CN109481339B - 一种胶原基复合水凝胶面膜材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种胶原基复合水凝胶面膜材料及其制备方法，所述面膜材料其原料总物质浓度为1‑2mg/ml，各物质按质量比计由以下组成：胶原蛋白：琥珀酰化胶原蛋白：醛基化硫酸软骨素:醛基化透明质酸为50～70：20～30:5～10:1～5。按本发明制备的胶原基复合水凝胶面膜材料安全无毒，简单方便，不仅可以将各原料的水溶液直接制备成水凝胶，也可以分别将各原料冷冻干燥制备成冻干状态，再在使用前分别加水后溶解后混合制备成水凝胶，还可以直接在胶原蛋白的水溶液或冻干品中加入有利于美白，抗衰老等物质进一步制备成其他功能性的化妆品。

Description

一种胶原基复合水凝胶面膜材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种胶原基复合水凝胶面膜材料及其制备方法和应用。
背景技术
胶原蛋白是生物高分子，动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的25％～30％，某些生物体甚至高达80％以上。因此胶原蛋白具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，在食品、医药、组织工程、化妆品等领域获得广泛的应用。透明质酸具有500倍以上的携水能力，2％的纯透明质酸水溶液能牢固地保持98％水分，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子，透明质酸对皮肤具有特殊的保水作用。随着皮肤内透明质酸含量的减少，皮肤的保水功能便开始减弱，角质层老化，皮肤变得粗糙，继而出现皱纹，失去弹性，呈现出衰老的表象。硫酸软骨素是共价连接在蛋白质上形成蛋白聚糖的一类糖胺聚糖，对慢性炎症性皮肤病具有显著治疗效果，可以减少皮肤红肿，减轻皮肤剥脱和瘙痒，并对硬化皮肤组织起到软化效果。
目前研发胶原蛋白水凝胶作为美容产品有很多报道，但是在凝胶制备过程中，还是会使用不同的交联剂如EDAC(碳二亚胺)作为交联剂形成凝胶，尽管文献报道EDAC无毒性或毒性较小，但动物实验证实采用此交联方式其毒性较强，原因是无法取出交联过程中的副产物及其残余的EDAC。在申请号为201310520057.X的“一种可水解逆转胶原蛋白的水凝胶及其制备方法”的专利中提到将醛基化和酰肼化衍生的糖胺聚糖和胶原蛋白反应，通过醛基衍生化产物和胶原蛋白肽链上的氨基NH2进行共价键合形成亚胺，进而通过加入糖胺聚糖酰肼化产物实现原位聚合包埋胶原蛋白分子；但最后要形成真正意义上的胶原蛋白水凝胶，还需要加入二乙烯基砜、酰肼类化合物或碳化二亚胺中的一种或多种交联剂，而且这种反应时间较长。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种无细胞毒性，且凝固时间较快的胶原基复合水凝胶面膜材料及其制备方法和应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1.一种胶原基复合水凝胶面膜材料，其原料总物质浓度为1-2mg/ml，各物质按质量比计由以下组成：胶原蛋白：琥珀酰化胶原蛋白：醛基化硫酸软骨素:醛基化透明质酸为50～70:20～40:5～10:1～5。
进一步，其原料按质量比计由以下物质组成：胶原蛋白：琥珀酰化胶原蛋白：醛基化硫酸软骨素:醛基化透明质酸为60:25:10:5。
2.一种胶原基复合水凝胶面膜材料的制备方法，包括如下步骤：
a.将胶原蛋白琥珀酰化至酰化程度20～40％；
b.再分别将硫酸软骨素和透明质酸醛基化，醛基化程度40～80％；
c.按照质量比将胶原蛋白、琥珀酰化胶原蛋白、醛基化硫酸软骨素和醛基化透明质酸的水溶液混合即可。
进一步，步骤a用琥珀酸酐进行酰化反应。
进一步，胶原蛋白琥珀酰化方法为：室温下，pH6.5-7质量分数为1-5％的胶原蛋白水溶液中，分次加入按胶原蛋白：琥珀酰酐质量比为100:5～10计的琥珀酰酐，并调节稳定pH值在6.5-7；加完后继续反应1-3h终止，再次调节pH值至6.5-7；反应产物透析24～48小时即可。
进一步，所述透明质酸醛基化的方法为：将高碘酸钠水溶液缓慢的加入到透明质酸溶液中，所述透明质酸：高碘酸钠质量比为1～3：1，室温条件下反应2-5h，再加入乙二醇使未反应的高碘酸钠失活；反应产物透析24～48小时即可。
进一步，所述透明质酸：高碘酸钠质量比为2：1。
进一步，所述高碘酸钠水溶液摩尔浓度为0.25mol/L；所述透明质酸水溶液的浓度为10mg/ml，高碘酸钠与乙二醇体积比为3～5:1。
进一步，所述硫酸软骨素醛基化的方法为：按照高碘酸钠与硫酸软骨素反应的物质的量比为1：2在硫酸软骨素水溶液中加入高碘酸钠，避光反应2～6h后，加入乙二醇终止反应，高碘酸钠与乙二醇体积比为3～5:1，30～60min之后，再加入化钠，充分溶解后以体积比1:2～4加入无水乙醇，搅拌数分钟后得到絮状沉淀，将反应产物透析48～72小时即可。
3.一种胶原基复合水凝胶面膜材料在制备化妆品产品中的应用。
进一步，所述化妆品产品为面膜。
本发明的有益效果在于：通过对胶原蛋白自身的琥珀酰化半改性，合理的配比胶原蛋白，进一步少量结合醛基化的硫酸软骨素和透明质酸，可以简单快速的得到无细胞毒性，含水量高的胶原蛋白水凝胶，不需要任何额外的交联剂，可以安全的作为制备面膜等化妆品的原材料。本发明安全无毒，可以将各原料的水溶液直接制备成水凝胶，也可以分别将各原料冷冻干燥制备成冻干状态，再在使用前分别加水后溶解后混合制备成水凝胶，可以直接在胶原蛋白的水溶液或冻干品中加入有利于美白，抗衰老等物质进一步制备成其他功能性的化妆品，如面膜。本发明更优选的是，先制备成面膜形式的水凝胶，再冷冻干燥成成品，使用时直接加水溶胀即可，不仅使用方便，还可在不添加防腐剂的状态下方便保存。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为本发明的水凝胶凝固后形貌；
图2为本发明的水凝胶与细胞共培养细胞活性检测；
图3为本发明的水凝胶与细胞共培养细胞3天后生长状态图。
具体实施方式
下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
(1)胶原蛋白琥珀酰化：配置质量分数为5％的I型胶原蛋白水溶液，pH＝7，配置方法：称取计算所配置量的胶原盐酸溶液用蒸馏水进行稀释，调pH值至pH＝7，然后定容至5％。取一定量中性的5％I型胶原蛋白水溶液置于200ml烧杯，放置在恒温磁力搅拌器上，按胶原蛋白：琥珀酰酐质量比为100:10计算，称取琥珀酰酐，分次加入胶原蛋白水溶液，边搅拌边加入，反应过程中用2moL/L NaOH溶液调节pH值使其稳定在pH＝7；加完后继续反应3h终止，再次调节pH值至pH＝7。将琥珀酰化的胶原蛋白置于透析袋中4℃冰箱内进行透析，去除小分子其他杂质；边透析边搅拌，透析过程中每4-8小时换一次水。透析完成后离心收集样品，可以直接使用，也可以进行冷冻干燥保存备用。
(2)透明质酸醛基化：将1g的透明质酸溶解在100mL水溶液中，室温条件下搅拌1～3h，随后将10mL的浓度为0.25mol/L高碘酸钠水溶液缓慢的加入到透明质酸溶液中，室温条件下反应2-5h，再加入与高碘酸钠体积比为3～5:1的乙二醇使未反应的高碘酸钠失活。反应产物在截留分子量为8000～14000的透析袋用水或者PBS缓冲液体系中进行透析24～48小时，每4-8小时换一次液，获得醛基化透明质酸，可以直接使用，也可以进行冷冻干燥保存备用。
(3)硫酸软骨素醛基化：将5g的硫酸软骨素溶解在100ml水中，按照高碘酸钠与硫酸软骨素反应的物质的量比为1：2加入高碘酸钠，避光反应4h后，加入乙二醇终止反应，30min之后，加入100mg的氯化钠，充分溶解后以体积比1：2～4加入无水乙醇，搅拌数分钟后得到絮状沉淀，将反应产物在截留分子量为8000～14000的透析袋用水或者PBS缓冲液体系中进行透析48～72小时，每4-8小时换一次液，透析完成后得醛基化硫酸软骨素白色产物，可以直接使用，也可以进行冷冻干燥保存备用。
实施例2
对实施例1步骤(1)胶原蛋白琥珀酰化中进行试验，考虑反应条件尽量简单条件下，反应温度固定在室温20-25℃，配制质量分数5％的I型胶原蛋白水溶液，分别研究pH值(5、7、9)、琥珀酸酐用量(按胶原蛋白质量百分比计算1％，5％，10％)、反应时间(1h、2h、3h)分别对胶原蛋白琥珀酰化改性胶原蛋白酰化程度的影响。酰化程度按照茚三酮法测试：配制质量分数1％胶原蛋白溶液,取lml放入试管中，然后向试管中加入lml的茚三酮显色剂。摇匀，盖塞，在沸水浴中加热16min，取出，在20℃的水浴中冷却，再向试管中加入5ml的KIO3稀释液，摇匀，在30min内用10mm的比色皿在570nm波长处测其吸光度，其中以蒸馏水/茚三酮溶液作空白，吸光度表示游离氨基与茚三酮溶液的反应程度，吸光度越大表示改性蛋白的酰化程度越低，也可以根据公式计算：
酰化反应程度＝(未改性胶原蛋白的OD值-改性胶原蛋白的OD值)/未改性胶原蛋白的OD值×100％。
并加入胶原蛋白、醛基化透明质酸和醛基化硫酸软骨素同时检测其成凝胶时间，分别配置成质量浓度为2mg/ml的水溶液，按胶原蛋白：琥珀酰化胶原蛋白：醛基化硫酸软骨素：醛基化透明质酸体积比为6:2:1:0.5混合，于室温下观察其成凝胶时间，前10min每隔5分钟观察一次，后10min每隔1分钟观察一次，成胶之前，溶胶粘稠、可以流动；成凝胶后，明显水凝胶状态，将凝胶倒置2min，不会发生流动，其结果如表1所示。
表1不同条件胶原蛋白琥珀酰化程度及对成胶影响
Figure BDA0001870636340000051
Figure BDA0001870636340000061
实施例3
(1)胶原蛋白琥珀酰化：配置质量分数为5％的I型胶原蛋白水溶液，pH＝6.5，配置方法：称取计算所配置量的胶原盐酸溶液用蒸馏水进行稀释，调pH值至6.5，然后定容至5％。取一定量中性的5％I型胶原蛋白水溶液置于200ml烧杯，放置在恒温磁力搅拌器上，按胶原蛋白：琥珀酰酐质量比为100:5计算，称取琥珀酰酐，分次加入胶原蛋白水溶液，边搅拌边加入，反应过程中用2moL/L NaOH溶液调节pH值使其稳定在6.5；加完后继续反应3h终止，再次调节pH值至6.5。将琥珀酰化的胶原蛋白置于透析袋中4℃冰箱内进行透析，去除小分子其他杂质；边透析边搅拌，透析过程中每4-8小时换一次水。透析完成后离心收集样品进行低温冻干保存备用。
(2)透明质酸醛基化：将1g的透明质酸溶解在100mL水溶液中，室温条件下搅拌1～3h，随后将10mL的浓度为0.25mol/L高碘酸钠水溶液缓慢的加入到透明质酸溶液中，室温条件下反应2-5h，再加入与高碘酸钠体积比为3～5:1的乙二醇使未反应的高碘酸钠失活。反应产物在截留分子量为8000～14000的透析袋用水或者PBS缓冲液体系中进行透析24～48小时，每4-8小时换一次液，获得醛基化透明质酸，可以直接使用，也可以进行冷冻干燥保存备用。
(3)硫酸软骨素醛基化：将5g的硫酸软骨素溶解在100ml水中，按照高碘酸钠与硫酸软骨素反应的物质的量比为1：2加入高碘酸钠，避光反应4h后，加入乙二醇终止反应，30min之后，加入100mg的氯化钠，充分溶解后以体积比1：2～4加入无水乙醇，搅拌数分钟后得到絮状沉淀，将反应产物在截留分子量为8000～14000的透析袋用水或者PBS缓冲液体系中进行透析48～72小时，每4-8小时换一次液，透析完成后得醛基化硫酸软骨素白色产物，可以直接使用，也可以进行冷冻干燥保存备用。
分别取胶原蛋白及以上的胶原蛋白酰化产物，透明质酸醛基化产物和硫酸软骨素醛基化产物配置成质量分数为2mg/ml的溶液，按照表2的体积配比加入各物质于15ml透明离心管中，考察不同配比下凝胶形成的时间。
表2各产物原料体积配比
Figure BDA0001870636340000071
实施例4体外细胞毒性实验
我国医用高分子材料的研究起步比较早发展较快，从上世纪五十年代中期就开展了人工血管的研制，各种生物医学材料的应用为医学、药学、生物学等学科的发展提供了丰富的物质基础。生物医学材料是一种具有特殊性能、特种功能，用于人工器官、外科修复、理疗康复、诊断、检查治疗疾患等医疗、保健领域，而对人体组织、血液不产生任何不良影响的材料。生物材料的生物相容性研究一直是生物医学材料研究中的一个重要内容，而体外细胞毒性实验是一种快速、简便、安全、重复性好又廉价的检测材料生物相容性方法。
取实施例3各组合的产物灭菌后按照0.1g/mL的浓度加入细胞培养液中，37℃下浸提24h。取对数生长期的L929成纤维细胞，调节细胞浓度为5.0×104个/mL，接种于96孔细胞培养板(每孔100ul，每个样品一板设置12个平行孔，分别设置3板，在不同时间段观察统计)。细胞培养24h(RPMI1640培养液+10％胎牛血清，37℃，5％CO2)后，将培养液换成水凝胶浸提液。设立正常对照组，空白对照组，每组12个平行孔。培养24、48、72小时时倒置显微镜下观察细胞生长情况，并用MTT法测定492nm处光吸收值(OD值)计算细胞相对增殖率(RGR)。计算公式为：
细胞增殖率(RGR)％＝(实验组OD平均值－空白对照组OD平均值)/(正常对照OD平均值－空白对照组OD平均值)×100％
细胞毒性分级：0级，RGR≥100％；1级，99％＞RGR≥75％；2级，74％＞RGR≥50％；3级，49％＞RGR≥25％；4级，24％＞RGR≥1％；5级，RGR等于0％。
结果发现在24小时和48小时时倒置显微镜下观察的L929细胞生长状态良好，72小时时各组细胞有收缩，但和正常对照一致。MTT法测定各水凝胶浸提液的细胞毒性结果见表3，结果显示实验组的吸光值和细胞增殖率比对照组略高，但无显著差异，说明水凝胶对细胞生长无明显抑制作用，细胞毒性为0级。
表3实施例3各组凝胶细胞毒性实验结果
Figure BDA0001870636340000081
Figure BDA0001870636340000091
实施例5
分别取胶原蛋白及实施例1的酰化胶原蛋白产物，醛基化透明质酸产物和醛基化硫酸软骨素产物配置成质量浓度为2mg/ml的溶液，按表2的配比组合4中的比例加入胶原蛋白6ml、酰化胶原蛋白产物2.5ml、醛基化硫酸软骨素产物1ml和醛基化透明质酸产物0.5ml于10cm的培养皿中，待凝固后，冷冻干燥；放置一个月后，再加水溶胀。测水凝胶重量w1；冻干后，再测其干重为w2，加水溶胀后，测其重量为W3；则溶胀率S＝(W3-W2)/W2*100％，含水量为(W1-W2)/w1×100％。该实验平行测试5次。
冻干前平均质量10.578g，冻干后平均质量为0.674g，溶胀后平均质量为9.854g；则水凝胶溶胀率为(9.854-0.674)/0.674×100％＝1273％,含水量为(9.578-0.674)/9.578×100％＝93.63％。
本发明安全无毒，可以将各原料的水溶液直接制备成水凝胶，也可以分别将各原料冷冻干燥制备成冻干状态，再在使用前分别加水后溶解后混合制备成水凝胶，可以直接在胶原蛋白的水溶液或冻干品中加入有利于美白，抗衰老等物质进一步制备成其他功能性的化妆品，如面膜。本发明更优选的是，先制备成面膜形式的水凝胶，再冷冻干燥成成品，使用时直接加水溶胀即可，不仅使用方便，还在不添加防腐剂的状态下方便保存。
实施例6
取实施例1中胶原蛋白0.1g，琥珀酰化胶原蛋白冻干粉0.07g、醛基化硫酸软骨素冻干粉0.02g、醛基化透明质酸冻干粉0.01g，分别用适量去离子水溶解后再定容至100ml，然后在25℃下将水溶液滴入6孔板内凝固成型，凝胶形貌如图1所示。用数字式粘度计测量水凝胶粘度随时间的变化规律见表4，充分说明本发明的水凝胶成胶性能好。
表4胶原蛋白水凝胶粘度随时间的变化
Figure BDA0001870636340000101
实施例7
取胶原蛋白0.12g，琥珀酰化胶原蛋白冻干粉0.05g、醛基化硫酸软骨素冻干粉0.02g、醛基化透明质酸冻干粉0.01g，分别用25ml无菌去离子水溶解，先将醛基化透明质酸溶液和醛基化硫酸软骨素溶液混合为醛基化粘多糖溶液，然后在25℃下将醛基化粘多糖溶液与琥珀酰化胶原蛋白溶液、胶原蛋白溶液快速混匀并滴入6孔板内凝固成型，水凝胶用去离子水浸泡24小时后吸去多余水分，将复合凝胶一份为二分别用BCA法测定复合凝胶中的胶原含量和咔唑法测定粘多糖含量。具体方法如下：取一半复合凝胶放入PE试管中，加入5ml胶原酶缓冲溶液将其浸没，放入37℃恒温电热培养箱中，12小时后取出降解液，加入工作液(比例A:B＝50:1),37℃水浴30min。在570nm波长处测定吸光度。另取一半复合凝胶分装于15ml具塞试管，加入10ml含溶菌酶的PBS缓冲溶液，试管置于37℃恒温振荡。12小时后取出1ml降解液，置于冰水浴中冷却5min，加入硫酸溶液5ml，振荡混匀。然后置于沸水浴中加热10min，冷却至37℃，加入咔唑试液0.2ml摇匀，置于沸水浴中加热15min,冷却至37℃，在540nm波长处测定吸光度，得到复合水凝胶经浸泡后的胶原和粘多糖成分的结合百分含量分别为97.30±2.87％，95.01±1.27％。
实施例8
无菌条件下，取胶原蛋白0.12g，琥珀酰化胶原蛋白冻干粉0.05g、醛基化硫酸软骨素冻干粉0.02g、醛基化透明质酸冻干粉0.01g，分别用25ml无菌去离子水溶解后混合，取1ml混合液于6孔板内凝固成型，将凝固后的水凝胶风干成膜，加入人成纤维细胞HFF-1进行共培养，培养适当时间用CCK-8法检测细胞活力，结果参照图2，复合水凝胶无细胞毒性，还能促进人成纤维细胞HFF-1增殖。其中，第三天人成纤维细胞HFF-1在复合水凝胶薄膜表面的生长状态如图3所示，充分说明本发明的水凝胶生物相容性好，作为面膜基础材料，对人体无伤害。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种胶原基复合水凝胶面膜材料，其特征在于，其原料总物质浓度为1-2mg/ml，各物质按质量比计由以下组成：胶原蛋白：琥珀酰化胶原蛋白：醛基化硫酸软骨素:醛基化透明质酸为50～70:20～40:5～10:1～5；
所述胶原基复合水凝胶面膜材料的制备方法包括如下步骤：
a.将胶原蛋白琥珀酰化至酰化程度20～40％；
b.再分别将硫酸软骨素和透明质酸醛基化，醛基化程度40～80％；
c.按照质量比将胶原蛋白、琥珀酰化胶原蛋白、醛基化硫酸软骨素和醛基化透明质酸的水溶液混合即可。
2.根据权利要求1所述的胶原基复合水凝胶面膜材料，其特征在于，其原料按质量比计由以下物质组成：胶原蛋白：琥珀酰化胶原蛋白：醛基化硫酸软骨素:醛基化透明质酸为60:25:10:5。
3.权利要求1或2所述的胶原基复合水凝胶面膜材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
a.将胶原蛋白琥珀酰化至酰化程度20～40％；
b.再分别将硫酸软骨素和透明质酸醛基化，醛基化程度40～80％；
c.按照质量比将胶原蛋白、琥珀酰化胶原蛋白、醛基化硫酸软骨素和醛基化透明质酸的水溶液混合即可。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤a用琥珀酸酐进行酰化反应。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，胶原蛋白琥珀酰化方法为：室温下，pH6.5-7质量分数为1-5％的胶原蛋白水溶液中，分次加入按胶原蛋白：琥珀酰酐质量比为100:5～10计的琥珀酰酐，并调节稳定pH值在6.5-7；加完后继续反应1-3h终止，再次调节pH值至6.5-7；反应产物透析24～48小时即可。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述透明质酸醛基化的方法为：将高碘酸钠水溶液缓慢的加入到透明质酸溶液中，所述透明质酸：高碘酸钠质量比为1～3：1，室温条件下反应2-5h，再加入乙二醇使未反应的高碘酸钠失活；反应产物透析24～48小时即可。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述高碘酸钠水溶液摩尔浓度为0.25mol/L；所述透明质酸水溶液的浓度为10mg/ml，高碘酸钠与乙二醇体积比为3～5:1。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述硫酸软骨素醛基化的方法为：按照高碘酸钠与硫酸软骨素反应的物质的量比为1：2在硫酸软骨素水溶液中加入高碘酸钠，避光反应2～6h后，加入乙二醇终止反应，高碘酸钠与乙二醇体积比为3～5:1，30～60min之后，再加入氯化钠，充分溶解后以体积比1：2～4加入无水乙醇，搅拌数分钟后得到絮状沉淀，将反应产物透析48～72小时即可。
9.根据权利要求1或2所述胶原基复合水凝胶面膜材料在制备化妆品产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述化妆品产品为面膜。
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