CN103372233A - 一种组织工程化软骨移植物的制备方法及产品 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种组织工程化软骨移植物的制备方法及产品，它是采用冷冻-冻干法将PLGA丝线编织网，整合-到胶原-壳聚糖支架中，形成PLGA编织网/胶原-壳聚糖复合支架；将浓度大于1x107个/ml的软骨细胞添加到纤维蛋白凝胶中并充分混匀细胞，将细胞-纤维蛋白混合液接种于上述支架中，形成组织工程移植物；本发明采用具有优良力学特性的可降解生物材料支架复合千万级有功能的软骨种子细胞，形成的组织工程化软骨移植物可被粘合固定，亦可被缝合加固，可小切口递送，适合修复各种大小和难度的软骨缺损，且效果显著。
Description
技术领域
本发明涉及一种组织工程化软骨移植物的制备方法及产品，属于药品的技术领域。
背景技术
关节软骨属于透明软骨，自身没有血液供应，无淋巴引流，无神经分布，软骨细胞是高度分化的组织细胞，成熟的关节软骨细胞的分裂能力有限，因此，人体的软骨一旦受到损伤，无法自行愈合。其中关节软骨损伤的治疗一直是困扰骨科基础研究与临床治疗的棘手问题。我国骨关节炎发病率为3％，每年有近千万的新增软骨损伤病人，且随着社会的现代化进城和人口的老龄化，由外伤和退变引起的关节软骨损伤患者逐渐增多，为此，如何解决关节软骨修复的问题日益显得重要。
目前临床治疗关节软骨损伤的方法有药物治疗、关节腔冲洗、骨髓刺激等，其中药物治疗的效果不显著；关节腔冲洗和骨髓刺激的处理方式效果显著，但只能维持1至2年。以上治疗方法效果有限且不能持续的根本原因是这些方法不能进行关节软骨缺损修复、阻止疾病的进一步发展。组织工程化软骨移植技术作为组织再生科学应用于治疗软骨缺损的一项技术，具有组织功能再生优势，能有效地阻断病变，恢复关节功能。而在组织工程化软骨移植技术中，软骨移植物的制备尤其重要，其直接影响软骨缺损部位的修复效果。且现有的制备方法原料成本高、工艺复杂，不易操作，制备成本高，每平方厘米1500元左右。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于：提供一种组织工程化软骨移植物的制备方法及产品。本发明的制备方法原料成本低、工艺简单、易操作、制备成本可大幅降低。
为解决上述技术问题，本发明是这样实现的：
一种组织工程化软骨移植物的制备方法，所述方法为：采用冷冻-冻干法将PLGA丝线编织网，整合-到胶原-壳聚糖支架中，形成PLGA编织网/胶原-壳聚糖复合支架；将浓度大于1x107个/ml的软骨细胞添加到纤维蛋白凝胶中并充分混匀细胞，将细胞-纤维蛋白混合液接种于上述支架中，形成组织工程移植物。
前述的组织工程化软骨移植物的制备方法为：先用编织机将PLGA丝线编织成网，用丙酮清洗1-3次，去离子水清洗2-5次，每次10-50min；然后在真空30-60℃下干燥20-50h，80-120℃下撑幅定型30-45h，得到厚度为0.5-1.0mm，相对孔径为250-350μm的PLGA编织网；将上述PLGA编织网裁剪成边长为2-5cm的正方形并置于模具中，注入胶原-壳聚糖混合溶液0.5-3ml/m2，经过零下90-120℃冷冻-冻干处理10-36h，待溶剂完全升华后即获得厚度为0.1-0.3cm的PLGA编织网/胶原-壳聚糖复合支架；将浓度＞1x107个/ml的软骨细胞经0.1-0.4％胰酶消化离心，用20-30mmol/L的氯化钙溶液重悬混匀成单细胞悬液；将凝血酶溶于上述含软骨细胞的氯化钙溶液中，使氯化钙溶液中含凝血酶的浓度为60-120U/ml，得溶液A；将纤维蛋白原粉末溶解于PBS溶液中，使PBS溶液中含纤维蛋白的浓度为50-100mg/ml，得溶液B；使用一次性医用双联注射器分别吸取等量的溶液A和B，缓慢同时轻推两侧，将混合后的纤维蛋白胶均匀的涂抹在支架上，形成组织工程化软骨移植物，将上述组织工程化软骨移植物置于培养皿中于37℃、5％二氧化碳培养箱培养50-90h，进行双层无菌包装，储存于1-8℃专业医用冷链内，即得。
具体地说，前述的组织工程化软骨移植物的制备方法为：先用编织机将PLGA丝线编织成网，用丙酮清洗1次，去离子水清洗3次，每次15min；然后在真空45℃下干燥36h，105℃下撑幅定型36h，得到厚度为0.8mm，相对孔径为300μm的PLGA编织网；将上述PLGA编织网裁剪成边长为4cm的正方形并置于模具中，注入胶原-壳聚糖混合溶液1ml/m2，经过零下105℃冷冻-冻干处理20-30h，待溶剂完全升华后即获得厚度为0.2cm的PLGA编织网/胶原-壳聚糖复合支架；将浓度＞1x107个/ml的软骨细胞经0.25％胰酶消化离心，用40mmol/L氯化钙溶液重悬混匀成单细胞悬液；将凝血酶溶于上述含软骨细胞的氯化钙溶液中，使氯化钙溶液中含凝血酶的浓度为80-100U/ml，得溶液A；将纤维蛋白原粉末溶解于PBS溶液中，使PBS溶液中含纤维蛋白的浓度为60-80mg/ml，得溶液B；使用一次性医用双联注射器分别吸取等量的溶液A和B，缓慢同时轻推两侧，将混合后的纤维蛋白胶均匀的涂抹在支架上，形成组织工程化软骨移植物，将上述组织工程化软骨移植物置于培养皿中于37℃、5％二氧化碳培养箱培养72h，进行双层无菌包装，储存于4℃专业医用冷链内，即得。
前述的组织工程化软骨移植物的制备方法中，所述的胶原-壳聚糖混合溶液以体积比计算，为I型胶原蛋白液∶20g/L壳聚糖＝6-9∶4-1。
具体地说，所述的胶原-壳聚糖混合溶液以体积比计算，为I型胶原蛋白液∶20g/L壳聚糖＝9∶1。
前述的组织工程化软骨移植物的制备方法中，所述浓度＞1x107个/ml的软骨细胞的是这样制备的：关节镜下采集患者自体关节软骨180mg，洁净室安全柜内进行软骨细胞分离操作，软骨放入无菌缓冲液中切割至＜1mmx1mm大小，加入0.01-0.1％混合胶原酶，30-45度振荡消化5-15h后，过滤除去未消化的软骨组织块，过滤液1000-1500rpm离心5-15min，沉淀用细胞级PBS洗1-3次，加入DMEM/F12培养液混匀后按细胞浓度2x104-2x106个/ml接种到T75FLASK内，37℃，5％二氧化碳培养箱内培养，每隔1-3天换DMEM/F12培养液1次，培养代次不超过P2。
具体地说，所述浓度＞1x107个/ml的软骨细胞的是这样制备的：关节镜下采集患者自体关节软骨180mg，洁净室安全柜内进行软骨细胞分离操作，软骨放入无菌缓冲液中切割至＜1mmx1mm大小，加入0.05％混合胶原酶，37度振荡消化10小时后，过滤除去未消化的软骨组织块，过滤液1200rpm离心10min，沉淀用细胞级PBS洗1次，加入DMEM/F12培养液混匀后按细胞浓度2x105个/ml接种到T75FLASK内，37℃，5％二氧化碳培养箱内培养，每隔2天换液换DMEM/F12培养液1次，培养代次不超过P2。
一种按照前述方法制备的组织工程化软骨移植物。
骨关节疾病是关节软骨由于外伤和退行性变等原因出现损伤，从而导致关节长期的疼痛和功能障碍，甚至关节废用，而关节软骨无血液供应和神经支配，并且软骨细胞的低代谢活性和高密度的细胞外基质限制了软骨细胞向缺损区域移行并修复。因此，关节软骨在损伤后几乎不能自发修复。在某些情况下虽可发生自发性修复反应，但新生的组织主要以纤维软骨组织为主，与正常透明软骨的组织结构和化学成分有很大的不同，并且在生理负荷下会很快发生退行性变，最终发展成骨性关节炎。为此，关节软骨缺损的修复一直是骨科研究的热点问题。组织工程是生物医学和材料学交叉融合的产物。它应用生命科学和工程学的原理及方法构建工程组织，通过认识哺乳动物正常和病理组织的结构功能关系，研究开发生物代用品，从而达到修复、维持或改善人体组织、器官形态和功能的目的。软骨组织工程主要是在体外培养、扩增软骨种子细胞，并以较高密度将其种植与具有良好生物相容性和降解性的支架材料上，在多种调节因素的作用下经过一定周期形成组织工程化软骨。自体软骨细胞是目前最好的软骨组织工程细胞来源，其最大的优点是可以避免免疫排斥反应，但在体外培养时增值能力较低，经过传代培养易发生分化，其ECM中蛋白聚糖表达较弱，胶原表型表达易由II型转向I型和III型，加之在实际操作中难以从少量组织经体外培养扩增出大量有正常功能的软骨细胞，从而限制了它的应用。申请人经过大量的研究，采用胶原酶消化法对软骨细胞进行分离，减少了细胞的损伤，提高了细胞的存活率，保持细胞表型，获得了高质量的软骨细胞。成功解决了上述技术问题。
与现有技术相比较，本发明还具有如下优点：
1、现有技术中，所用支架材料均是将PLGA溶于有机溶剂再制备多孔的PLGA膜，本发明采用PLGA线编织成网，具有类似三维多孔结构，大大加强了支架的机械强度，工艺简单，还减少成本。此外，丙酮和水清洗可去除编织网表面的有机及无机污渍；真空干燥可去除上一步清洗时残留的水；冷冻冻干使得壳聚糖和胶原脱水粘覆于PLGA上，形成PLGA-胶原-壳聚糖支架，冻干时间不足会导致壳聚糖和胶原粘覆不牢固，容易脱落，冻干时间过长又会导致支架因过度脱水缺乏韧性，申请人经研究发现，本发明中，冻干时间在10-36h时，较为适宜，其中冻干时间在20-30h时，效果最佳。
2、细胞的分离培养中，振荡消化可加速组织消化过程，较快分离得到软骨细胞，且避免损伤，研究发现，在37度振荡消化效果可达到最佳。接种密度很关键，低密度接种软骨细胞易在短时期内凋亡，研究发现，在细胞浓度为2x104-2x106个/ml时接种，软骨细胞可以依赖相邻同源细胞释放的自分泌信号分子而在体外较好存活，其中在细胞浓度为2x105个/ml时接种，效果可达到最佳。培养代次不超过P2，可较好维持软骨细胞的特性。
3、现有技术中，均是将细胞直接种植于支架表面，本发明是将软骨细胞与纤维蛋白胶混合物接种于支架上形成三维立体的结构，软骨细胞能快速增殖，且保持细胞表型，能在短时间的培养提高细胞的数量与质量，并随着细胞迁移，细胞能与支架贴附、伸展。
4、PLGA(聚乳酸-羟基乙酸共聚物)由两种单体——乳酸和羟基乙酸随机聚合而成，是一种可降解的功能高分子有机化合物，具有良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能；本发明采用具有优良力学特性的PLGA这种可降解生物材料支架复合千万级有功能的软骨种子细胞，形成的组织工程化软骨移植物，可根据患者缺损特点预制材料的大小与形状，可被粘合固定，亦可被缝合加固，可小切口递送，适合修复各种大小和难度的软骨缺损。
5、本发明中PLGA可根据手术需求编制不同孔径的编织网，控制冻干时间可以调整编织网厚度；复合的胶原、壳聚糖天然来源的大分子其优良的生物相容性使复合支架本身的生物学性能得以保持，有利于细胞的粘附、增殖和分泌，是一种适用于组织工程生物材料。
6、种子细胞为患者自体软骨细胞，微创关节镜下取微量软骨，创伤小，且避免异体来源的免疫排斥反应。
7、与现有技术比较，在制品效果相当的情况下，本发明的制备方法原料成本低、工艺简单，易操作，制备成本大幅度降低，可以降低到500元/平方厘米以下。
为证实本发明的有效作用，我们进行了相关实验研究：
实验例：
取3个月龄新西兰兔股骨内髁制备直径4mm，深3mm关节软骨缺损模型，24只新西兰兔随机分为3组，分别进行移植手术，1组、PLGA编织网/胶原-壳聚糖复合支架/软骨细胞组；2组、医用胶原支架/软骨细胞组；3组、空白对照组。移植6、12周后进行观察及Wakitani评分评估修复效果。
结果：参见图1和2，6周和12周后1组(即实验组)再生组织与正常关节软骨面平齐，修复部位表面较平整，界限模糊，接近正常软骨。2组(即对照组(医用胶原支架))修复组织表面不平整并有明显下陷，修复组织全层可见成纤维样细胞，深层可见少数透明软骨样细胞。3组(即对照组(空白))未见明显修复，肉芽组织形成伴成纤维样细胞增殖；Wakitani组织学评分可见在不同的时间段1组和2组均低于3组，差异有统计学意义(P＜0.05))，1组和2组间组织学评分差异无统计学意义(P＞0.05)。详见附图。
结论：以软骨细胞-PLGA编织网/胶原-壳聚糖复合支架进行组织工程化软骨对兔关节软骨损伤有修复作用，形成新生软骨为透明软骨样组织。
附图说明
图1是术后6周Wakitani组织学评分柱状图，其中*代表P＜0.05；
图2是术后12周Wakitani组织学评分柱状图，其中*代表P＜0.05；
具体实施方式
本发明的实施例1：
①软骨细胞的制备
关节镜下采集患者自体关节软骨180mg，洁净室安全柜内进行软骨细胞分离操作，软骨放入无菌缓冲液中切割至＜1mmx1mm大小，加入0.05％混合胶原酶，37度振荡消化10小时后，过滤除去未消化的软骨组织块，过滤液1200rpm离心10min，沉淀用细胞级PBS洗1次，加入DMEM/F12培养液混匀后按细胞浓度2x105个/ml接种到T75FLASK内，37℃，5％二氧化碳培养箱内培养，每隔2天换液换DMEM/F12培养液1次，培养代次不超过P2，以保证软骨细胞特性；
②支架制备
先用编织机将PLGA丝线编织成网，用丙酮清洗1次，去离子水清洗3次，每次15min；然后在真空45℃下干燥36h，105℃下撑幅定型36h，得到厚度为0.8mm，相对孔径为300μm的PLGA编织网；将上述PLGA编织网裁剪成边长为4cm的正方形并置于模具中，注入胶原-壳聚糖混合溶液(I型胶原蛋白液与20g/L壳聚糖的体积比为9∶1)1ml/m2，经过零下105℃冷冻-冻干处理20-30h，待溶剂完全升华后即获得厚度为0.2cm的PLGA编织网/胶原-壳聚糖复合支架；
③组织工程化软骨细胞移植物制备
将步骤②培养的软骨细胞经将浓度＞1x107个/ml的软骨细胞经0.25％胰酶消化离心，用40mmol/L氯化钙溶液重悬混匀成单细胞悬液；将凝血酶溶于上述含软骨细胞的氯化钙溶液中，使氯化钙溶液中含凝血酶的浓度为80-100U/ml，得溶液A；将纤维蛋白原粉末溶解于PBS溶液中，使PBS溶液中含纤维蛋白的浓度为60-80mg/ml，得溶液B；使用一次性医用双联注射器分别吸取等量的溶液A和B，缓慢同时轻推两侧，将混合后的纤维蛋白胶均匀的涂抹在支架上，形成组织工程化软骨移植物，将上述组织工程化软骨移植物置于培养皿中于37℃、5％二氧化碳培养箱培养72h，进行双层无菌包装，储存于4℃专业医用冷链内；
由专业人士运送至医院，医生进行回植手术。
本发明的实施例2：
①软骨细胞的制备
关节镜下采集患者自体关节软骨180mg，洁净室安全柜内进行软骨细胞分离操作，软骨放入无菌缓冲液中切割至＜1mmx1mm大小，加入0.01％混合胶原酶，30度振荡消化5h后，过滤除去未消化的软骨组织块，过滤液1000rpm离心15min，沉淀用细胞级PBS洗2次，加入DMEM/F12培养液混匀后按细胞浓度2x104个/ml接种到T75FLASK内，37℃，5％二氧化碳培养箱内培养，每隔2天换DMEM/F12培养液1次，培养代次不超过P2，以保证软骨细胞特性；
②支架制备
先用编织机将PLGA丝线编织成网，用丙酮清洗2次，去离子水清洗2次，每次10min；然后在真空30℃下干燥20h，80℃下撑幅定型30h，得到厚度为0.5mm，相对孔径为250μm的PLGA编织网；将上述PLGA编织网裁剪成边长为2cm的正方形并置于模具中，注入胶原-壳聚糖混合溶液(I型胶原蛋白液与20g/L壳聚糖的体积比为8∶2)0.5ml/m2，经过零下90℃冷冻-冻干处理10h，待溶剂完全升华后即获得厚度为0.1cm的PLGA编织网/胶原-壳聚糖复合支架；
③组织工程化软骨细胞移植物制备
将步骤②培养的软骨细胞经0.1％胰酶消化离心，用20mmol/L的氯化钙溶液重悬混匀成单细胞悬液；将凝血酶溶于上述含软骨细胞的氯化钙溶液中，使氯化钙溶液中含凝血酶的浓度为100-120U/ml，得溶液A；将纤维蛋白原粉末溶解于PBS溶液中，使PBS溶液中含纤维蛋白的浓度为80-100mg/ml，得溶液B；使用一次性医用双联注射器分别吸取等量的溶液A和B，缓慢同时轻推两侧，将混合后的纤维蛋白胶均匀的涂抹在支架上，形成组织工程化软骨移植物，将上述组织工程化软骨移植物置于培养皿中于37℃、5％二氧化碳培养箱培养50h，进行双层无菌包装，储存于1℃专业医用冷链内；
由专业人士运送至医院，医生进行回植手术。
本发明的实施例3：
①软骨细胞的制备
关节镜下采集患者自体关节软骨180mg，洁净室安全柜内进行软骨细胞分离操作，软骨放入无菌缓冲液中切割至＜1mmx1mm大小，加入0.1％混合胶原酶，45度振荡消化15h后，过滤除去未消化的软骨组织块，过滤液1500rpm离心5min，沉淀用细胞级PBS洗3次，加入DMEM/F12培养液混匀后按细胞浓度2x106个/ml接种到T75FLASK内，37℃，5％二氧化碳培养箱内培养，每隔3天换DMEM/F12培养液1次，培养代次不超过P2，以保证软骨细胞特性；
②支架制备
先用编织机将PLGA丝线编织成网，用丙酮清洗3次，去离子水清洗5次，每次50min；然后在真空60℃下干燥50h，120℃下撑幅定型45h，得到厚度为1.0mm，相对孔径为350μm的PLGA编织网；将上述PLGA编织网裁剪成边长为5cm的正方形并置于模具中，注入胶原-壳聚糖混合溶液(I型胶原蛋白液与20g/L壳聚糖的体积比为6∶4)3ml/m2，经过零下120℃冷冻-冻干处理36h，待溶剂完全升华后即获得厚度为0.3cm的PLGA编织网/胶原-壳聚糖复合支架；
③组织工程化软骨细胞移植物制备
将步骤②培养的软骨细胞经0.4％胰酶消化离心，用30mmol/L的氯化钙溶液重悬混匀成单细胞悬液；将凝血酶溶于上述含软骨细胞的氯化钙溶液中，使氯化钙溶液中含凝血酶的浓度为60-80U/ml，得溶液A；将纤维蛋白原粉末溶解于PBS溶液中，使PBS溶液中含纤维蛋白的浓度为50-60mg/ml，得溶液B；使用一次性医用双联注射器分别吸取等量的溶液A和B，缓慢同时轻推两侧，将混合后的纤维蛋白胶均匀的涂抹在支架上，形成组织工程化软骨移植物，将上述组织工程化软骨移植物置于培养皿中于37℃、5％二氧化碳培养箱培养90h，进行双层无菌包装，储存于8℃专业医用冷链内；
由专业人士运送至医院，医生进行回植手术。
Claims (8)
1.一种组织工程化软骨移植物的制备方法，其特征在于：采用冷冻-冻干法将PLGA丝线编织网，整合-到胶原-壳聚糖支架中，形成PLGA编织网/胶原-壳聚糖复合支架；将浓度大于1x107个/ml的软骨细胞添加到纤维蛋白凝胶中并充分混匀细胞，将细胞-纤维蛋白混合液接种于上述支架中，形成组织工程移植物。
2.如权利要求1所述的组织工程化软骨移植物的制备方法，其特征在于：先用编织机将PLGA丝线编织成网，用丙酮清洗1-3次，去离子水清洗2-5次，每次10-50min；然后在真空30-60℃下干燥20-50h，80-120℃下撑幅定型30-45h，得到厚度为0.5-1.0mm，相对孔径为250-350μm的PLGA编织网；将上述PLGA编织网裁剪成边长为2-5cm的正方形并置于模具中，注入胶原-壳聚糖混合溶液0.5-3ml/m2，经过零下90-120℃冷冻-冻干处理10-36h，待溶剂完全升华后即获得厚度为0.1-0.3cm的PLGA编织网/胶原-壳聚糖复合支架；将浓度＞1x107个/ml的软骨细胞经0.1-0.4％胰酶消化离心，用20-30mmol/L的氯化钙溶液重悬混匀成单细胞悬液；将凝血酶溶于上述含软骨细胞的氯化钙溶液中，使氯化钙溶液中含凝血酶的浓度为60-120U/ml，得溶液A；将纤维蛋白原粉末溶解于PBS溶液中，使PBS溶液中含纤维蛋白的浓度为50-100mg/ml，得溶液B；使用一次性医用双联注射器分别吸取等量的溶液A和B，缓慢同时轻推两侧，将混合后的纤维蛋白胶均匀的涂抹在支架上，形成组织工程化软骨移植物，将上述组织工程化软骨移植物置于培养皿中于37℃、5％二氧化碳培养箱培养50-90h，进行双层无菌包装，储存于1-8℃专业医用冷链内，即得。
3.如权利要求2所述的组织工程化软骨移植物的制备方法，其特征在于：先用编织机将PLGA丝线编织成网，用丙酮清洗1次，去离子水清洗3次，每次15min；然后在真空45℃下干燥36h，105℃下撑幅定型36h，得到厚度为0.8mm，相对孔径为300μm的PLGA编织网；将上述PLGA编织网裁剪成边长为4cm的正方形并置于模具中，注入胶原-壳聚糖混合溶液1ml/m2，经过零下105℃冷冻-冻干处理20-30h，待溶剂完全升华后即获得厚度为0.2cm的PLGA编织网/胶原-壳聚糖复合支架；将浓度＞1x107个/ml的软骨细胞经0.25％胰酶消化离心，用40mmol/L氯化钙溶液重悬混匀成单细胞悬液；将凝血酶溶于上述含软骨细胞的氯化钙溶液中，使氯化钙溶液中含凝血酶的浓度为80-100U/ml，得溶液A；将纤维蛋白原粉末溶解于PBS溶液中，使PBS溶液中含纤维蛋白的浓度为60-80mg/ml，得溶液B；使用一次性医用双联注射器分别吸取等量的溶液A和B，缓慢同时轻推两侧，将混合后的纤维蛋白胶均匀的涂抹在支架上，形成组织工程化软骨移植物，将上述组织工程化软骨移植物置于培养皿中于37℃、5％二氧化碳培养箱培养72h，进行双层无菌包装，储存于4℃专业医用冷链内，即得。
4.如权利要求2或3所述的组织工程化软骨移植物的制备方法，其特征在于：所述的胶原-壳聚糖混合溶液以体积比计算，为I型胶原蛋白液∶20g/L壳聚糖＝6-9∶4-1。
5.如权利要求4所述的组织工程化软骨移植物的制备方法，其特征在于：所述的胶原-壳聚糖混合溶液以体积比计算，为I型胶原蛋白液∶20g/L壳聚糖＝9∶1。
6.如权利要求1至3中任一项所述的组织工程化软骨移植物的制备方法，其特征在于：所述浓度＞1x107个/ml的软骨细胞的是这样制备的：关节镜下采集患者自体关节软骨180mg，洁净室安全柜内进行软骨细胞分离操作，软骨放入无菌缓冲液中切割至＜1mmx1mm大小，加入0.01-0.1％混合胶原酶，30-45度振荡消化5-15h后，过滤除去未消化的软骨组织块，过滤液1000-1500rpm离心5-15min，沉淀用细胞级PBS洗1-3次，加入DMEM/F12培养液混匀后按细胞浓度2x104-2x106个/ml接种到T75FLASK内，37℃，5％二氧化碳培养箱内培养，每隔1-3天换DMEM/F12培养液1次，培养代次不超过P2。
7.如权利要求6所述的组织工程化软骨移植物的制备方法，其特征在于：所述浓度＞1x107个/ml的软骨细胞的是这样制备的：关节镜下采集患者自体关节软骨180mg，洁净室安全柜内进行软骨细胞分离操作，软骨放入无菌缓冲液中切割至＜1mmx1mm大小，加入0.05％混合胶原酶，37度振荡消化10小时后，过滤除去未消化的软骨组织块，过滤液1200rpm离心10min，沉淀用细胞级PBS洗1次，加入DMEM/F12培养液混匀后按细胞浓度2x105个/ml接种到T75FLASK内，37℃，5％二氧化碳培养箱内培养，每隔2天换液换DMEM/F12培养液1次，培养代次不超过P2。
8.一种按照权利要求1至7中任一项所述方法制备的组织工程化软骨移植物。
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| CN2012101103400A CN103372233A (zh) | 2012-04-13 | 2012-04-13 | 一种组织工程化软骨移植物的制备方法及产品 |
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