CN103386145B - 一种含有卡拉胶的创伤修复敷料及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含有卡拉胶的创伤修复敷料及其制备方法和应用。所述创伤修复敷料是由胶原或明胶与卡拉胶按（5:95）～（95:5）的质量比共混后冷冻干燥得到具有三维多孔层间结构的多孔复合支架，或是共混后直接干燥得到的复合薄膜。本发明创伤修复敷料能保证组织正常愈合所需的营养供应，并且在组织愈合的同时降解消失，同时降解产物具有促进细胞增殖和表达基质的作用，真正起到促进创伤修复的效果。并且所述多孔复合支架和复合薄膜均能在促进创伤修复的同时为其它软组织工程提供支架。本发明创伤修复敷料用途广泛，可用作烧伤、溃疡大面积皮肤创伤修复，以及用于软骨、角膜、脂肪等组织工程支架材料或临床医学其他领域。

Description

一种含有卡拉胶的创伤修复敷料及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医学材料领域，具体涉及一种含有卡拉胶的创伤修复敷料及其制备方法和应用。

背景技术

卡拉胶（Carrageenan），又称角叉菜胶、鹿角菜胶，是自红藻(Red aglae,Rhodophyta)中提取的一种水溶性胶体，是世界三大海藻胶工业产品（琼胶、卡拉胶、褐藻胶）之一。作为天然食品添加剂，卡拉胶在食品行业已应用了几十年。联合国粮农组织和世界卫生组织食品添加剂专家委员会(JECFA,Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives)在2001年取消了卡拉胶日允许摄取量(ADI,Acceptable Daily Intake)的限制，确认它是一种安全、无毒、无副作用的食品添加剂。据统计，全球卡拉胶产量以3%的速度递增，2000年全球销量达3.1亿美元。卡拉胶广泛应用于食品行业，如可可奶、冰激凌、速溶咖啡、果冻、果汁饮料、牛奶布丁、炼乳、奶酪制品、婴儿奶制品、酸奶、糖果、罐头、豆酱、面包等的制造中；也可用于啤酒澄清、制作人造蛋白质和人造肉、制作保健食品等。卡拉胶亦可用于日用化工行业，如牙膏、润肤制品、洗发香波、洗涤剂、空气清新剂、水彩颜料、陶瓷制品等的加工制作。卡拉胶还大量用于医药行业，如作为微生物培养基、缓释胶囊/片剂、药膏基、鱼肝油乳化剂等。近年来研究发现卡拉胶本身具有特殊的医药疗效，它对许多重要病毒病原（如疱疹病毒、HIV、粘液病毒、棒状病毒等）具有广谱抑制活性。卡拉胶还对免疫系统具有持续性作用，它是有效的抗胃蛋白酶活、抗溃疡、抗凝血、抗栓物质。

胶原是细胞外基质的一种结构蛋白质，分布于机体的各个器官，是生物体内含量最多、最丰富的蛋白质，约占体内蛋白质总量的25%～30%。胶原作为细胞外基质的纤维支架，存在于绝大多数薄壁器官间质组织中，起着支撑和保护器官、组织完整性的作用。同时，胶原与人体血管、皮肤、骨骼和软骨的形成关系密切，也是维持各器官、组织弹性和韧性的重要保障。结构决定性质、性质决定用途。胶原特殊的三螺旋结构赋予胶原良好的生物相容性、可降解性、抗低原性及止血性能等优良特性。已在多个医疗领域获得丰硕的研究和应用成果，如可吸收性手术缝合线、止血海绵、人造皮肤、人工角膜、骨科修复材料、代血浆、人工血管等。

明胶的主要组成为氨基酸组成相同而分子量分布很宽的多肽分子混合物，分子量一般在几万至十几万。明胶既具有酸性，又具有碱性，是一种两性物质，明胶的胶团是带电的，在电场作用下，它将向两极中的某一极移动。明胶分子结构上有大量的羟基，另外还有许多羧基和氨基，这使得明胶具有极强的亲水性。明胶不溶于有机溶剂，不溶于冷水，在冷水中吸水膨胀至自身的5-10倍，易溶于温水，冷却形成凝胶，其溶解度与凝固温度相差很小，易受水份、温度、湿度的影响而变质。明胶含有内氨酸、甘氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸等人体所需的18种氨基酸。

现有技术中敷料产品主要有：1）硫酸软骨素/胶原；2）胶原/尼龙；3）脱细胞真皮基质；4）丝蛋白；5）琼脂/胶原；6）其它天然或合成降解性高分子。

在国外文献中，除了普通生物材料或脱细胞真皮基质作为创伤修复敷料外，也开展“活性”皮肤敷料的市场化。20多年前，MIT的Bell等人观察到形成真皮的细胞——成纤维细胞可渗入到胶原凝胶中，并能够将其转变为纤维状活基质。胶原是细胞外基质的主要组成物，该生物“胶“可使成纤维细胞定位。根据这一发现，1985年5月，由Organogenesis公司开发的具有表皮和真皮双层皮肤结构的Apligraf成为了第一个被美国FDA批准的含有人活细胞的植入装置，该技术也终于得以商品化。Apligraf主要用于烧伤、糖尿病溃疡和皮肤病的外科治疗。美国Advanced Tissue Sciences公司（La Jolla，加州）从新生儿包皮分离出成纤维细胞后，种植在聚合物支架上扩增两周。细胞在支架内分裂增殖的同时，还合成生长因子、胶原等蛋白质成分，形成功能性人工真皮TransCyte。该产品经FDA批准，用于治疗2～3度烧伤。Advanced Tissue Sciences公司随后又开发了单层真皮Dermagraft。Dermagraft是活组织，适用于需要诱导新皮肤生长的情况，如严重烧伤和糖尿病患者皮肤溃疡的治疗，对慢性皮肤溃疡也有很好的疗效。由于Dermagraft含有活细胞，需要在-70℃冻存后运输和贮存。使用前需解冻，并切成一定的形状。Dermagraft复苏后50%的细胞可以存活下来。对50人组的糖尿病患者进行临床试验，其中50%的溃疡病人恢复了健康，而对照组（一般疗法）治愈率只有8%。用Dermagraft治愈的病人经4个月到1年的跟踪未见复发。目前这些产品均是基于胶原/硫酸软骨素，胶原/尼龙，胶原/硅橡胶等支架，产品的时常在美国不足100万美圆，病例每年100人左右，处于举步维艰的状态。

现有的创伤修复技术中所用到的材料均没有采用卡拉胶及其衍生物，鉴于卡拉胶的成凝胶性质，一些专利涉及卡拉胶作为胶囊、增粘敷料或作为细胞包囊等工作。如CN200910129074.4将卡拉胶于PVA复合制备成敷料；200610010173.7将卡拉胶于大豆蛋白复合形成胶囊，发明专利200610036652.6琼脂/胶原复合皮肤敷料。有研究将卡拉胶于羟基磷灰石和胶原复合形成可注射凝胶材料用于骨修复。

发明内容

为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种含有卡拉胶的创伤修复敷料，该创伤修复敷料能保证组织正常愈合所需的营养供应，并且在组织愈合的同时降解消失，同时降解产物具有促进细胞增殖和表达基质的作用，真正起到促进创伤修复的效果。

本发明的另一目的在于提供上述含有卡拉胶的创伤修复敷料的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述含有卡拉胶的创伤修复敷料的应用。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种含有卡拉胶的创伤修复敷料，所述创伤修复敷料是由胶原或明胶，与卡拉胶按（5:95）～（95:5）的质量比共混后冷冻干燥得到具有三维多孔层间结构的多孔复合支架，或是共混后直接干燥得到的复合薄膜。

本发明创伤修复敷料能保证组织正常愈合所需的营养供应，并且在组织愈合的同时降解消失，同时降解产物具有促进细胞增殖和表达基质的作用，真正起到促进创伤修复的效果。并且所述多孔复合支架和复合薄膜均能够在促进创伤修复的同时为其它软组织工程提供支架。

优选的，所述卡拉胶包括K型卡拉胶、I型卡拉胶、L型卡拉胶及其硫酸酯化衍生物中的一种，所述胶原包括I型胶原、II型胶原及其降解或水解改性物中的一种，所述明胶的分子量20000～150000。

优选的，所述多孔复合支架厚度为3～4毫米；所述胶原或明胶，与卡拉胶的质量比为（1:4）～（1:1）。

优选的，所述复合薄膜厚度为2～3毫米；所述胶原或明胶，与卡拉胶的质量比为（1:8）～（1:2）。

上述含有卡拉胶的创伤修复敷料的制备方法，包括以下步骤：

（1）用浓度为0.04～0.06M的醋酸溶液溶胀胶原，或直接用50-80℃蒸馏水溶解明胶，得到质量浓度为0.3～1%的胶原溶胀液或明胶溶液；再将胶原溶胀液或明胶溶液与质量浓度为1～10%的卡拉胶溶液混合、搅拌均匀，得到共混溶液；其中胶原或明胶与卡拉胶的质量比为（5:95）～（95:5）；

（2）将步骤（1）所得的共混溶液真空或离心脱气后倒入模具中，然后将模具直接干燥或是将模具于-20℃冷冻2～5h后冷冻干燥，得到所述含有卡拉胶的创伤修复敷料。

优选的，步骤（1）所述的搅拌为25～40℃下以4000r/min搅拌30min。

优选的，步骤（2）所述的直接干燥是将模具于50～60℃干燥48～72h，所得含有卡拉胶的创伤修复敷料为复合薄膜。

优选的，步骤（2）所述的冷冻干燥是在-10～-70℃冷冻1～5h，然后在真空、0℃下抽气17～24h，所得含有卡拉胶的创伤修复敷料为多孔复合支架。

更优选的，步骤（2）所述的冷冻干燥是在-30～-50℃冷冻1～4h，然后在真空、0℃下抽气17～24h。

上述含有卡拉胶的创伤修复敷料在皮肤创伤修复敷料或软组织工程支架材料中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

（1）本发明创伤修复敷料可使愈合区组织的营养供应不受影响，维持组织的正常愈合机制，而且降解产物对细胞的增殖和基质组装具有促进作用，能加快组织的生成。

（2）本发明创伤修复敷料的制备方法成本低，同时提高了卡拉胶及其衍生物的附加价值，有助于大型海藻的种植（卡拉胶从大型海藻中提取），有利于近海域富养的生态修复。

（3）本发明创伤修复敷料使用操作方便，膜强度高，与皮肤抗张强度接近；柔韧性好，可进行缝合操作。可根据使用要求的不同，选择合适强度和降解时间的复合支架或复合薄膜。

（4）本发明创伤修复敷料用途广泛，可用作烧伤、溃疡大面积皮肤创伤修复，以及用于软骨、角膜、脂肪等组织工程支架材料或临床医学其他领域。

（5）本发明原料中的卡拉胶比生物惰性的琼脂更有生物活性，同时由于胶原或明胶均能与卡拉胶形成离子复合物，在中性环境不易解离，因此胶原或明胶与卡拉胶复合物的稳定性和强度均比琼脂/胶原复合物高，本发明得到的创伤修复敷料在医学领域更有应用价值。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。如无特别说明，本发明中所有原料和试剂均为市购常规的原料、试剂。

实施例1

1、制备卡拉胶/胶原多孔复合支架：

（1）用浓度为0.05M的醋酸溶液溶胀I型胶原，得到质量浓度为0.4%的I型胶原溶胀液，再将其与质量浓度为2%的K型卡拉胶溶液混合，并在40℃、4000转/分搅拌半小时，得到共混溶液；其中胶原与卡拉胶的质量比为1:4；

（2）将步骤（1）所得的共混溶液离心脱气（1500转∕分，5分钟）后倒入模具中成型（使混合液在模具中高度为7毫米），然后将模具于-20℃冰箱冷冻2～5h后，将模具置于冷冻干燥机中，冷冻温度为-50℃，冷冻2小时，然后在真空下0℃抽气24小时，即得到卡拉胶/胶原多孔复合支架。

所制备的卡拉胶/胶原多孔复合支架厚度约为3～4毫米，环氧乙烷消毒后备用。

2、卡拉胶/胶原多孔复合支架作为创伤修复敷料的效果实验：同时用琼脂/胶原复合多孔支架（3-4毫米厚，胶原与琼脂糖质量比为1：4）进行动物试验对照。以小鼠皮肤创面为模型，造直径为1厘米的缺口，缝合固定，植入卡拉胶/胶原多孔复合支架2～3周后皮肤修复完成，支架降解；而琼脂/胶原支架在四周后仍然有琼脂碎片残留。经组织学分析卡拉胶/胶原支架修复皮肤组织III型胶原含量超过15%，表面被表皮细胞层覆盖，并有毛囊和新生血管的生成；而琼脂/胶原支架修复的皮肤组织III型胶原含量小于5%，没有明显的毛囊结构，但有少量新生血管生成。

实施例2

1、制备卡拉胶/胶原复合薄膜：

（1）用浓度为0.04M的醋酸溶液溶胀I型胶原，得到质量浓度为0.35%的I型胶原溶胀液，再将其与质量浓度为4%的I型卡拉胶溶液混合，并在30℃、4000转/分搅拌半小时，得到共混溶液；其中胶原与卡拉胶的质量比为1:1；

（2）将步骤（1）所得的共混溶液离心脱气（1000转∕分，4分钟）后倒入模具中成型（使混合液在模具中高度为4毫米），然后将模具置于鼓风干燥机中，在温度为60℃下干燥72小时后，即可得到卡拉胶/胶原复合薄膜。

所制备的卡拉胶/胶原复合薄膜厚度约为2～3毫米，环氧乙烷消毒后备用。

2、卡拉胶/胶原复合薄膜在创伤修复实验中的效果实验：制备直径为1厘米、厚2～3毫米的圆片状复合薄膜材料。以小鼠皮肤创面为模型，造直径为1厘米的缺口，缝合固定，植入复合薄膜材料2～3周后皮肤修复完成，支架降解。经组织学分析修复皮肤组织III型胶原含量超过10%，表面被表皮细胞层覆盖，并有类真皮结构的生成。

实施例3

1、制备卡拉胶/胶原多孔复合支架：

（1）用浓度为0.05M的醋酸溶液溶胀I型胶原，得到质量浓度为0.45%的胶原溶胀液，再将其与质量浓度为2%的L型卡拉胶溶液混合，并在30℃、4000转/分搅拌半小时，得到共混溶液；其中胶原与卡拉胶的质量比为2:1；

（2）将步骤（1）所得的共混溶液离心脱气（1500转∕分，5分钟）后倒入模具中成型（使混合液在模具中高度为6毫米），将模具放入冰箱（-20℃）下冷冻3小时；然后将模具置于冷冻干燥机中，在温度为-30℃冷冻2小时，然后在真空下0℃抽气24小时，即得到卡拉胶/胶原多孔复合支架。

制备的多孔复合支架直径为0.6厘米，厚3～4毫米，环氧乙烷消毒后备用。

2、多孔复合支架作为皮肤组织工程支架的效果实验：扩增表皮成纤维细胞600万，种于支架中，风干3～4小时细胞贴附后加常规培养液（DEME+10％FBS+1％双抗），2周后成表皮样软组织，支架降解。组织学部检测表明支架完全被细胞外基质取代，细胞分布与真皮组织相当。

实施例4

1、制备卡拉胶/明胶多孔复合支架：

（1）用60℃蒸馏水溶胀明胶，得到质量浓度为0.5%的明胶溶液，再将其与质量浓度为2%的L型卡拉胶溶液混合，并在30℃、4000转/分搅拌半小时，得到共混溶液；其中明胶与卡拉胶的质量比为2:1；

（2）将步骤（1）所得的共混溶液离心脱气（1500转∕分，5分钟）后倒入模具中成型（使混合液在模具中高度为6毫米），将模具放入冰箱（-20℃）下冷冻3小时；然后将模具置于冷冻干燥机中，在温度为-30℃冷冻2小时，然后在真空下0℃抽气24小时，即得到卡拉胶/明胶多孔复合支架。

制备的多孔复合支架直径为0.6厘米，厚3～4毫米，环氧乙烷消毒后备用。

2、多孔复合支架作为皮肤组织工程支架的效果实验：扩增表皮成纤维细胞600万，种于支架中，风干3～4小时细胞贴附后加常规培养液（DEME+10％FBS+1％双抗），2周后成表皮样软组织，支架降解。组织学部检测表明支架完全被细胞外基质取代，细胞分布与真皮组织相当。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种含有卡拉胶的创伤修复敷料，其特征在于，所述创伤修复敷料是由胶原或明胶，与卡拉胶按(5:95)～(95:5)的质量比共混后冷冻干燥得到具有三维多孔层间结构的多孔复合支架；所述创伤修复敷料通过以下步骤制备所得：

(1)用浓度为0.04～0.06M的醋酸溶液溶胀胶原，或直接用50-80℃蒸馏水溶解明胶，得到质量浓度为0.3～1％的胶原溶胀液或明胶溶液，再将胶原溶胀液或明胶溶液与质量浓度为1～10％的卡拉胶溶液混合、搅拌均匀，得到共混溶液；其中胶原或明胶，与卡拉胶的质量比为(5:95)～(95:5)；

(2)将步骤(1)所得的共混溶液真空或离心脱气后倒入模具中，然后将模具于-20℃冷冻2～5h后冷冻干燥，得到所述含有卡拉胶的创伤修复敷料。

2.根据权利要求1所述的创伤修复敷料，其特征在于，所述卡拉胶包括K型卡拉胶、I型卡拉胶、L型卡拉胶及其硫酸酯化衍生物中的一种，所述胶原包括I型胶原、II型胶原及其降解或水解改性物中的一种，所述明胶的分子量20000～150000。

3.根据权利要求1所述的创伤修复敷料，其特征在于，所述多孔复合支架厚度为3～4毫米；所述胶原或明胶，与卡拉胶的质量比为(1:4)～(1:1)。

4.根据权利要求1所述的创伤修复敷料，其特征在于，步骤(1)所述的搅拌为25～40℃下以4000r/min搅拌30min。

5.根据权利要求1所述的创伤修复敷料，其特征在于，步骤(2)所述的冷冻干燥是在-10～-70℃冷冻1～5h，然后在真空、0℃下抽气17～24h，所得含有卡拉胶的创伤修复敷料为多孔复合支架。

6.根据权利要求5所述的创伤修复敷料，其特征在于，步骤(2)所述的冷冻干燥是在-30～-50℃冷冻1～4h，然后在真空、0℃下抽气17～24h。

7.权利要求1～6任一项所述含有卡拉胶的创伤修复敷料在皮肤创伤修复敷料或软组织工程支架材料中的应用。