CN101147810A - 细胞-生物可降解材料复合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种细胞-生物可降解材料复合物及其制备方法和应用,该复合物由聚对苯二甲酸丁二醇酯/聚乙二醇/低聚乳酸(PBT/PEG/OLA)三元共聚酯(PPOCP)三维多孔细胞支架、干细胞构成,所述的干细胞种植在PPOCP三维多孔细胞支架上。与现有技术相比,本发明的细胞-生物可降解材料复合物的组织相容性好,修复受损组织效果优良,使用安全,成本较低,采用的支架材料PPOCP可生物降解,力学性能优良,可根据细胞大小及构建组织的要求调节支架的厚度、形状、孔径、孔隙率及力学性能,可以用于制备复合细胞载体移植物,修复皮肤、脂肪、尿道、膀胱、软骨组织、肌组织、肌腱等多种组织器官的损伤。
Description
技术领域
本发明涉及医学组织工程,尤其是涉及一种细胞-生物可降解材料复合物及其制备方法和应用。
背景技术
因疾病、创伤等各种原因造成的人体组织器官的缺损和/或功能丧失严重危害着人类的健康,病损组织和器官的修复一直是医学界的难题之一。近年来,随着细胞生物学和生物材料科学的发展,组织工程学作为高新技术领域的新兴边缘学科随之应运而生,它包括生物学、材料学、工程学及医学等多个领域技术的交叉与融合。组织工程是指应用工程科学和生命科学的原理和技术,开发具有恢复、维持及提高受损伤组织和器官功能的生物材料替代物,其基本原理和方法是将体外培养扩增的特定正常组织细胞吸附于一种具有优良细胞相容性并可被机体降解吸收的生物材料上形成细胞-生物材料复合物,然后将复合物植入人体组织、器官的病损部位,在作为细胞生长支架的生物材料逐渐被机体降解吸收的同时,植入的特定细胞不断增殖、分化,形成新的形态及功能与受损器官相一致的组织成份,达到修复创伤和重建功能的目的。
组织工程的主要研究内容包括支架材料、种子细胞、组织器官构建、临床使用四个方面,其中,支架材料是研究中最重要的一项。理想的支架材料应在保证材料力学性能的同时,具有良好的生物相容性、可降解性和可塑性等优点并可精确地控制其分子量、降解时间及孔隙率和孔径等性能,依照不同的用途,可塑造成各种形状与结构,并可具备不同硬度、弹性及降解时间,以适合组织工程对细胞支架的需求。目前细胞支架材料主要有三种:(1)人工合成的聚合物,如聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)和聚乙醇酸聚乳酸复合物(PLGA),研究已证实了这些人工合成的聚合物具有作为细胞载体的可行性,但仍存在着价格昂贵、机械性能差等问题;(2)天然材料,如胶原和凝胶海绵等,天然的生物材料在应用上,由于其是不同来源的成分,性质不稳定,且可引起免疫反应,仍存在很多问题;(3)无细胞基质,如小肠黏膜下层无细胞基质(SIS)、膀胱黏膜下层无细胞基质、膀胱无细胞基质等,具有可降解性和良好的组织相容性,无细胞基质中含有的活性生长因子,能促进宿主细胞的生长,是比较理想的细胞载体,但因来自异种或异体而存在病毒传染等风险。因而,寻找经济实用的组织工程材料一直是组织工程学迫切需要解决的问题。
选择合适的种子细胞也是组织工程的研究重点。组织工程的最初设想是通过切取一小块正常同源组织,经体外培养扩增的方法获得大量的目的细胞,构建出新的组织块用以修复较大的缺损,但研究显示成熟细胞在体外扩增困难,细胞在培养条件下很快老化而失去增殖能力,无法满足构建组织的需求。近年各种组织特异性干细胞的发现和分离培养成功,为组织工程种子细胞来源开拓了新的途径。干细胞具有自我复制能力以及向一种或多种成熟细胞分化的特征,完全符合组织工程对种子细胞的要求。依照其不同来源,干细胞分胚胎干细胞和成体干细胞,胚胎干细胞虽可分化多种细胞类型,形成机体的各种组织或器官,但伦理问题及免疫排斥等风险限制了胚胎干细胞的应用。而成体干细胞不仅取材方便、来源广、更容易定向诱导分化,而且能取自自体,避免了免疫排斥问题,无伦理学的争议,因此更易应用于临床,已成为当前组织工程种子细胞的首选。如成体干细胞中的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)由于具有向多种细胞组织分化的潜能,取材方便,分离培养技术简便成熟,且自体MSCs移植又无免疫排斥等问题,近年来作为细胞治疗和组织工程的种子细胞倍受关注;内皮祖细胞(Endothelial progenitor cell,EPC)是能直接分化为血管内皮细胞的前体细胞,将其用于组织工程能显著促进血管新生;各种组织特异性干细胞用于相应特定组织器官的修复也具有其优势。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种组织相容性好、修复受损组织效果优良的细胞-生物可降解材料复合物及其制备方法和应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
细胞-生物可降解材料复合物,其特征在于,该复合物由聚对苯二甲酸丁二醇酯/聚乙二醇/低聚乳酸(PBT/PEG/OLA)三元共聚酯(PPOCP)三维多孔细胞支架、干细胞构成,所述的干细胞种植在PPOCP三维多孔细胞支架上。
所述的干细胞包括内皮祖细胞(EPC)、间充质干细胞(MSCs)及各种组织特异干细胞。
一种细胞-生物可降解材料复合物的制备方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
(1)聚对苯二甲酸丁二醇酯/聚乙二醇/低聚乳酸(PBT/PEG/OLA)三元共聚酯(PPOCP)三维多孔细胞支架的构建:对PPOCP采用盐粒致孔剂和常温亚模相结合的方法构建PPOCP三维多孔细胞支架;
(2)干细胞的分离培养、定向诱导培养:对干细胞进行分离培养,改变培养条件诱导干细胞定向分化;
(3)细胞-生物可降解材料复合物的制备:将步骤(2)得到的干细胞种植于步骤(1)得到的PPOCP三维多孔细胞支架上,得到细胞-生物可降解材料复合物。
所述的构建PPOCP三维多孔细胞支架的方法包括筛分致孔剂、均匀混合、倾入模具、挥发、干燥、去除致孔剂、干燥,得到PPOCP三维多孔细胞支架。
所述的干细胞包括内皮祖细胞(EPC)、间充质干细胞(MSCs)及各种组织特异干细胞。
所述的分离培养的方法包括密度梯度离心法、贴壁法。
所述的改变培养条件包括添加相应诱导剂、与相应细胞不同方式混合培养模拟体内微环境。
所述的相应诱导包括选自细胞因子EGF、bFGF、HGF、SCF、VEGF、NGF或TGF-β,以及地塞米松、5-氮胞苷、胰岛素、维生素C或脑垂体提取物,所述的相应细胞包括选自上皮类细胞、肌细胞、软骨细胞或神经干细胞,所述的不同方式包括直接接触共培养、通过Transwell小皿间接共培养及相应细胞裂解液或培养上清液共培养等方式。
一种细胞-生物可降解材料复合物的应用,其特征在于,该细胞-生物可降解材料复合物用于制备修复损伤组织器官的复合细胞载体移植物。
所述的修复损伤组织器官包括修复损伤皮肤、脂肪、尿道、膀胱、软骨组织、肌组织、肌腱。
聚对苯二甲酸丁二醇酯/聚乙二醇/低聚乳酸(PBT/PEG/OLA)三元共聚酯(PPOCP)是一种新型生物可降解聚合材料,其结构式为:
该聚合物具有以下特性:共聚酯均溶解于氯仿中,以及氯仿和苯酚的混合溶液中(氯仿与苯酚体积比为4∶6),当乳酸含量大时,甚至可以溶解于四氢呋喃中;熔融温度变动范围在141.2℃~187.8℃;在4周的降解时间里,共聚酯随乳酸的含量增加,降解性能增强,降解率在5%~11%;平均分子量范围在0.41×104~5.13×104。
与现有技术相比,本发明的细胞-生物可降解材料复合物的组织相容性好,修复受损组织效果优良,使用安全,成本较低,采用的支架材料PPOCP可生物降解,力学性能优良,可根据细胞大小及构建组织的要求调节支架的厚度、形状、孔径、孔隙率及力学性能,可以用于制备复合细胞载体移植物,修复皮肤、脂肪、尿道、膀胱、软骨组织、肌组织、肌腱等多种组织器官的损伤。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明将干细胞(主要为成体干细胞,包括间充质干细胞、内皮祖细胞及各种组织特异干细胞)复合PPOCP用于制备修复皮肤、脂肪、尿道、膀胱、软骨组织、肌组织、肌腱等组织器官损伤的复合细胞载体移植物。本发明先将力学性能优良且可生物降解的PPOCP构建不同孔径及不同降解速率的三维细胞支架,并验证其体内降解速率及组织相容性;然后将干细胞种植到PPOCP三维细胞支架上,体外构建组织工程皮肤、膀胱、尿道等组织,观察干细胞在载体上的生长分化特性及血管新生状况;最后将体外构建好的生物载体进行动物体内移植修复皮肤、膀胱、尿道等组织缺损。
实施例1
一种细胞-生物可降解材料复合物的制备方法,该方法包括以下步骤:
(1)构建PPOCP三维多孔共聚酯细胞支架,对降解行为可调、具有优良力学行为、优良生物相容性的PPOCP,以盐粒致孔剂和常温亚模相结合方法,制备适合种植干细胞的三维多孔细胞支架,该方法包括:采用研磨式粉碎机粉碎氯化钠颗粒,分别过60目、80目不锈钢筛网,制备180~250μm的氯化钠颗粒,将PPOCP聚合物溶解于氯仿中,加入氯化钠颗粒搅拌均匀,使成混悬液,倾入圆柱状容器模具中,控制支架孔隙率为90%,孔径为180~250μm,于通风处待氯仿挥发12h以上,冷冻干燥机真空干燥支架24h,从模具中剥离支架,三蒸水浸泡24h,期间每隔6h换三蒸水一次,以溶解支架内部的氯化钠颗粒,冷冻干燥机真空干燥24h,以去除支架内部的水分,即得白色泡沫薄片状细胞支架。通过调整氯化钠的密度及颗粒大小可调节细胞支架的孔隙率及孔径。上述得到的支架呈白色泡沫薄片状,厚度约1mm,一侧表面呈薄膜状,孔隙未与表面相通,另一侧表面呈蜂窝状,孔隙与表面相通,孔径大小大致一致,扫描电镜可见一侧支架表面及其内部孔隙互相连通,且孔隙分布均匀,无闭合孔隙,孔隙之间连通良好,并可见多处互通的微孔,孔径180~250μm,孔壁间结合状态良好,另一侧支架表面未与内部孔隙相通,体内降解速率及组织相容性观察显示这种方法构建的PPOCP三维多孔细胞支架在体内降解速度在1~2个月,组织相容性好,有血管、细胞长入支架。
(2)干细胞的分离培养、定向诱导培养,采用密度梯度离心分离骨髓单个核细胞,采用层粘连蛋白贴壁筛选、EPC专用培养基纯化培养EPC,用密度梯度离心及贴壁方法分离培养MSCs,通过添加相应诱导剂(包括选自细胞因子EGF、bFGF、HGF、SCF、VEGF、NGF、TGF-β及地塞米松、5-氮胞苷、胰岛素、维生素C、脑垂体提取物等一种或几种),与相应细胞(包括选自上皮类细胞、肌细胞、软骨细胞、神经干细胞中的一种)以不同方式(直接接触共培养、通过Transwell小皿间接共培养及相应细胞裂解液或培养上清液共培养等方式)混合培养模拟体内微环境的方法改变培养条件,诱导MSCs向上皮细胞、肌细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞等定向分化。
(3)制备细胞-生物可降解材料复合物,分别将EPC与不同分化状态的MSCs分批、分层种植于PPOCP三维多孔细胞支架上,体外构建细胞-生物可降解材料复合物。
细胞-生物可降解材料复合物的应用:上述得到的细胞-生物可降解材料复合物上的细胞增殖、生长、表达,此过程中通过光镜、电镜检查均可见细胞在支架上生长,24h后细胞呈梭形粘附于PPOCP细胞支架上,此后细胞逐渐沿孔壁生长,相互连接形成三维复层结构,且随时间的增加,细胞数量不断增加,并表达血管内皮细胞、肌细胞、上皮类细胞等相应标志物,得到用于修复组织缺损的复合细胞载体移植物。
实施例2
将实施例1得到的用于修复组织缺损的复合细胞载体移植物进行体内移植修复皮肤组织损伤:(1)选择新西兰大白兔复制全层皮肤缺损模型,将体外构建好的干细胞复合PPOCP载体移植物移植于皮肤缺损区;(2)术后观察创面修复可见移植物外表干燥,随时间增加,白色泡沫状的移植物逐渐降解,创面及移植物新鲜湿润,4周左右移植物完全形成新生皮肤,而单纯移植未种植干细胞的PPOCP材料的创面收缩明显,且新生皮肤上兔毛生长较少,而使用干细胞与PPOCP复合物修复的创面收缩不明显,且外观上基本接近正常皮肤,冰冻切片HE染色结果显示移植了干细胞与PPOCP复合物形成的新生皮肤结构和正常皮肤基本相同,形成了正常的表皮层、皮下组织层及真皮层,并可见有皮肤附属器——毛发、皮脂腺、汗腺等形成,仅移植了PPOCP支架形成的新生皮肤也可见有表皮层、皮下组织层及真皮层的形成,但真皮层内可见增厚的纤维瘢痕,且除少量毛发外未见其它附属器的形成。
实施例3
根据组织需要,PPOCP材料被塑成椭圆行囊状,将实施例1得到的用于修复组织缺损的复合细胞载体移植物进行体内移植修复膀胱组织缺损:(1)采用实验用犬行保留膀胱三角区的膀胱次全切除术,将体外构建好的干细胞复合PPOCP载体移植物植入膀胱缺损区进行膀胱重建;(2)术后4周,8周,12周,16周进行尿流动力学观察,显示使用干细胞与PPOCP复合物修复的膀胱容量接近术前正常水平,膀胱顺应性与术前无差异,而单纯移植未种植干细胞的PPOCP材料的膀胱容量只有术前一半体积,仅能提供很小的储水能力,膀胱顺应性也只及术前正常一半水平;X线膀胱造影显示,使用干细胞与PPOCP复合物修复的膀胱充盈,在体积和轮廓上保持正常,而单纯移植未种植干细胞的PPOCP材料的膀胱可见部分塌陷,两者密封性能都较好;组织学和免疫组化染色显示,术后4周可见使用干细胞与PPOCP复合物修复的膀胱完全被上皮细胞所覆盖,免疫组化染色α-actin阳性表达,8周生物材料全部降解,而单纯移植未种植干细胞的PPOCP材料的膀胱仅见纤维组织增生覆盖,并有炎症细胞侵润,α-actin呈阴性。
Claims (10)
1.细胞-生物可降解材料复合物,其特征在于,该复合物由聚对苯二甲酸丁二醇酯/聚乙二醇/低聚乳酸(PBT/PEG/OLA)三元共聚酯(PPOCP)三维多孔细胞支架、干细胞构成,所述的干细胞种植在PPOCP三维多孔细胞支架上。
2.根据权利要求1所述的细胞-生物可降解材料复合物,其特征在于,所述的干细胞包括内皮祖细胞(EPC)、间充质干细胞(MSCs)及各种组织特异干细胞。
3.一种权利要求1所述的细胞-生物可降解材料复合物的制备方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
(1)聚对苯二甲酸丁二醇酯/聚乙二醇/低聚乳酸(PBT/PEG/OLA)三元共聚酯(PPOCP)三维多孔细胞支架的构建:对PPOCP采用盐粒致孔剂和常温亚模相结合的方法构建PPOCP三维多孔细胞支架;
(2)干细胞的分离培养、定向诱导培养:对干细胞进行分离培养,改变培养条件诱导干细胞定向分化;
(3)细胞-生物可降解材料复合物的制备:将步骤(2)得到的干细胞种植于步骤(1)得到的PPOCP三维多孔细胞支架上,得到细胞-生物可降解材料复合物。
4.根据权利要求3所述的细胞-生物可降解材料复合物的制备方法,其特征在于,所述的构建PPOCP三维多孔细胞支架的方法包括筛分致孔剂、均匀混合、倾入模具、挥发、干燥、去除致孔剂、干燥,得到PPOCP三维多孔细胞支架。
5.根据权利要求3所述的细胞-生物可降解材料复合物的制备方法,其特征在于,所述的干细胞包括内皮祖细胞(EPC)、间充质干细胞(MSCs)及各种组织特异干细胞。
6.根据权利要求3所述的细胞-生物可降解材料复合物的制备方法,其特征在于,所述的分离培养的方法包括密度梯度离心法、贴壁法。
7.根据权利要求3所述的细胞-生物可降解材料复合物的制备方法,其特征在于,所述的改变培养条件包括添加相应诱导剂、与相应细胞以不同方式混合培养模拟体内微环境。
8.根据权利要求7所述的细胞-生物可降解材料复合物的制备方法,其特征在于,所述的相应诱导包括选自细胞因子EGF、bFGF、HGF、SCF、VEGF、NGF或TGF-β,以及地塞米松、5-氮胞苷、胰岛素、维生素C或脑垂体提取物,所述的相应细胞包括选自上皮类细胞、肌细胞、软骨细胞或神经干细胞,所述的不同方式包括直接接触共培养、通过Transwell小皿间接共培养及相应细胞裂解液或培养上清液共培养等方式。
9.一种权利要求1所述的细胞-生物可降解材料复合物的应用,其特征在于,该细胞-生物可降解材料复合物用于制备修复损伤组织器官的复合细胞载体移植物。
10.根据权利要求9所述的细胞-生物可降解材料复合物的应用,其特征在于,所述的修复损伤组织器官包括修复损伤皮肤、脂肪、尿道、膀胱、软骨组织、肌组织、肌腱。
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