大小，并平展地铺在平板上，再将一块厚度为1cm大小为4cm×4cm的“框”型模具紧密地压在网上，然后注入胶原/壳聚糖溶液3.2mL使其均匀地将PLGA加强网浸润；将PLGA加强网、胶原/壳聚糖溶液连同模具共同置于4℃下24小时后，于-20℃冷冻24小时，然后置于冻干机中冻干16小时；冻干的复合支架于105℃下真空干热交联24小时，再置于摩尔浓度比为2∶1的EDAC(40mmmol)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)混合溶液中交联24小时，经三蒸水反复清洗后再次冷冻-冻干得到交联后的“偏心”型含有PLGA加强网的复合型组织工程支架。

Claims (12)

1.含有PLGA加强网的复合型组织工程支架，其特征在于：该组织工程支架包括具有良好生物相容性的多孔支架和PLGA加强网，所述的PLGA加强网由PLGA纤维编织而成，PLGA加强网与多孔支架紧密结合在一起。

2.根据权利要求1所述的含有PLGA加强网的复合型组织工程支架，其特征在于：PLGA加强网位于多孔支架的一侧形成“偏心”型结构；或者，PLGA加强网位于多孔支架的中间构成“夹心”型的结构；或者，在PLGA加强网的网孔结构中形成多孔支架的三维多孔结构。

3.根据权利要求1或2所述的含有PLGA加强网的复合型组织工程支架，其特征在于：所述的多孔支架具有30～500μm的孔径结构。

4.根据权利要求1或2所述的含有PLGA加强网的复合型组织工程支架，其特征在于：所述的PLGA加强网具有200～3000μm的网孔，单根PLGA编织线的直径在10～200μm之间。

5.根据权利要求1或2所述的含有PLGA加强网的复合型组织工程支架，其特征在于：所述的多孔支架采用胶原/壳聚糖复合型多孔支架或胶原多孔支架，其中胶原的重量百分比含量为80％～100％。

6.根据权利要求1或2所述的含有PLGA加强网的复合型组织工程支架，其特征在于：所述的PLGA纤维中聚乳酸单体和聚乙醇酸单体的摩尔数量之比为50∶50～1∶99。

7.一种制备如权利要求1或2所述的含有PLGA加强网的复合型组织工程支架的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

①配制质量浓度为0.05％～5％的多孔支架材料溶液；

②将PLGA纤维编织，再经丙酮清洗、纯净水超声波清洗和真空热定型后得到PLGA加强网；

③将PLGA加强网裁剪成一定的形状并平展地放入模具中并固定，然后将多孔支架材料溶液注入模具中，于1℃～5℃下充分作用，采用冷冻-冻干法制备得到预交联复合型组织工程支架；

④将上述所得的预交联复合型组织工程支架根据需要选择或者不选择进行以下一种或两种交联反应，交联反应后清洗，再次冷冻-冻干：

I、真空干热交联，置于80℃～180℃下真空干热交联处理；

II、化学交联，置于醛类化合物或碳化二亚胺类化合物中化学交联12～48小时。

8.根据权利要求7所述的一种含有PLGA加强网的复合型组织工程支架的制备方法，其特征在于：步骤①采用酸性溶液配置多孔支架材料溶液，所述的多孔支架材料采用胶原或者胶原和壳聚糖混合溶液，其中胶原的重量百分比含量为80％～100％。

9.根据权利要求8所述的一种含有PLGA加强网的复合型组织工程支架的制备方法，其特征在于：酸性溶液为0.5M～2.5M乙酸、甲酸、盐酸中的一种或几种，pH为2.0～3.0。

10.根据权利要求7所述的一种含有PLGA加强网的复合型组织工程支架的制备方法，其特征在于：步骤③和④冷冻-冻干法的温度为-5℃～-80℃。

11.根据权利要求7所述的一种含有PLGA加强网的复合型组织工程支架的制备方法，其特征在于：步骤④醛类化合物甲醛或戊二醛，碳化二亚胺类化合物为1-乙基-3-3-(二甲基胺丙基)-碳化二亚胺。

12.根据权利要求1或2所述的含有PLGA加强网的复合型组织工程支架用于构建组织工程皮肤、骨、软骨、肌腱、腹膜、硬脑膜、黏膜或血管中应用。

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