CN100402097C - 琼脂/胶原皮肤创伤修复敷料及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种琼脂/胶原皮肤创伤修复敷料及其制备方法和应用，通过琼脂与胶原或明胶共混后冷冻干燥得到多孔复合支架或直接干燥成复合薄膜，获得对皮肤创伤修复起促进作用的多孔复合支架或复合薄膜，即琼脂/胶原皮肤创伤修复敷料，同时为其它软组织工程提供支架。本发明操作方便，成本低，同时提高琼脂及其衍生物的附加价值有助于大型海藻的种植，有利于近海海域富养的生态修复。该多孔复合支架或复合薄膜强度高，与皮肤抗张强度接近，柔韧性好，可进行缝合操作。本发明的多孔复合支架或复合薄膜用途广泛，可用作烧伤、溃疡大面积皮肤创伤修复，以及用于软骨、角膜、脂肪等软组织工程支架材料。

Description

琼脂/胶原皮肤创伤修复敷料及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医学材料技术，特别是指一种琼脂/胶原皮肤创伤修复敷料及其制备方法和应用。

背景技术

大面积烧伤以及溃疡等引起的皮肤病是临床上常见的病症，皮肤再造或移植是挽救病人生命的重要措施之一。由于自体皮可供移植量不足以解决大面积修复，异体或异种皮存在免疫反应等问题，因此各类组织工程化皮肤或生物材料类敷料成为解决问题的途径。

皮肤敷料的应用始于公元前，棉纤维等植物纤维植物作为皮肤创伤的敷料，对小面积的创伤起到很好的保护创面、促进愈合的作用。国内外真正研究始于上世纪初，主要途径是异种皮替代，后来发展了各种生物高分子或合成高分子为基础的各种皮肤敷料，如硫酸软骨素/胶原，胶原/尼龙，丝蛋白等。上世纪80年代，组织工程皮肤的发展速度迅速，以加快创面修复速度为目的的“活性”皮肤实现了有限规模的产业化。制约这一产业发展的主要问题是选材成本高，活性皮肤不仅成本高昂，而且修复机制不十分明确。本专利使用价廉天然高分子-琼脂及其衍生物，研制出大面积创伤修复用皮肤敷料。

利用组织工程的设计原理，可得到膜材具有三维多孔层间结构，保障细胞增殖、组织正常愈合所需要的营养供应，而该膜在组织愈合的同时降解消失，且降解的单糖对细胞的增殖与分化有促进作用，使其真正起到保证皮肤组织愈合的效果。同时由于显著提高海藻多糖-琼脂的附加价值，使大型海藻养殖的吸引力进一步提高(琼脂从大型海藻中提取)，可望在近海生态修复中发挥积极作用。因此由于使用的原材料价格低廉，可望使产品作为皮肤创伤修复手术的一个重要选择而得到广泛应用，其经济效益和社会效益将非常显著。

在国外文献中，除了普通生物材料或脱细胞真皮基质作为皮肤敷料外，也开展“活性”皮肤敷料的市场化。20多年前，MIT的Bell等人观察到形成真皮的细胞——成纤维细胞可渗入到胶原凝胶中，并能够将其转变为纤维状活基质。胶原是细胞外基质的主要组成物，该生物“胶”可使成纤维细胞定位。根据这一发现，1998年5月，由Organogenesis公司开发的具有表皮和真皮双层皮肤结构的Apligraf成为了第一个被美国FDA批准的含有人活细胞的植入装置，该技术也终于得以商品化。Apligraf主要用于烧伤、糖尿病溃疡和皮肤病的外科治疗。美国Advanced Tissue Sciences公司(La Jolla，加州)从新生儿包皮分离出成纤维细胞后，种植在聚合物支架上扩增两周。细胞在支架内分裂增殖的同时，还合成生长因子、胶原等蛋白质成分，形成功能性人工真皮TransCyte。该产品经FDA批准，用于治疗2～3度烧伤。Advanced TissueSciences公司随后又开发了单层真皮Dermagraf。Dermagraft是活组织，适用于需要诱导新皮肤生长的情况，如严重烧伤和糖尿病患者皮肤溃疡的治疗，对慢性皮肤溃疡也有很好的疗效。由于Dermagraft含有活细胞，需要在-70℃冻存后运输和贮存。使用前需解冻，并切成一定的形状。Dermagraft复苏后50％的细胞可以存活下来。对50人组的糖尿病患者进行临床试验，其中50％的溃疡病人恢复了健康，而对照组(一般疗法)治愈率只有8％。用Dermagraft治愈的病人经4个月到1年的跟踪未见复发。目前这些产品均是基于胶原/硫酸软骨素，胶原/尼龙，胶原/硅橡胶等支架，产品的市场在美国不足100万美元，病例每年100人左右，处于举步维坚的状态。

因此，现有的皮肤修复技术中所用到的材料均没有采用琼脂及其衍生物，鉴于琼脂的成凝胶性质，一些专利仅涉及琼脂作为降温、增粘敷料或作为细胞包囊等工作。

发明内容

针对现有技术存在的材料选择问题，本发明的首要目的在于提供一种琼脂/胶原皮肤创伤修复敷料(即多孔复合支架或复合薄膜)，该修复敷料具有三维多孔层间结构，保障皮肤组织正常愈合所需要的营养供应，同时降解产物具有促进细胞增殖和表达基质的作用，而该多孔复合支架(或复合薄膜)在组织愈合的同时降解消失，使其真正起到促进皮肤创伤修复的效果。

本发明的另一目的在于提供上述琼脂/胶原皮肤创伤修复敷料(多孔复合支架或复合薄膜)的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述琼脂/胶原皮肤创伤修复敷料(多孔复合支架或复合薄膜)的应用。

本发明是通过琼脂(包括琼胶糖及其衍生物)与胶原(包括I和II等类型的胶原或改性物)或明胶(可溶性)共混后冷冻干燥得到多孔复合支架或直接干燥成薄膜，以获得一种对皮肤创伤修复起促进作用的支架或薄膜，同时为其它软组织工程提供支架。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种琼脂/胶原皮肤创伤修复敷料(多孔复合支架或复合薄膜)的制备方法，包括如下步骤：

(1)将琼脂溶于85～95℃热水中，质量浓度为1％左右；将胶原或明胶溶胀于或溶于水或0.04～0.06M的醋酸溶液中，质量浓度为0.5～0.6％；

(2)将上述两种溶液按比例混合并水浴条件下搅拌3～20分钟后，所述水浴温度55～70℃，真空或离心脱气后倒入模具中，所述琼脂与胶原或明胶质量比为10∶1～1∶10之间变化；

(3)将模具置于50～55℃干燥48～72小时即得到复合薄膜；

或者将模具迅速置于-18℃冷冻2～4小时，然后冷冻干燥，冷冻温度-10～-70℃，冷冻1～3小时，真空下0℃抽气17～24小时，即得到多孔复合支架。

为了更好地实现本发明，根据使用要求可选择轻度交联，多孔复合支架或复合薄膜用质量浓度为0.5～2％的戊二醛交联0.5～6小时；蒸馏水水洗后50～55℃干燥48～72小时，即得到多孔复合支架或复合薄膜。

所述琼脂和胶原或明胶的混合比例和状态(多孔复合支架或复合薄膜)根据用途确定，优选的是：多孔复合支架用于皮肤创伤修复敷料时，可选用膜厚约3～4毫米，琼脂与胶原或明胶质量比为1∶1～1∶3，并辅以轻度交联，同时该类支架可用于软组织工程支架；复合薄膜用于皮肤创伤修复敷料时，膜厚约2～3毫米，琼脂与胶原或明胶质量比为1∶2～1∶5。

所述冷冻干燥条件优选为：-35～-45℃下冷冻1～3小时，真空下0℃抽气17～24小时。所述复合薄膜厚约2～3mm；所述多孔复合支架厚约3～4mm。

所得到的多孔复合支架或复合薄膜裁剪后用环氧乙烷消毒，得成品封袋保存；若需要多孔复合支架或复合薄膜面积大，可采用戊二醛半小时熏蒸处理消毒备用。

一种琼脂/胶原皮肤创伤修复敷料(多孔复合支架或复合薄膜)就是通过上述制备方法制备而成的。

上述琼脂/胶原皮肤创伤修复敷料(多孔复合支架或复合薄膜)在皮肤创伤修复敷料或软组织工程支架材料等中的应用。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

(1)本发明得到的多孔复合支架或复合薄膜，可使愈合区组织的营养供应不受影响，维持组织的正常愈合机制，而且降解产物对细胞的增殖和基质组装具有促进作用，加快组织的生成。

(2)本发明成本低，同时提高了琼脂及其衍生物的附加价值，有助于大型海藻的种植(琼脂从大型海藻中提取)，有利于近海海域富养的生态修复。

(3)本发明操作方便，该多孔复合支架或复合薄膜强度高，与皮肤抗张强度接近，柔韧性好，可进行缝合操作，可根据使用要求的不同，选择合适强度和降解时间的多孔复合支架或复合薄膜。

(4)本发明的琼脂/胶原多孔复合支架或复合薄膜用途广泛，可用作烧伤、溃疡大大面积皮肤创伤修复，以及用于软骨、角膜、脂肪等软组织工程支架材料。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1多孔复合支架制备及皮肤敷料

(1)琼脂溶于85～95℃热水中，质量浓度百分比为1％，胶原(或明胶)溶于0.04～0.06M的醋酸溶液(或溶胀于水)中，质量浓度百分比为0.5％～0.6％。

(2)将步骤(1)处理后的琼脂和胶原(或明胶)溶液按质量比1∶2混合，水浴条件下搅拌10分钟后(水浴温度70℃)，离心脱气(500～1000转/分，2～5分钟)，然后倒入模具中成型(使混合液在模具中高度为5～6mm)，将模具放入冰箱(-18℃)中冷冻2～4小时。

(3)将模具放入冷冻干燥机中，在-35～-45℃下冷冻1～3小时，然后在0℃抽气17～24小时，冻干成多孔复合支架，厚约3～4mm，戊二醛(质量浓度为0.5％)交联半小时，环氧乙烷消毒备用。

制备多孔复合支架直径1.5厘米圆片状，厚3～4毫米，戊二醛(质量浓度为0.5％)交联半小时，环氧乙烷消毒备用。以兔皮肤创面为模型，造1.5厘米直径缺损，缝合固定，植入2～3周后皮肤修复完成，支架降解。

实施例2复合膜制备与皮肤敷料

(1)琼脂溶于85～95℃热水中，质量浓度百分比为1％，明胶(或胶原)溶于0.04～0.06M的醋酸溶液(或溶胀于水)中，质量浓度百分比为0.5％～0.6％。

(2)将步骤(1)处理后的琼脂和明胶(或胶原)溶液按质量比1∶4混合，水浴条件下搅拌3分钟后(水浴温度70℃)，离心脱气(500～1000转/分，2～5分钟)，然后倒入模具中成型(使混合液在模具中高度为3～4mm)。

(3)放入鼓风干燥机中，在50～55℃下干燥48～72小时，得到复合膜，膜厚约2mm。环氧乙烷消毒备用。

制备复合膜材料直径1.5厘米圆片状，厚2～3毫米，戊二醛(质量浓度为0.5％)交联半小时，环氧乙烷消毒备用。以兔皮肤创面为模型，造1.5厘米直径缺损，缝合固定，植入3周后皮肤修复完成，支架降解。

实施例3皮下脂肪组织工程支架

(1)琼脂溶于85～95℃热水中，质量浓度百分比为1％，胶原(或明胶)溶胀于水(或溶于0.04～0.06M的醋酸溶液)中，质量浓度百分比为0.5％～0.6％。

(2)将步骤(1)处理后的琼脂和胶原(或明胶)溶液按质量比2∶1混合，水浴条件下搅拌20分钟后(水浴温度60℃)，离心脱气(500～1000转/分，2～5分钟)，然后倒入模具中成型(使混合液在模具中高度为5～6mm)，放入冰箱(-18℃)中冷冻2～4小时。

(3)放入冷冻干燥机中，在-40℃下冷冻2小时，然后在0℃抽气20小时，冻干成多孔复合支架，厚约3～4mm。

(4)将多孔复合支架在质量浓度为2％戊二醛水溶液上熏蒸半小时进行交联处理。

制备的多孔复合支架直径0.8厘米，厚3～4毫米，环氧乙烷消毒备用。扩增皮下成体脂肪干细胞800万，种于支架中、风干3小时细胞贴附后加常规培养液(DMEM+10％FBS+1％抗菌素)(补充10ng/ml bFGF)，3周后成皮下脂肪样软组织，支架降解。

实施例4皮肤组织工程支架

(1)琼脂溶于85～95℃热水中，质量浓度百分比为1％，胶原(或明胶)溶胀于水(或溶于0.04～0.06M的醋酸溶液)中，质量浓度百分比为0.5％～0.6％。

(2)将步骤(1)处理后的琼脂和胶原(或明胶)溶液按质量比1∶10混合，水浴条件下搅拌20分钟后(水浴温度60℃)，真空(真空度100Pa以下)或离心脱气(500～1000转/分，2～5分钟)，然后倒入模具中成型(使混合液在模具中高度为5～6mm)，放入冰箱(-18℃)中冷冻2～4小时。

(3)放入冷冻干燥机中，在-10℃下冷冻2小时，然后在0℃抽气17小时，冻干成多孔复合支架，厚约3～4mm。

(4)将多孔复合支架在质量浓度为2％戊二醛水溶液上熏蒸半小时进行交联处理。

制备的多孔复合支架直径0.8厘米，厚3～4毫米，环氧乙烷消毒备用。扩增表皮成纤维细胞800万，种于支架中、风干3小时细胞贴附后加常规培养液(DMEM+10％FBS+1％抗菌素)(补充10ng/ml bFGF)，2周后成表皮样软组织，支架降解。

实施例5防感染皮肤敷料

(1)琼脂溶于85～95℃热水中，质量浓度百分比为1％，胶原(或明胶)溶胀于水(或溶于0.04～0.06M的醋酸溶液)中，质量浓度百分比为0.5％～0.6％。

(2)将步骤(1)处理后的琼脂和胶原(或明胶)溶液按质量比10∶1混合，水浴条件下搅拌20分钟后(水浴温度55℃)，离心脱气(500～1000转/分，2～5分钟)，然后倒入模具中成型(使混合液在模具中高度为3～4mm)，放入冰箱(-18℃)中冷冻2～4小时。

(3)放入冷冻干燥机中，在-70℃下冷冻2小时，然后在0℃抽气24小时，冻干成多孔复合支架，厚约2～3mm。

(4)将多孔复合支架在质量浓度为1％戊二醛水溶液上熏蒸半小时进行交联处理。环氧乙烷消毒备用。

将上述制备的材料贴敷于已敷药皮肤灼伤处，一两周后揭掉材料皮肤恢复正常，该材料起隔菌效果。

Claims (8)

1.一种琼脂/胶原皮肤创伤修复敷料的制备方法，包括如下步骤：

(1)将琼脂溶于85～95℃热水中，质量浓度为1％；胶原或明胶溶胀于或溶于水或0.04～0.06M的醋酸溶液中，质量浓度为0.5～0.6％；

(2)将上述两种溶液按比例混合并水浴条件下搅拌3～20分钟后，所述水浴温度55～70℃，真空或离心脱气后倒入模具中，所述琼脂与胶原或明胶质量比为10∶1～1∶10；

(3)将模具置于50～55℃干燥48～72小时即得到复合薄膜；

或者将模具置于-18℃中冷冻2～4小时，然后冷冻干燥，冷冻温度-10～-70℃，真空下0℃抽气17～24小时，即得到多孔复合支架。

2.根据权利要求1所述的一种琼脂/胶原皮肤创伤修复敷料的制备方法，其特征在于，所述多孔复合支架或复合薄膜用质量浓度为0.5～2％的戊二醛交联0.5～6小时；蒸馏水水洗后50～55℃干燥48～72小时，得到多孔复合支架或复合薄膜。

3.根据权利要求1所述的一种琼脂/胶原皮肤创伤修复敷料的制备方法，其特征在于，制备多孔复合支架时，琼脂与胶原或明胶质量比为1∶1～1∶3；制备复合薄膜时，琼脂与胶原或明胶质量比为1∶2～1∶5。

4.根据权利要求1所述的一种琼脂/胶原皮肤创伤修复敷料的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥条件为：-35～-45℃下冷冻1～3小时，真空下0℃抽气17～24小时。

5.根据权利要求1所述的一种琼脂/胶原皮肤创伤修复敷料的制备方法，其特征在于，所述复合薄膜厚2～3mm；所述多孔复合支架厚3～4mm。

6.根据权利要求1所述的一种琼脂/胶原皮肤创伤修复敷料的制备方法，其特征在于，多孔复合支架或复合薄膜裁剪后用环氧乙烷消毒，或用戊二醛半小时熏蒸处理消毒备用。

7.一种琼脂/胶原皮肤创伤修复敷料，其特征在于，所述琼脂/胶原皮肤创伤修复敷料由下述制备方法制备而成的：(1)将琼脂溶于85～95℃热水中，质量浓度为1％；胶原或明胶溶胀于或溶于水或0.04～0.06M的醋酸溶液中，质量浓度为0.5～0.6％；(2)将上述两种溶液按比例混合并水浴条件下搅拌3～20分钟后，所述水浴温度55～70℃，真空或离心脱气后倒入模具中，所述琼脂与胶原或明胶质量比为10∶1～1∶10；(3)将模具置于50～55℃干燥48～72小时即得到复合薄膜；或者将模具置于-18℃中冷冻2～4小时，然后冷冻干燥，冷冻温度-10～-70℃，真空下0℃抽气17～24小时，即得到多孔复合支架。

8.权利要求7所述的琼脂/胶原皮肤创伤修复敷料在皮肤创伤修复敷料或软组织工程支架材料中的应用。