CN107670110A - 一种纤维蛋白微结构复合心脏补片的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种纤维蛋白微结构复合心脏补片的制备方法，主要包括纤维蛋白微丝的制备、纤维蛋白微丝组织的形成、复合层制造及组织培养这三步。该方法制备的心脏补片将纤维蛋白微丝与纤维蛋白基水凝胶战略性地组合以产生复合层，这些纤维蛋白复合材料层开发的可植入多层心脏补片，其容易与周围组织整合，有类似于天然心肌的机械性和功能性，能够与天然心肌融为一体，支持细胞收缩性并促进细胞取向，以促进损伤的心室心肌组织的再生及与生理相关的收缩性，避免传统心脏工程支架在使用过程中功能及机械性上与天然心肌融合效果差等一些局限性。

Description

一种纤维蛋白微结构复合心脏补片的制备方法
技术领域
本发明涉及心脏植入材料技术领域，尤其涉及一种纤维蛋白微结构复合心脏补片的制备方法。
背景技术
在全球范围内，心血管疾病是造成死亡的主要原因，仅在美国就诊了50万例新的心力衰竭病例。导致心力衰竭的主要症状是心肌梗死(MI)，由缺氧引起的心脏组织损伤并最终降低了其功能性。心脏再生损伤心肌的能力有限，恢复心肌梗死后机体功能丧失。因此，需要极大地促进功能性心肌再生治疗方法的提高。
心脏补片可用于替代心脏中的瘢痕组织，并且特别适用于修复心室动脉瘤。然而，目前可用的支架是无细胞的，并且仅提供被动的结构支持。主动收缩的心脏支架可为患者提供更好的选择，因为它们可能有助于恢复心肌梗死后丧失的有效机械功能。目前促进受损心肌的主动再生的策略是使用由天然材料，合成材料，细胞外基质或脱细胞组织组成的支架。正在研究和整合有发展前景的生物材料和干细胞疗法的心脏“祖细胞”或工程组织的补片。也正在考虑将组织的心肌成分组合成可伸缩单位以引导心肌再生的模块化支架。虽然各种研究已经表明，工程支架能够收缩并且适度增加受伤心脏的机械功能，但仍然需要开发容易与周围组织整合的功能性工程化心脏补片，以促进心肌组织的再生与生理相关的收缩性。
纤维蛋白基水凝胶已经在心脏工程领域得到广泛的研究，细胞接种的水凝胶已经表现出诸如与新生大鼠心肌相当的高抽搐力的功能。然而，水凝胶通常机械性差，并且最终可能在心脏的动态负载环境中失效。因此，对于心脏再生方法来说，心脏补片能够在机械性和功能性上与天然心肌整合(融为一体)是至关重要的。为了实现这一点，心脏补片应该模仿天然心肌的性质。衍生天然生物聚合物如纤维蛋白的微丝已被研究应用于各种组织工程中。这些微丝显示出可调谐的机械性能并驱动细胞取向。
因此，本领域需要开发一种机械性好并且最终在心脏的动态负载环境中有效地复合材料补片，其容易与周围组织整合，能够在机械性和功能性上与天然心肌融为一体，以促进心肌组织的再生与生理相关的收缩性，从而避免传统工程支架使用过程中的一些局限性。
发明内容
针对现有技术中的问题，本发明提供一种纤维蛋白微结构复合心脏补片的制备方法，制备的心脏补片将纤维蛋白微丝与纤维蛋白基水凝胶战略性地组合以产生复合层，开发的微结构复合材料的离散层，可以用精确设计的结构力学性能制成工程心肌组织。
为实现以上技术目的，本发明的技术方案是：一种纤维蛋白微结构复合心脏补片的制备方法，其特征在于：其制备方法包括纤维蛋白微丝的制备、纤维蛋白微丝组织的形成和复合层制造及组织培养；
所述纤维蛋白微丝的制备按照如下进行：
s1，将从牛血浆分离的纤维蛋白原溶解在溶解在N-[2-羟乙基]哌嗪-N’-[2-乙磺酸]缓冲液中，得到纤维蛋白原溶液，储存在-20℃条件下；
s2，将来自牛血浆的凝血酶溶解在血红蛋白S中，得到凝血酶溶液，储存在-20℃条件下；
s3，将凝血酶溶液放在室温下解冻4-10h，然后加入交联剂氯化钙溶液混合均匀，装入一个1mL注射器中；
s4，将纤维蛋白原溶液放在室温下解冻4-10h，装入另一个1mL注射器中，然后将两个注射器注入混合施用器内混合得到混合液；
s5，通过内径为0.6-1.2mm的聚乙烯管将混合液挤出到N-[2-羟乙基]哌嗪-N’-[2-乙磺酸]缓冲液中，混合均匀后采用双注射泵以0.150-0.300mL/min的流速挤出到涂覆聚四氟乙烯的锅中聚合成丝；取出微丝并拉伸，在自身重力的张力下悬挂干燥；
所述纤维蛋白微丝组织的形成通过如下步骤实现：
s6，将纤维蛋白微丝一根根整齐摆放排列在定制的纤维蛋白微丝间隔物上，将纤维蛋白微丝均匀间隔开；
s7，采用医用级硅胶粘合剂将对准的微丝及间隔物固定在具有预切割窗口的牛皮纸框架上；
所述复合层制造及组织培养通过如下步骤完成：
s8，将聚二甲基硅氧烷片材进行高压蒸汽灭菌，并用无菌1％聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物去离子水溶液涂覆0.5-1.5h；
s9，将牛皮纸框架放入磷酸缓冲盐溶液中水化0.5-2.0h，然后置于s10内聚二甲基硅氧烷片材的顶端；
s10，将细胞、凝血酶和纤维蛋白原放在冰上混合形成水凝胶溶液；
s11，采用移液管将水凝胶溶液移入144mm2牛皮纸框内浇注，然后在37℃的培养箱中聚合30min，最后移入含有DMEM培养基的容器中保存。
所述s1中的纤维蛋白原溶液的浓度为40-100mg/mL，所述N-[2-羟乙基]哌嗪-N'-[2-乙磺酸]缓冲液的pH为7.4，组成为：血红蛋白S120mg/mL，20mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和0.9％NaCl。
所述s2中的凝血酶溶液的浓度为20-80U/mL。
所述s3中的交联剂氯化钙溶液的浓度为0-50mmol/L。
所述s3和s4中的维蛋白原溶液和凝血酶/氯化钙溶液是等体积分别装入注射器中。
所述s5中的聚合成丝的时间为10-30min，所述微丝拉伸长度为原始长度的120-180％。
所述s6中的纤维蛋白微丝的间距为50-200μm。
所述s10中的水凝胶溶液的各组分的含量为：细胞浓度为(1-5)×106个/mL、凝血酶浓度为(1-2)U/mL、纤维蛋白原的浓度为(2-5)mg/mL。
所述s11中的移入水凝胶的量(μL)与牛皮纸框内的面积(mm2)的比为(1.0-1.5)：1。
所述s11中的聚合时间为20-60min。
s1中的纤维蛋白原是一种由肝脏合成的具有凝血功能的蛋白质，可以促进血小板的聚集，促进平滑肌和内皮细胞的生长、增殖和收缩，增加血液粘滞性和外周阻力，引起内皮细胞损伤，促进胶原和去氧核糖核酸合成，趋化单核/巨噬细胞向内膜下迁移，促进红细胞粘着和血栓形成，因此，它在心血管疾病的发病中具有十分重要作用。
s2中的凝血酶又称纤维蛋白酶，其直接作用于血液凝固过程的最后一步，促使血浆中的可溶性纤维蛋白原转变成不溶的纤维蛋白，从而达到速效止血的目的。此外它还能促进上皮细胞的有丝分裂，加速创伤愈合，是一种速效的局部止血药，适用于结扎止血困难的小血管、毛细血管、实质性脏器的出血及其他各种出血。
s3中的采用交联剂为氯化钙溶液，高含量的氯化钙在与纤维蛋白原等支架材料发生反应的同时，也对成骨细胞的增殖与分化产生毒性作用，因而浓度及加入量不宜太高。此外，钙是体内发挥重要作用的无机离子之一，Ca2+可介导肌细胞兴奋-收缩耦联过程，参与血液凝固，调节神经递质的释放等许多生理生化反应。
s11中的DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养基的基础上研制的，与MEM比较增加了各种成分用量，为哺乳动物细胞培养提供卓越的质量、均一性和可控性。本实验DMEM培养基的主要成分如下：10％胎牛血清，2％热灭活马血清，1％青霉素-链霉素，1％两性霉素B，0.5％庆大霉素，1％GlutaMAX培养基，0.0007％B-巯基乙醇(以上均为质量分数)，50μg/mL抑肽酶和1.2mmol/L CaCl2和0.8mmol/L MgCl2，其中GlutaMAX培养基是值得信赖的标准细胞培养基，适用于贴壁和悬浮哺乳动物细胞的培养，几乎无需适应。其含有L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺稳定形式的二肽，L-谷氨酰胺是细胞培养中细胞进行能量生成以及蛋白质和核酸合成所必需的一种营养素。细胞培养基中的L-谷氨酰胺可自发降解，生成的副产物是氨和焦谷氨酸。L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽在水溶液中极为稳定，储存或孵育时不会像L-谷氨酰胺一样自发降解为氨。并可以防止在长期培养过程中谷氨酰胺的降解和氨的积累。
从以上描述可以看出，本发明具备以下优点：
1.本发明制备的心脏补片将纤维蛋白微丝与纤维蛋白基水凝胶战略性地组合以产生复合层，开发的微结构复合材料的离散层，可以用精确设计的结构力学性能制成工程心肌组织。
2.本发明制备的这些纤维蛋白复合材料层开发可植入的多层心脏补片有类似于天然心肌的机械性质，支持细胞收缩性并促进细胞取向，以促进损伤的心室心肌的再生。
具体实施方式
下面结合实例对本发明作进一步详细的说明，但并非是对本发明的进一步限定，根据本发明的上述内容作出其它形式的变更、替换等均属于本发明的内容，也均应包含在本发明的保护范围之内。
下述实例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均购于常规生化试剂厂商。其中溶剂均为分析纯，未经纯化使用。
实施例1
一种纤维蛋白微结构复合心脏补片的制备方法，其特征在于：其制备方法包括纤维蛋白微丝的制备、纤维蛋白微丝组织的形成和复合层制造及组织培养；
所述纤维蛋白微丝的制备按照如下进行：
s1，将从牛血浆分离的纤维蛋白原溶解在溶解在N-[2-羟乙基]哌嗪-N’-[2-乙磺酸]缓冲液中，得到纤维蛋白原溶液，储存在-20℃条件下；
s2，将来自牛血浆的凝血酶溶解在血红蛋白S中，得到凝血酶溶液，储存在-20℃条件下；
s3，将凝血酶溶液放在室温下解冻4h，然后加入交联剂氯化钙溶液混合均匀，装入一个1mL注射器中；
s4，将纤维蛋白原溶液放在室温下解冻4h，装入另一个1mL注射器中，然后将两个注射器注入混合施用器内混合得到混合液；
s5，通过内径为0.6mm的聚乙烯管将混合液挤出到N-[2-羟乙基]哌嗪-N’-[2-乙磺酸]缓冲液中，混合均匀后采用双注射泵以0.150mL/min的流速挤出到涂覆聚四氟乙烯的锅中聚合成丝；取出微丝并拉伸，在自身重力的张力下悬挂干燥；
所述纤维蛋白微丝组织的形成通过如下步骤实现：
s6，将纤维蛋白微丝一根根整齐摆放排列在定制的纤维蛋白微丝间隔物上，将纤维蛋白微丝均匀间隔开；
s7，采用医用级硅胶粘合剂将对准的微丝及间隔物固定在具有预切割窗口的牛皮纸框架上；
所述复合层制造及组织培养通过如下步骤完成：
s8，将聚二甲基硅氧烷片材进行高压蒸汽灭菌，并用无菌1％聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物去离子水溶液涂覆0.5h；
s9，将牛皮纸框架放入磷酸缓冲盐溶液中水化0.5h，然后置于s10内聚二甲基硅氧烷片材的顶端；
s10，将细胞、凝血酶和纤维蛋白原放在冰上混合形成水凝胶溶液；
s11，采用移液管将水凝胶溶液移入144mm2牛皮纸框内浇注，然后在37℃的培养箱中聚合30min，最后移入含有DMEM培养基的容器中保存。
所述s1中的纤维蛋白原溶液的浓度为40mg/mL，所述N-[2-羟乙基]哌嗪-N'-[2-乙磺酸]缓冲液的pH为7.4，组成为：血红蛋白S，20mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和0.9％NaCl。
所述s2中的凝血酶溶液的浓度为20U/mL。
所述s3中的交联剂氯化钙溶液的浓度为1mmol/L。。
所述s3和s4中的维蛋白原溶液和凝血酶/氯化钙溶液是等体积分别装入注射器中。
所述s5中的聚合成丝的时间为10min，所述微丝拉伸长度为原始长度的120％。
所述s6中的纤维蛋白微丝的间距为50μm。
所述s10中的水凝胶溶液的各组分的含量为：细胞浓度为1×106个/mL、凝血酶浓度为1U/mL、纤维蛋白原的浓度为2mg/mL。
所述s11中的移入水凝胶的量(μL)与牛皮纸框内的面积(mm2)的比为1：1。
所述s11中的聚合时间为20min。
实施例2
一种纤维蛋白微结构复合心脏补片的制备方法，其特征在于：其制备方法包括纤维蛋白微丝的制备、纤维蛋白微丝组织的形成和复合层制造及组织培养；
所述纤维蛋白微丝的制备按照如下进行：
s1，将从牛血浆分离的纤维蛋白原溶解在溶解在N-[2-羟乙基]哌嗪-N’-[2-乙磺酸]缓冲液中，得到纤维蛋白原溶液，储存在-20℃条件下；
s2，将来自牛血浆的凝血酶溶解在血红蛋白S中，得到凝血酶溶液，储存在-20℃条件下；
s3，将凝血酶溶液放在室温下解冻10h，然后加入交联剂氯化钙溶液混合均匀，装入一个1mL注射器中；
s4，将纤维蛋白原溶液放在室温下解冻10h，装入另一个1mL注射器中，然后将两个注射器注入混合施用器内混合得到混合液；
s5，通过内径为1.2mm的聚乙烯管将混合液挤出到N-[2-羟乙基]哌嗪-N’-[2-乙磺酸]缓冲液中，混合均匀后采用双注射泵以0.300mL/min的流速挤出到涂覆聚四氟乙烯的锅中聚合成丝；取出微丝并拉伸，在自身重力的张力下悬挂干燥；
所述纤维蛋白微丝组织的形成通过如下步骤实现：
s6，将纤维蛋白微丝一根根整齐摆放排列在定制的纤维蛋白微丝间隔物上，将纤维蛋白微丝均匀间隔开；
s7，采用医用级硅胶粘合剂将对准的微丝及间隔物固定在具有预切割窗口的牛皮纸框架上；
所述复合层制造及组织培养通过如下步骤完成：
s8，将聚二甲基硅氧烷片材进行高压蒸汽灭菌，并用无菌1％聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物去离子水溶液涂覆1.5h；
s9，将牛皮纸框架放入磷酸缓冲盐溶液中水化2.0h，然后置于s10内聚二甲基硅氧烷片材的顶端；
s10，将细胞、凝血酶和纤维蛋白原放在冰上混合形成水凝胶溶液；
s11，采用移液管将水凝胶溶液移入144mm2牛皮纸框内浇注，然后在37℃的培养箱中聚合30min，最后移入含有DMEM培养基的容器中保存。
所述s1中的纤维蛋白原溶液的浓度为100mg/mL，所述N-[2-羟乙基]哌嗪-N'-[2-乙磺酸]缓冲液的pH为7.4，组成为：血红蛋白S120mg/mL，20mmol/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和0.9％NaCl。
所述s2中的凝血酶溶液的浓度为80U/mL。
所述s3中的交联剂氯化钙溶液的浓度为50mmol/L。
所述s3和s4中的维蛋白原溶液和凝血酶/氯化钙溶液是等体积分别装入注射器中。
所述s5中的聚合成丝的时间为30min，所述微丝拉伸长度为原始长度的180％。
所述s6中的纤维蛋白微丝的间距为200μm。
所述s10中的水凝胶溶液的各组分的含量为：细胞浓度为5×106个/mL、凝血酶浓度为2U/mL、纤维蛋白原的浓度为5mg/mL。
所述s11中的移入水凝胶的量(μL)与牛皮纸框内的面积(mm2)的比为1.5：1。
所述s11中的聚合时间为60min。
实施例3
一种纤维蛋白微结构复合心脏补片的制备方法，其特征在于：其制备方法包括纤维蛋白微丝的制备、纤维蛋白微丝组织的形成和复合层制造及组织培养；
所述纤维蛋白微丝的制备按照如下进行：
s1，将从牛血浆分离的纤维蛋白原溶解在溶解在N-[2-羟乙基]哌嗪-N’-[2-乙磺酸]缓冲液中，得到纤维蛋白原溶液，储存在-20℃条件下；
s2，将来自牛血浆的凝血酶溶解在血红蛋白S中，得到凝血酶溶液，储存在-20℃条件下；
s3，将凝血酶溶液放在室温下解冻7h，然后加入交联剂氯化钙溶液混合均匀，装入一个1mL注射器中；
s4，将纤维蛋白原溶液放在室温下解冻7h，装入另一个1mL注射器中，然后将两个注射器注入混合施用器内混合得到混合液；
s5，通过内径为0.8mm的聚乙烯管将混合液挤出到N-[2-羟乙基]哌嗪-N’-[2-乙磺酸]缓冲液中，混合均匀后采用双注射泵以0.200mL/min的流速挤出到涂覆聚四氟乙烯的锅中聚合成丝；取出微丝并拉伸，在自身重力的张力下悬挂干燥；
所述纤维蛋白微丝组织的形成通过如下步骤实现：
s6，将纤维蛋白微丝一根根整齐摆放排列在定制的纤维蛋白微丝间隔物上，将纤维蛋白微丝均匀间隔开；
s7，采用医用级硅胶粘合剂将对准的微丝及间隔物固定在具有预切割窗口的牛皮纸框架上；
所述复合层制造及组织培养通过如下步骤完成：
s8，将聚二甲基硅氧烷片材进行高压蒸汽灭菌，并用无菌1％聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物去离子水溶液涂覆1h；
s9，将牛皮纸框架放入磷酸缓冲盐溶液中水化1.0h，然后置于s10内聚二甲基硅氧烷片材的顶端；
s10，将细胞、凝血酶和纤维蛋白原放在冰上混合形成水凝胶溶液；
s11，采用移液管将水凝胶溶液移入144mm2牛皮纸框内浇注，然后在37℃的培养箱中聚合30min，最后移入含有DMEM培养基的容器中保存。
所述s1中的纤维蛋白原溶液的浓度为60mg/mL，所述N-[2-羟乙基]哌嗪-N'-[2-乙磺酸]缓冲液的pH为7.4，组成为：血红蛋白S120mg/mL，20mmol/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和0.9％NaCl。
所述s2中的凝血酶溶液的浓度为40U/mL。
所述s3中的交联剂氯化钙溶液的浓度为20mmol/L。
所述s3和s4中的维蛋白原溶液和凝血酶/氯化钙溶液是等体积分别装入注射器中。
所述s5中的聚合成丝的时间为20min，所述微丝拉伸长度为原始长度的160％。
所述s6中的纤维蛋白微丝的间距为100μm。
所述s10中的水凝胶溶液的各组分的含量为：细胞浓度为2×106个/mL、凝血酶浓度为1U/mL、纤维蛋白原的浓度为3mg/mL。
所述s11中的移入水凝胶的量(μL)与牛皮纸框内的面积(mm2)的比为1.2：1。
所述s11中的聚合时间为30min。
实施例4
一种纤维蛋白微结构复合心脏补片的制备方法，其特征在于：其制备方法包括纤维蛋白微丝的制备、纤维蛋白微丝组织的形成和复合层制造及组织培养；
所述纤维蛋白微丝的制备按照如下进行：
s1，将从牛血浆分离的纤维蛋白原溶解在溶解在N-[2-羟乙基]哌嗪-N’-[2-乙磺酸]缓冲液中，得到纤维蛋白原溶液，储存在-20℃条件下；
s2，将来自牛血浆的凝血酶溶解在血红蛋白S中，得到凝血酶溶液，储存在-20℃条件下；
s3，将凝血酶溶液放在室温下解冻8h，然后加入交联剂氯化钙溶液混合均匀，装入一个1mL注射器中；
s4，将纤维蛋白原溶液放在室温下解冻8h，装入另一个1mL注射器中，然后将两个注射器注入混合施用器内混合得到混合液；
s5，通过内径为1.0mm的聚乙烯管将混合液挤出到N-[2-羟乙基]哌嗪-N’-[2-乙磺酸]缓冲液中，混合均匀后采用双注射泵以0.250mL/min的流速挤出到涂覆聚四氟乙烯的锅中聚合成丝；取出微丝并拉伸，在自身重力的张力下悬挂干燥；
所述纤维蛋白微丝组织的形成通过如下步骤实现：
s6，将纤维蛋白微丝一根根整齐摆放排列在定制的纤维蛋白微丝间隔物上，将纤维蛋白微丝均匀间隔开；
s7，采用医用级硅胶粘合剂将对准的微丝及间隔物固定在具有预切割窗口的牛皮纸框架上；
所述复合层制造及组织培养通过如下步骤完成：
s8，将聚二甲基硅氧烷片材进行高压蒸汽灭菌，并用无菌1％聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物去离子水溶液涂覆0.5h；
s9，将牛皮纸框架放入磷酸缓冲盐溶液中水化1.5h，然后置于s10内聚二甲基硅氧烷片材的顶端；
s10，将细胞、凝血酶和纤维蛋白原放在冰上混合形成水凝胶溶液；
s11，采用移液管将水凝胶溶液移入144mm2牛皮纸框内浇注，然后在37℃的培养箱中聚合30min，最后移入含有DMEM培养基的容器中保存。
所述s1中的纤维蛋白原溶液的浓度为80mg/mL，所述N-[2-羟乙基]哌嗪-N'-[2-乙磺酸]缓冲液的pH为7.4，组成为：血红蛋白S120mg/mL，20mmol/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和0.9％NaCl。
所述s2中的凝血酶溶液的浓度为60U/mL。
所述s3中的交联剂氯化钙溶液的浓度为30mmol/L。
所述s3和s4中的维蛋白原溶液和凝血酶/氯化钙溶液是等体积分别装入注射器中。
所述s5中的聚合成丝的时间为25min，所述微丝拉伸长度为原始长度的160％。
所述s6中的纤维蛋白微丝的间距为150μm。
所述s10中的水凝胶溶液的各组分的含量为：细胞浓度为4×106个/mL、凝血酶浓度为2U/mL、纤维蛋白原的浓度为4mg/mL。
所述s11中的移入水凝胶的量(μL)与牛皮纸框内的面积(mm2)的比为1.3：1。
所述s11中的聚合时间为50min。
实施例5
一种纤维蛋白微结构复合心脏补片的制备方法，其特征在于：其制备方法包括纤维蛋白微丝的制备、纤维蛋白微丝组织的形成和复合层制造及组织培养；
所述纤维蛋白微丝的制备按照如下进行：
s1，将从牛血浆分离的纤维蛋白原溶解在溶解在N-[2-羟乙基]哌嗪-N’-[2-乙磺酸]缓冲液中，得到纤维蛋白原溶液，储存在-20℃条件下；
s2，将来自牛血浆的凝血酶溶解在血红蛋白S中，得到凝血酶溶液，储存在-20℃条件下；
s3，将凝血酶溶液放在室温下解冻8h，然后加入交联剂氯化钙溶液混合均匀，装入一个1mL注射器中；
s4，将纤维蛋白原溶液放在室温下解冻8h，装入另一个1mL注射器中，然后将两个注射器注入混合施用器内混合得到混合液；
s5，通过内径为0.9mm的聚乙烯管将混合液挤出到N-[2-羟乙基]哌嗪-N’-[2-乙磺酸]缓冲液中，混合均匀后采用双注射泵以0.210mL/min的流速挤出到涂覆聚四氟乙烯的锅中聚合成丝；取出微丝并拉伸，在自身重力的张力下悬挂干燥；
所述纤维蛋白微丝组织的形成通过如下步骤实现：
s6，将纤维蛋白微丝一根根整齐摆放排列在定制的纤维蛋白微丝间隔物上，将纤维蛋白微丝均匀间隔开；
s7，采用医用级硅胶粘合剂将对准的微丝及间隔物固定在具有预切割窗口的牛皮纸框架上；
所述复合层制造及组织培养通过如下步骤完成：
s8，将聚二甲基硅氧烷片材进行高压蒸汽灭菌，并用无菌1％聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物去离子水溶液涂覆1.0h；
s9，将牛皮纸框架放入磷酸缓冲盐溶液中水化1.5h，然后置于s10内聚二甲基硅氧烷片材的顶端；
s10，将细胞、凝血酶和纤维蛋白原放在冰上混合形成水凝胶溶液；
s11，采用移液管将水凝胶溶液移入144mm2牛皮纸框内浇注，然后在37℃的培养箱中聚合30min，最后移入含有DMEM培养基的容器中保存。
所述s1中的纤维蛋白原溶液的浓度为70mg/mL，所述N-[2-羟乙基]哌嗪-N'-[2-乙磺酸]缓冲液的pH为7.4，组成为：血红蛋白S120mg/mL，20mmol/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和0.9％NaCl。
所述s2中的凝血酶溶液的浓度为50U/mL。
所述s3中的交联剂氯化钙溶液的浓度为40mmol/L。
所述s3和s4中的维蛋白原溶液和凝血酶/氯化钙溶液是等体积分别装入注射器中。
所述s5中的聚合成丝的时间为20min，所述微丝拉伸长度为原始长度的150％。
所述s6中的纤维蛋白微丝的间距为100μm。
所述s10中的水凝胶溶液的各组分的含量为：细胞浓度为3×106个/mL、凝血酶浓度为1U/mL、纤维蛋白原的浓度为2mg/mL。
所述s11中的移入水凝胶的量(μL)与牛皮纸框内的面积(mm2)的比为1.3：1。
所述s11中的聚合时间为40min。
综上所述，本发明具有以下优点：
1.本发明制备的心脏补片将纤维蛋白微丝与纤维蛋白基水凝胶战略性地组合以产生复合层，开发的微结构复合材料的离散层，可以用精确设计的结构力学性能制成工程心肌组织。
2.本发明制备的这些纤维蛋白复合材料层开发可植入的多层心脏补片有类似于天然心肌的机械性质，支持细胞收缩性并促进细胞取向，以促进损伤的心室心肌的再生。
可以理解的是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例所描述的技术方案。本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换，以达到相同的技术效果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种纤维蛋白微结构复合心脏补片的制备方法，其特征在于：其制备方法包括纤维蛋白微丝的制备、纤维蛋白微丝组织的形成和复合层制造及组织培养；
所述纤维蛋白微丝的制备按照如下进行：
s1，将从牛血浆分离的纤维蛋白原溶解在溶解在N-[2-羟乙基]哌嗪-N’-[2-乙磺酸]缓冲液中，得到纤维蛋白原溶液，储存在-20℃条件下；
s2，将来自牛血浆的凝血酶溶解在血红蛋白S中，得到凝血酶溶液，储存在-20℃条件下；
s3，将凝血酶溶液放在室温下解冻4-10h，然后加入交联剂氯化钙溶液混合均匀，装入一个1mL注射器中；
s4，将纤维蛋白原溶液放在室温下解冻4-10h，装入另一个1mL注射器中，然后将两个注射器注入混合施用器内混合得到混合液；
s5，通过内径为0.6-1.2mm的聚乙烯管将混合液挤出到N-[2-羟乙基]哌嗪-N’-[2-乙磺酸]缓冲液中，混合均匀后采用双注射泵以0.150-0.300mL/min的流速挤出到涂覆聚四氟乙烯的锅中聚合成丝；取出微丝并拉伸，在自身重力的张力下悬挂干燥；
所述纤维蛋白微丝组织的形成通过如下步骤实现：
s6，将纤维蛋白微丝一根根整齐摆放排列在定制的纤维蛋白微丝间隔物上，将纤维蛋白微丝均匀间隔开；
s7，采用医用级硅胶粘合剂将对准的微丝及间隔物固定在具有预切割窗口的牛皮纸框架上；
所述复合层制造及组织培养通过如下步骤完成：
s8，将聚二甲基硅氧烷片材进行高压蒸汽灭菌，并用无菌1％聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物去离子水溶液涂覆0.5-1.5h；
s9，将牛皮纸框架放入磷酸缓冲盐溶液中水化0.5-2.0h，然后置于s10内聚二甲基硅氧烷片材的顶端；
s10，将细胞、凝血酶和纤维蛋白原放在冰上混合形成水凝胶溶液；
s11，采用移液管将水凝胶溶液移入144mm2牛皮纸框内浇注，然后在37℃的培养箱中聚合30min，最后移入含有DMEM培养基的容器中保存。
2.根据权利要求1所述的一种纤维蛋白微结构复合心脏补片的制备方法，其特征在于：所述s1中的纤维蛋白原溶液的浓度为40-100mg/mL，所述N-[2-羟乙基]哌嗪-N'-[2-乙磺酸]缓冲液的pH为7.4，组成为：血红蛋白S120mg/mL，20mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和0.9％NaCl。
3.根据权利要求1所述的一种纤维蛋白微结构复合心脏补片的制备方法，其特征在于：所述s2中的凝血酶溶液的浓度为20-80U/mL。
4.根据权利要求1所述的一种纤维蛋白微结构复合心脏补片的制备方法，其特征在于：所述s3中的交联剂氯化钙溶液的浓度为0-50mmol/L。
5.根据权利要求1所述的一种纤维蛋白微结构复合心脏补片的制备方法，其特征在于：所述s3和s4中的维蛋白原溶液和凝血酶/氯化钙溶液是等体积分别装入注射器中。
6.根据权利要求1所述的一种纤维蛋白微结构复合心脏补片的制备方法，其特征在于：所述s5中的聚合成丝的时间为10-30min，所述微丝拉伸长度为原始长度的120-180％。
7.根据权利要求1所述的一种纤维蛋白微结构复合心脏补片的制备方法，其特征在于：所述s6中的纤维蛋白微丝的间距为50-200μm。
8.根据权利要求1所述的一种纤维蛋白微结构复合心脏补片的制备方法，其特征在于：所述s10中的水凝胶溶液的各组分的含量为：细胞浓度为(1-5)×106个/mL、凝血酶浓度为(1-2)U/mL、纤维蛋白原的浓度为(2-5)mg/mL。
9.根据权利要求1所述的一种纤维蛋白微结构复合心脏补片的制备方法，其特征在于：所述s11中的移入水凝胶的量(μL)与牛皮纸框内的面积(mm2)的比为(1.0-1.5)：1。
10.根据权利要求1所述的一种纤维蛋白微结构复合心脏补片的制备方法，其特征在于：所述s11中的聚合时间为20-60min。
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