CN114456406B - 一种多功能可降解水凝胶、角膜接触镜及它们的制备方法 - Google Patents

一种多功能可降解水凝胶、角膜接触镜及它们的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多功能可降解水凝胶、角膜接触镜及它们的制备方法，包括以下内容：先通过丙烯酰化法、EDC/NHS活化羧基法和高碘酸钠氧化法以明胶、左氧氟沙星、透明质酸和硫酸软骨素作为原料合成GelMA聚合物、GelMA‑LVX(GL)聚合物、OHA聚合物和OCS聚合物；随后通过席夫碱反应、紫外光交联反应和生长因子负载法合成OHA‑GL‑OCS/R水凝胶，将制得的水凝胶通过模压工具即可制备成治疗性角膜接触镜。本发明使用的制备的方法成熟简易，使用的原料绿色廉价；制备的水凝胶具有优异的透光性、可降解性和生物相容性，在体外表现出促进上皮细胞增殖与迁移的性质，因此制得的角膜接触镜在角膜爆炸灼烧及化学烧伤后的防护领域有着很好的应用前景。

Description

一种多功能可降解水凝胶、角膜接触镜及它们的制备方法
技术领域
本发明属于可降解生物医用材料技术领域，具体涉及到一种多功能可降解水凝胶、角膜接触镜及它们的制备方法。
背景技术
眼睛是人体重要的感觉器官之一，人类通过眼睛获得的信息占据所有感知方式获得的信息的80％以上。由于眼部比较脆弱，容易受到外部损伤。一般的眼外伤包括机械性眼外伤和非机械性眼外伤。其中，机械性眼外伤以异物刺破眼球导致球内异物为主，需要及时送医处理；非机械性眼外伤主要包括角膜化学烧伤和爆炸烟尘灼烧伤等，这类眼部非机械性眼外伤常常因为得不到合理的预处理，送医后感染严重，导致患者恢复后的视力不佳，严重的会导致眼球不保或永久的失明。总而言之，在眼部受到非机械性眼外伤后及时合理的处置至关重要。
目前眼部眼外伤防治手段主要为包扎、敷药和全身使用抗生素治疗。而爆炸和接触化学试剂引起的角膜灼烧在送医前只能通过使用抗菌、消炎药物的方式暂时处理，待送至医院后进行手术治疗。过程中受条件所限，可能发生不能维持药物持续供应等问题，最终造成患者愈后视力差，甚至面临眼球摘除风险。所以，迫切的需要研制一款既能防护眼睛损害，又能较长时间保护缓解眼部创伤，为送至医院争取时间的，同时便于携带和使用的设备。角膜接触镜(contact lens，CL)是一种直接贴附在角膜的泪液层上起到视力矫正作用的人工合成产品。此外，角膜接触镜作为一种有效的眼科药物仓库，用以延长药物的释放，同时起到角膜/巩膜绷带的作用。角膜接触镜可以负载多种药物，但是本身的成分决定了角膜接触镜不可降解。如何实现角膜接触镜在最大发挥治疗性功效后的可控降解，是目前亟需解决的应用难题。
发明内容
本发明的目的是提供一种多功能可降解水凝胶、角膜接触镜及它们的制备方法，利用可降解的生物活性材料之间的光交联以及席夫碱反应即可获得功能可降解水凝胶，具有良好的生物相容性、透光性能和可降解性能。并且该水凝胶通过模压成型法，即可制备可控降解的角膜接触镜。该角膜接触镜可以负载抗菌药物和细胞生长因子，以达到缓解眼表炎症及促进结膜上皮修复的目的。
为达上述目的，本发明提供了一种多功能可降解水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)合成甲基丙烯酰化水凝胶
将明胶置于PBS缓冲液中水浴加热，再加入甲基丙烯酸酐，持续搅拌后透析纯化，制得甲基丙烯酰化水凝胶GelMA；
(2)化学接枝合成GelMA-LVX
将左氧氟沙星(LVX)于MES缓冲液中溶解后，依次加入羧基活化剂A、羧基活化剂B以及步骤(1)制备的甲基丙烯酰化水凝胶，持续搅拌后透析纯化，冷冻干燥制得GelMA-LVX聚合物；
(3)高碘酸钠氧化法合成醛基化透明质酸和醛基化硫酸软骨素
将透明质酸水溶液、硫酸软骨素水溶液分别与高碘酸钠水溶液反应后，加入乙二醇停止氧化，再依次透析和冷冻干燥，分别制得醛基化透明质酸(OHA)和醛基化硫酸软骨素(OCS)；
(4)制备多功能可降解水凝胶
将步骤(3)制得的醛基化硫酸软骨素与硫酸软骨素按照摩尔比3:1的比例溶于含生长因子的PBS缓冲液中，制得OCS/R溶液，将步骤(2)制得的GelMA-LVX聚合物和步骤(3)制得的醛基化透明质酸分别溶于PBS缓冲液中，制得浓度为1～2mg/mL的GL溶液和质量体积比为20～30％的OHA溶液，将GL溶液、OCS/R溶液和OHA溶液按照体积比2:1:1的比例混合并震荡，再通过紫外光交联，即可制得多功能可降解水凝胶(OHA-GL-OCS/R)。
采用上述方案的有益效果是：本发明针对传统角膜接触镜的功能单一、不可降解等缺点，提供了一种可用于角膜爆炸灼烧及化学烧伤后防护的多功能可降解水凝胶的制备方法，该方法首先以经典的丙烯酰化的方法合成GelMA，再通过EDC/NHS化学接枝法将抗菌药物左氧氟沙星与GelMA相接，接着利用高碘酸钠氧化法实现透明质酸和硫酸软骨素的醛基化，最终通过紫外光交联，席夫碱反应和生长因子负载作用得到多功能可降解水凝胶材料(OHA-GL-OCS/R)。本发明采用的丙烯酰化法，EDC/NHS羧基活化法和高碘酸钠氧化技术成熟、流程简易、安全环保；所涉及的明胶、透明质酸、硫酸软骨素都是FDA批准的食品或用品；所制备的角膜接触镜成本低廉、生物安全、可重复性高。实验结果证明本发明制得的OHA-GL-OCS/R材料为双键明胶(GelMA)、左氧氟沙星(LVX)、醛基化透明质酸(OHA)和醛基化硫磺软骨素(OCS)组成的多网络水凝胶，具有较强的自愈合能力和优异的透光性，其优异的细胞相容性为其体内应用奠定了基础。
进一步地，明胶为鱼皮明胶或猪皮明胶，明胶的分子量为10000～1000000，明胶置于PBS缓冲液后的浓度为0.01～0.02g/mL。
进一步地，步骤(1)中甲基丙烯酸酐与PBS缓冲液的体积比为1～2:10，搅拌的时间为55～65min。
进一步地，步骤(2)中的羧基活化剂A为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，羧基活化剂B为N-羟基丁二酰亚胺，步骤(2)中左氧氟沙星与甲基丙烯酰化水凝胶的质量比为1～4:1。
进一步地，步骤(2)的化学接枝在空气、氮气气氛或真空环境中进行。
进一步地，步骤(2)具体包括以下步骤：于避光条件下，将左氧氟沙星于MES缓冲液中溶解，加热搅拌1h后加入2mmol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，反应30min，再加入2mmol N-羟基丁二酰亚胺，搅拌10～12h后加入步骤(1)制备的甲基丙烯酰化水凝胶，持续搅拌10～12h，将反应产物于去离子水中的透析纯化45～50h后，冷冻干燥制得GelMA-LVX聚合物。
进一步地，步骤(3)的反应均在避光下室温进行或者冰水浴进行，醛基化透明质酸的反应时间为100～140min，醛基化硫酸软骨素的反应时间为160～200min，醛基化透明质酸和醛基化硫酸软骨素的浓度均为0.01～0.02g/mL。
进一步地，步骤(4)中的生长因子为bFGF、EGF、aFGF、rhEGF或rhFGF。
进一步地，OCS聚合物和bFGF、EGF、aFGF、rhEGF或rhFGF溶解到HEPES缓冲液中，得OCS/bFGF复合物、OCS/EGF复合物、OCS/aFGF复合物、OCS/rhEGF复合物或OCS/rhFGF复合物。
进一步地，OCS/bFGF复合物、OCS/EGF复合物、OCS/aFGF复合物、OCS/rhEGF复合物或OCS/rhFGF复合物与OAH复合物和GelMA-LVX聚合物形成的复合水凝胶为多网络水凝胶OHA-GL-OCS/bFGF、多网络水凝胶OHA-GL-OCS/EGF、多网络水凝胶OHA-GL-OCS/aFGF、多网络水凝胶OHA-GL-OCS/rhEGF或多网络水凝胶OHA-GL-OCS/rhFGF。
采用多功能可降解水凝胶的制备方法制备得到的多功能可降解水凝胶。
进一步地，多功能可降解水凝胶包括相互穿插的水凝胶网络A和水凝胶网络B，凝胶网络A为OHA-GL，凝胶网络A的结构式为
Figure BDA0003538078610000051
水凝胶网络B为GL-OCS/R，水凝胶网络B的结构式为
Figure BDA0003538078610000052
一种多功能可降解角膜接触镜，将多功能可降解水凝胶通过模压成型制得。
采用上述方案的有益效果是：多功能可降解水凝胶OHA-GL-OCS/R通过模压处理可以成型为角膜接触镜。当OHA-GL-OCS/R角膜接触镜通过原位佩戴的方式应用于体内时，不仅能通过水凝胶的降解缓慢释放左氧氟沙星药物来缓解眼表的炎症及创伤后疼痛，还能通过释放重组牛碱性成纤维细胞生长因子促进角膜结膜上皮修复。
综上所述，本发明具有以下优点：
1、本发明中所使用的明胶、透明质酸和硫酸软骨素均是天然生物高分子材料，不仅生物相容性良好，并且廉价易得。其中丙烯酰化后的明胶(GelMA)是一种多功能基质，具有明胶的生物活性和可紫外光交联性；透明质酸具有低免疫反应和高生物相容，被广泛应用于合成具有愈创功能的生物支架；硫酸软骨素广泛存在于人和动物软骨组织中，具有促进细胞代谢的作用。本发明合成的OHA-GL-OCS/R不仅不会引起免疫原性反应，还能通过抗菌、促上皮化作用在角膜爆炸灼烧或化学烧伤愈合过程中发挥功效。
2、本发明使用的左氧氟沙星(LVX)在眼科中使用广泛，是一种喹诺酮类药物，对多数肠杆菌科细菌(除厌氧菌和肠球菌外)具有广谱抗菌作用。
3、本发明使用的促修复成分为细胞生长因子，具有生物安全性高和促修复性能优异的优势。
4、本发明中LVX的接入，不仅起到抗菌作用，还通过为水凝胶网络的形成提供了氨基。
5、本发明中制备的OHA-GL-OCS/R多网络水凝胶通过席夫碱反应和紫外光交联形成，合成方法简单高效，对仪器设备无特殊要求，产业化可能性高。
6、本发明中使用的溶剂为PBS、MES缓冲液和去离子水，所制备的OHA-GL-OCS/R多网络水凝胶不存在任何的有机溶剂。
7、本发明中制备的多功能可降解角膜接触镜，具有优异透光性和生物相容性，保存方便、佩戴简便，可以在眼部创伤部位持续抗炎抗菌镇痛，同时水凝胶的可降解性也避免了取出角膜接触镜时的感染风险。
附图说明
图1为本发明制备的GelMA预聚物、OHA聚合物、OCS聚合物以及GelMA-LVX聚合物的FTIR光谱；
其中，图1(A)为GelMA预聚物的FTIR光谱，图1(B)为OHA聚合物的FTIR光谱，图1(C)为OCS聚合物的FTIR光谱，图1(D)为GelMA-LVX聚合物的FTIR光谱；
图2为本发明制得的OHA-GL-OCS/R水凝胶的成胶示意图；
图3为本发明制得的OHA-GL-OCS/bFGF水凝胶的物理化学表征结果；
其中，图3(A)为SEM照片，图3(B)为FTIR光谱，图3(C)为自愈合性测试结果，图3(D)为模量值；
图4为本发明制得的OHA-GL-OCS/bFGF水凝胶的流变性质；
其中，图4(A)为凝胶的粘度随剪切速率的变化曲线，图4(B)为凝胶的模量随剪切应变的变化曲线；
图5为本发明制得的OHA-GL-OCS/bFGF水凝胶对人角膜上皮细胞(HCEC)相容性的测定结果；
其中，图5(A)为细胞活力值，图5(B)为细胞LIVE/DEAD染色照片；
图6为本发明制得的OHA-GL-OCS/bFGF水凝胶促HCEC细胞迁移结果；
图7为本发明制得的OHA-GL-OCS/R水凝胶的的原理示意图；
图8为本发明涉及到的材料的结构式。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明中所涉及的所有PBS缓冲液的pH为7.4，MES缓冲液的浓度为50mM，MES缓冲液的pH为4～6。本发明所有设计到的材料的结构式如图8所示。
本发明致力于制备一种具有优异透光性和生物相容性的软性角膜接触镜，应用于角膜爆炸灼烧及化学烧伤后的防护。尽管眼表面积仅占身体前表面积的0.27％，但脆弱的眼组织很容易受到损伤。目前的眼部创伤防治手段单一，针对不同类型的眼外伤，治疗方案包括：眼球发生机械性眼外伤时，伤眼包扎，及时送至医院再进行处理；眼表发生非机械性眼外伤时，可以通过涂抹药膏、局部或全身使用抗生素治疗的方式进行预处理，一旦处置不及时，角膜可能出现感染，预后视力差的风险增大。因此，研制一款可以易于携带，简便操作，可以长时间持续抗炎抗菌镇痛，同时保护角膜上皮的软性治疗型角膜接触镜有重要意义。目前载药角膜接触镜可以用于治疗角膜溃疡和角膜穿孔等疾病等，但材料的不可降解性增加了眼部感染风险。水凝胶因为具有供营养物质流通的多孔结构、可控的生物降解和良好的生物相容性，已经广泛应用于生物医学领域。因此，本发明设计并合成一种具有可降解性、高透光性、可自愈合、低毒的OHA-GL-OCS/R(R为生长因子)水凝胶。
实施例1
本实施例提供了一种多功能可降解的多网络水凝胶OHA-GL-OCS/bFGF的制备方法，包括以下步骤：
(1)合成GelMA
将1g鱼皮明胶溶解于50mL PBS缓冲液中，并在50℃水浴环境中剧烈搅拌，待明胶完全溶解后加入5mL甲基丙烯酸酐，反应1h后，将反应混合物用200mL去离子水稀释，并转移至截留分子量为500的透析袋中，在40℃的去离子水中透析纯化24h，冷冻干燥后得到白色固体GelMA；
(2)合成GelMA-LVX
避光称取180mg(0.5mmol)LVX并溶于80mL MES缓冲液，40℃条件下搅拌使GelMA完全溶解，1h后加入2mmol羧基活化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，反应30min后加入2mmol N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，搅拌12h再加入180mg GelMA聚合物，继续搅拌12h得到反应产物液体，产物在去离子水透析纯化48h，待除去活化剂EDC/NHS及未反应的单体后，冷冻干燥得到GelMA-LVX聚合物；
(3)合成OHA和OCS
在避光条件下将1g透明质酸钠(HA)和1g硫酸软骨素(CS)分别溶解于两份100mL去离子水中，随后均加入5mL浓度为0.042g mL-1的高碘酸钠水溶液，反应2.0h后加入乙二醇终止氧化，再通过透析收集聚合物，最后通过冷冻干燥得到OHA产物和OCS产物；
(4)OHA-GL-OCS/bFGF的制备
将OCS与硫酸软骨素按照摩尔比3:1的比例溶于含bFGF的PBS缓冲液中，得到OCS/bFGF溶液，随后分别将GelMA-LVX与OHA溶于PBS缓冲液得到浓度为1mg/mL的GL溶液与质量体积比为25％的OHA溶液；最后将GL溶液、OCS/bFGF溶液、OHA溶液按照2:1:1的体积比加入透明模具中，通过震荡即可实现醛基与氨基的席夫碱反应，再辅以紫外光交联获得同时载有生长因子与药物的多网络水凝胶OHA-GL-OCS/bFGF。
实施例2
本实施例提供了一种多功能可降解的多网络水凝胶OHA-GL-OCS/bFGF的制备方法，包括以下步骤：
(1)合成GelMA
将1g猪皮明胶溶解于50mL PBS缓冲液中，并在50℃水浴环境中剧烈搅拌，待明胶完全溶解后加入5mL甲基丙烯酸酐，反应1h后，将反应混合物用200mL去离子水稀释，并转移至截留分子量为500的透析袋中，在40℃的去离子水中透析纯化24h，冷冻干燥后得到白色固体GelMA；
(2)合成GelMA-LVX
避光称取180mg(0.5mmol)LVX并溶于80mL MES缓冲液，40℃条件下搅拌使GelMA完全溶解，1h后加入2mmol羧基活化剂EDC，反应30min后加入2mmol NHS，搅拌12h再加入180mgGelMA聚合物，继续搅拌12h得到反应产物液体，产物在去离子水透析纯化48h，待除去活化剂EDC/NHS及未反应的单体后，冷冻干燥得到GelMA-LVX聚合物；
(3)合成OHA和OCS
在避光条件下将1g HA和1g CS分别溶解于100mL去离子水中，随后均加入5mL浓度为0.042g mL-1高碘酸钠水溶液，反应2.5h后加入乙二醇终止氧化，再通过透析收集聚合物，最后通过冷冻干燥得到OHA产物和OCS产物；
(4)OHA-GL-OCS/bFGF的制备
将OCS与硫酸软骨素按照摩尔比3:1的比例溶于含bFGF的PBS缓冲液中，得到OCS/bFGF溶液，随后分别将GelMA-LVX与OHA溶于PBS缓冲液得到浓度为1mg/mL的GL溶液与质量体积比为25％的OHA溶液；最后将GL溶液、OCS/bFGF溶液、OHA溶液按照2:1:1的体积比加入透明模具中，通过震荡即可实现醛基与氨基的席夫碱反应，再辅以紫外光交联获得同时载有生长因子与药物的多网络水凝胶OHA-GL-OCS/bFGF。
实施例3
本实施例提供了一种多功能可降解的多网络水凝胶OHA-GL-OCS/bFGF的制备方法，包括以下步骤：
(1)合成GelMA
将1g鱼皮明胶溶解于50mL PBS缓冲液中，并在50℃水浴环境中剧烈搅拌，待明胶完全溶解后加入5mL甲基丙烯酸酐，反应1h后，将反应混合物用200mL去离子水稀释，并转移至截留分子量为500的透析袋中，在40℃的去离子水中透析纯化24h，冷冻干燥后得到白色固体GelMA；
(2)合成GelMA-LVX
避光称取180mg(0.5mmol)LVX并溶于80mL MES缓冲液，40℃条件下搅拌使GelMA完全溶解，随后将溶液转移至氮气环境中，1h后加入2mmol羧基活化剂EDC，反应30min后加入2mmol NHS，搅拌12h再加入180mg GelMA聚合物，继续搅拌12h得到反应产物液体，产物在去离子水透析纯化48h，待除去活化剂EDC/NHS及未反应的单体后，冷冻干燥得到GelMA-LVX聚合物；
(3)合成OHA和OCS
在避光条件下将1g HA和1g CS分别溶解于100mL去离子水中，随后加入5mL浓度为0.042g mL-1高碘酸钠水溶液，反应2.5h后加入乙二醇终止氧化，再通过透析收集聚合物，最后通过冷冻干燥得到OHA产物和OCS产物；
(4)OHA-GL-OCS/bFGF的制备
将OCS与硫酸软骨素按照摩尔比3:1的比例溶于含bFGF的PBS缓冲液中，得到OCS/bFGF溶液，随后分别将GelMA-LVX与OHA溶于PBS缓冲液得到浓度为1mg/mL的GL溶液与质量体积比为25％的OHA溶液；最后将GL溶液、OCS/bFGF溶液、OHA溶液按照2:1:1的体积比加入透明模具中，通过震荡即可实现醛基与氨基的席夫碱反应，再辅以紫外光交联获得同时载有生长因子与药物的多网络水凝胶OHA-GL-OCS/bFGF。
实施例4
本实施例提供了一种多功能可降解的多网络水凝胶OHA-GL-OCS/bFGF的制备方法，包括以下步骤：
(1)合成GelMA
将1g鱼皮明胶溶解于50mL PBS缓冲液中，并在50℃水浴环境中剧烈搅拌，待明胶完全溶解后加入5mL甲基丙烯酸酐，反应1h后，将反应混合物用200mL去离子水稀释，并转移至截留分子量为500的透析袋中，在40℃的去离子水中透析纯化24h，冷冻干燥后得到白色固体GelMA；
(2)合成GelMA-LVX
避光称取180mg(0.5mmol)LVX并溶于80mL MES缓冲液，40℃条件下搅拌使GelMA完全溶解，随后将溶液转移至真空环境中，1h后加入2mmol羧基活化剂EDC，反应30min后加入2mmol NHS，搅拌12h再加入180mg GelMA聚合物，继续搅拌12h得到反应产物液体，产物在去离子水透析纯化48h，待除去活化剂EDC/NHS及未反应的单体后，冷冻干燥得到GelMA-LVX聚合物；
(3)合成OHA和OCS
在避光条件下将1g HA和1g CS分别溶解于100mL去离子水中，随后加入5mL浓度为0.042g mL-1高碘酸钠水溶液，反应2.0h后加入乙二醇终止氧化，再通过透析收集聚合物，最后通过冷冻干燥得到OHA产物和OCS产物；
(4)OHA-GL-OCS/bFGF的制备
将OCS与硫酸软骨素按照摩尔比3:1的比例溶于含bFGF的PBS缓冲液中，得到OCS/bFGF溶液，随后分别将GelMA-LVX与OHA溶于PBS缓冲液得到浓度为1mg/mL的GL溶液与质量体积比为25％的OHA溶液；最后将GL溶液、OCS/bFGF溶液、OHA溶液按照2:1:1的体积比加入透明模具中，通过震荡即可实现醛基与氨基的席夫碱反应，再辅以紫外光交联获得同时载有生长因子与药物的多网络水凝胶OHA-GL-OCS/bFGF。
实施例5
本实施例提供了一种多功能可降解的多网络水凝胶OHA-GL-OCS/bFGF的制备方法，包括以下步骤：
(1)合成GelMA
将1g鱼皮明胶溶解于50mL PBS缓冲液中，并在50℃水浴环境中剧烈搅拌，待明胶完全溶解后加入5mL甲基丙烯酸酐，反应1h后，将反应混合物用200mL去离子水稀释，并转移至截留分子量为500的透析袋中，在40℃的去离子水中透析纯化24h，冷冻干燥后得到白色固体GelMA；
(2)合成GelMA-LVX
避光称取360mg(1mmol)LVX并溶于80mL MES缓冲液，40℃条件下搅拌使GelMA完全溶解，1h后加入2mmol羧基活化剂EDC，反应30min后加入2mmol NHS，搅拌12h再加入180mgGelMA聚合物，继续搅拌12h得到反应产物液体，产物在去离子水透析纯化48h，待除去活化剂EDC/NHS及未反应的单体后，冷冻干燥得到GelMA-LVX聚合物；
(3)合成OHA和OCS
在避光条件下将1g HA和1.0g CS分别溶解于100mL去离子水中，随后加入5mL浓度为0.042g mL-1高碘酸钠水溶液，反应2.0h后加入乙二醇终止氧化，再通过透析收集聚合物，最后通过冷冻干燥得到OHA产物和OCS产物；
(4)OHA-GL-OCS/bFGF的制备
将OCS与硫酸软骨素按照摩尔比3:1的比例溶于含bFGF的PBS缓冲液中，得到OCS/bFGF溶液，随后分别将GelMA-LVX与OHA溶于PBS缓冲液得到浓度为1mg/mL的GL溶液与质量体积比为25％的OHA溶液；最后将GL溶液、OCS/bFGF溶液、OHA溶液按照2:1:1的体积比加入透明模具中，通过震荡即可实现醛基与氨基的席夫碱反应，再辅以紫外光交联获得同时载有生长因子与药物的多网络水凝胶OHA-GL-OCS/bFGF。
实施例6
本实施例提供了一种多功能可降解的多网络水凝胶OHA-GL-OCS/bFGF的制备方法，包括以下步骤：
(1)合成GelMA
将1g鱼皮明胶溶解于50mL PBS缓冲液中，并在50℃水浴环境中剧烈搅拌，待明胶完全溶解后加入5mL甲基丙烯酸酐，反应1h后，将反应混合物用200mL去离子水稀释，并转移至截留分子量为500的透析袋中，在40℃的去离子水中透析纯化24h，冷冻干燥后得到白色固体GelMA；
(2)合成GelMA-LVX
避光称取540mg(1.5mmol)LVX并溶于80mL MES缓冲液，40℃条件下搅拌使GelMA完全溶解，1h后加入2mmol羧基活化剂EDC，反应30min后加入2mmol NHS，搅拌12h再加入180mgGelMA聚合物，继续搅拌12h得到反应产物液体，产物在去离子水透析纯化48h，待除去活化剂EDC/NHS及未反应的单体后，冷冻干燥得到GelMA-LVX聚合物；
(3)合成OHA和OCS
在避光条件下将1g HA和1.0g CS分别溶解于100mL去离子水中，随后加入5mL浓度为0.042g mL-1高碘酸钠水溶液，反应2.5h后加入乙二醇终止氧化，再通过透析收集聚合物，最后通过冷冻干燥得到OHA产物和OCS产物；
(4)OHA-GL-OCS/bFGF的制备
将OCS与硫酸软骨素按照摩尔比3:1的比例溶于含bFGF的PBS缓冲液中，得到OCS/bFGF溶液，随后分别将GelMA-LVX与OHA溶于PBS缓冲液得到浓度为1mg/mL的GL溶液与质量体积比为25％的OHA溶液；最后将GL溶液、OCS/bFGF溶液、OHA溶液按照2:1:1的体积比加入透明模具中，通过震荡即可实现醛基与氨基的席夫碱反应，再辅以紫外光交联获得同时载有生长因子与药物的多网络水凝胶OHA-GL-OCS/bFGF。
实施例7
本实施例提供了一种多功能可降解的多网络水凝胶OHA-GL-OCS/bFGF的制备方法，包括以下步骤：
(1)合成GelMA
将1g鱼皮明胶溶解于50mL PBS缓冲液中，并在50℃水浴环境中剧烈搅拌，待明胶完全溶解后加入5mL甲基丙烯酸酐，反应1h后，将反应混合物用200mL去离子水稀释，并转移至截留分子量为500的透析袋中，在40℃的去离子水中透析纯化24h，冷冻干燥后得到白色固体GelMA；
(2)合成GelMA-LVX
避光称取720mg(2mmol)LVX并溶于80mL MES缓冲液，40℃条件下搅拌使GelMA完全溶解，1h后加入2mmol羧基活化剂EDC，反应30min后加入2mmol NHS，搅拌12h再加入180mgGelMA聚合物，继续搅拌12h得到反应产物液体，产物在去离子水透析纯化48h，待除去活化剂EDC/NHS及未反应的单体后，冷冻干燥得到GelMA-LVX聚合物；
(3)合成OHA和OCS
在避光条件下将1g HA和1.0g CS分别溶解于100mL去离子水中，随后加入5mL浓度为0.042g mL-1高碘酸钠水溶液，反应2.0h后加入乙二醇终止氧化，再通过透析收集聚合物，最后通过冷冻干燥得到OHA产物和OCS产物；
(4)OHA-GL-OCS/bFGF的制备
将OCS与硫酸软骨素按照摩尔比3:1的比例溶于含bFGF的PBS缓冲液中，得到OCS/bFGF溶液，随后分别将GelMA-LVX与OHA溶于PBS缓冲液得到浓度为1mg/mL的GL溶液与质量体积比为25％的OHA溶液；最后将GL溶液、OCS/bFGF溶液、OHA溶液按照2:1:1的体积比加入透明模具中，通过震荡即可实现醛基与氨基的席夫碱反应，再辅以紫外光交联获得同时载有生长因子与药物的多网络水凝胶OHA-GL-OCS/bFGF。
实施例8
本实施例提供了一种多功能可降解的多网络水凝胶OHA-GL-OCS/bFGF的制备方法，包括以下步骤：
(1)合成GelMA
将1g鱼皮明胶溶解于50mL PBS缓冲液中，并在50℃水浴环境中剧烈搅拌，待明胶完全溶解后加入5mL甲基丙烯酸酐，反应1h后，将反应混合物用200mL去离子水稀释，并转移至截留分子量为500的透析袋中，在40℃的去离子水中透析纯化24h，冷冻干燥后得到白色固体GelMA；
(2)合成GelMA-LVX
避光称取180mg(0.5mmol)LVX并溶于80mL MES缓冲液，40℃条件下搅拌使GelMA完全溶解，1h后加入2mmol羧基活化剂EDC，反应30min后加入2mmol NHS，搅拌12h再加入180mgGelMA聚合物，继续搅拌12h得到反应产物液体，产物在去离子水透析纯化48h，待除去活化剂EDC/NHS及未反应的单体后，冷冻干燥得到GelMA-LVX聚合物；
(3)合成OHA和OCS
在冰水浴、避光条件下将1g HA和1.0g CS分别溶解于100mL去离子水中，随后加入5mL浓度为0.042g mL-1高碘酸钠水溶液，反应2.5h后加入乙二醇终止氧化，再通过透析收集聚合物，最后通过冷冻干燥得到OHA产物和OCS产物；
(4)OHA-GL-OCS/bFGF的制备
将OCS与硫酸软骨素按照摩尔比3:1的比例溶于含bFGF的PBS缓冲液中，得到OCS/bFGF溶液，随后分别将GelMA-LVX与OHA溶于PBS缓冲液得到浓度为1mg/mL的GL溶液与质量体积比为25％的OHA溶液；最后将GL溶液、OCS/bFGF溶液、OHA溶液按照2:1:1的体积比加入透明模具中，通过震荡即可实现醛基与氨基的席夫碱反应，再辅以紫外光交联获得同时载有生长因子与药物的多网络水凝胶OHA-GL-OCS/bFGF。
实施例9
本实施例提供了一种多功能可降解的多网络水凝胶OHA-GL-OCS/EGF的制备方法，包括以下步骤：
(1)合成GelMA
将1g鱼皮明胶溶解于50mL PBS缓冲液中，并在50℃水浴环境中剧烈搅拌，待明胶完全溶解后加入5mL甲基丙烯酸酐，反应1h后，将反应混合物用200mL去离子水稀释，并转移至截留分子量为500的透析袋中，在40℃的去离子水中透析纯化24h，冷冻干燥后得到白色固体GelMA；
(2)合成GelMA-LVX
避光称取180mg(0.5mmol)LVX并溶于80mL MES缓冲液，40℃条件下搅拌使GelMA完全溶解，1h后加入2mmol羧基活化剂EDC，反应30min后加入2mmol NHS，搅拌12h再加入180mgGelMA聚合物，继续搅拌12h得到反应产物液体，产物在去离子水透析纯化48h，待除去活化剂EDC/NHS及未反应的单体后，冷冻干燥得到GelMA-LVX聚合物；
(3)合成OHA和OCS
在避光条件下将1g HA和1.0g CS分别溶解于100mL去离子水中，随后加入5mL浓度为0.042g mL-1高碘酸钠水溶液，反应2.0h后加入乙二醇终止氧化，再通过透析收集聚合物，最后通过冷冻干燥分别得到OHA产物和OCS产物；
(4)OHA-GL-OCS/EGF的制备
将OCS与硫酸软骨素按照摩尔比3:1的比例溶于含EGF的PBS缓冲液中，得到OCS/EGF溶液，随后分别将GelMA-LVX与OHA溶于PBS缓冲液得到浓度为1mg/mL的GL溶液与质量体积比为25％的OHA溶液；最后将GL溶液、OCS/EGF溶液、OHA溶液按照2:1:1的体积比加入透明模具中，通过震荡即可实现醛基与氨基的席夫碱反应，再辅以紫外光交联获得同时载有生长因子与药物的多网络水凝胶OHA-GL-OCS/EGF。
实施例10
本实施例提供了一种多功能可降解的多网络水凝胶OHA-GL-OCS/aFGF的制备方法，包括以下步骤：
(1)合成GelMA
将1g鱼皮明胶溶解于50mL PBS缓冲液中，并在50℃水浴环境中剧烈搅拌，待明胶完全溶解后加入5mL甲基丙烯酸酐，反应1h后，将反应混合物用200mL去离子水稀释，并转移至截留分子量为500的透析袋中，在40℃的去离子水中透析纯化24h，冷冻干燥后得到白色固体GelMA；
(2)合成GelMA-LVX
避光称取180mg(0.5mmol)LVX并溶于80mL MES缓冲液，40℃条件下搅拌使GelMA完全溶解，1h后加入2mmol EDC，反应30min后加入2mmol NHS，搅拌12h再加入180mg GelMA聚合物，继续搅拌12h得到反应产物液体，产物在去离子水透析纯化48h，待除去活化剂EDC/NHS及未反应的单体后，冷冻干燥得到GelMA-LVX聚合物；
(3)合成OHA和OCS
在避光条件下将1g透明质酸钠(HA)和1.0g硫酸软骨素(CS)分别溶解于100mL去离子水中，随后均加入5mL浓度为0.042g mL-1高碘酸钠水溶液，反应2.5h后加入乙二醇终止氧化，再通过透析收集聚合物，最后通过冷冻干燥分别得到OHA产物和OCS产物；
(4)OHA-GL-OCS/aFGF的制备
将OCS与硫酸软骨素按照摩尔比3:1的比例溶于含bFGF的PBS缓冲液中，得到OCS/aFGF溶液，随后分别将GelMA-LVX与OHA溶于PBS缓冲液得到浓度为1mg/mL的GL溶液与质量体积比为25％的OHA溶液；最后将GL溶液、OCS/aFGF溶液、OHA溶液按照2:1:1的体积比加入透明模具中，通过震荡即可实现醛基与氨基的席夫碱反应，再辅以紫外光交联获得同时载有生长因子与药物的多网络水凝胶OHA-GL-OCS/aFGF。
实施例11
本实施例提供了一种多功能可降解的多网络水凝胶OHA-GL-OCS/rhEGF的制备方法，包括以下步骤：
(1)合成GelMA
将1g鱼皮明胶溶解于50mL PBS缓冲液中，并在50℃水浴环境中剧烈搅拌，待明胶完全溶解后加入5mL甲基丙烯酸酐，反应1h后，将反应混合物用200mL去离子水稀释，并转移至截留分子量为500的透析袋中，在40℃的去离子水中透析纯化24h，冷冻干燥后得到白色固体GelMA；
(2)合成GelMA-LVX
避光称取180mg(0.5mmol)LVX并溶于80mL MES缓冲液，40℃条件下搅拌使GelMA完全溶解，1h后加入2mmol EDC，反应30min后加入2mmol NHS，搅拌12h再加入180mg GelMA聚合物，继续搅拌12h得到反应产物液体，产物在去离子水透析纯化48h，待除去活化剂EDC/NHS及未反应的单体后，冷冻干燥得到GelMA-LVX聚合物；
(3)合成OHA和OCS
在避光条件下将1g透明质酸钠(HA)和1.0g硫酸软骨素(CS)分别溶解于100mL去离子水中，随后加入5mL浓度为0.042g mL-1高碘酸钠水溶液，反应2.5h后加入乙二醇终止氧化，再通过透析收集聚合物，最后通过冷冻干燥得到OHA产物和OCS产物；
(4)OHA-GL-OCS/rhEGF的制备
将OCS与硫酸软骨素按照摩尔比3:1的比例溶于含bFGF的PBS缓冲液中，得到OCS/rhEGF溶液，随后分别将GelMA-LVX与OHA溶于PBS缓冲液得到浓度为1mg/mL的GL溶液与质量体积比为25％的OHA溶液；最后将GL溶液、OCS/rhEGF溶液、OHA溶液按照2:1:1的体积比加入透明模具中，通过震荡即可实现醛基与氨基的席夫碱反应，再辅以紫外光交联获得同时载有生长因子与药物的多网络水凝胶OHA-GL-OCS/rhEGF。
实施例12
本实施例提供了一种多功能可降解的多网络水凝胶OHA-GL-OCS/rhFGF的制备方法，包括以下步骤：
(1)合成GelMA
将1g鱼皮明胶溶解于50mL PBS缓冲液中，并在50℃水浴环境中剧烈搅拌，待明胶完全溶解后加入5mL甲基丙烯酸酐，反应1h后，将反应混合物用200mL去离子水稀释，并转移至截留分子量为500的透析袋中，在40℃的去离子水中透析纯化24h，冷冻干燥后得到白色固体GelMA；
(2)合成GelMA-LVX
避光称取180mg(0.5mmol)LVX并溶于80mL MES缓冲液，40℃条件下搅拌使GelMA完全溶解，1h后加入2mmol羧基活化剂EDC，反应30min后加入2mmol NHS，搅拌12h再加入180mgGelMA聚合物，继续搅拌12h得到反应产物液体，产物在去离子水透析纯化48h，待除去活化剂EDC/NHS及未反应的单体后，冷冻干燥得到GelMA-LVX聚合物；
(3)合成OHA和OCS
在避光条件下将1g透明质酸钠(HA)和1.0g硫酸软骨素(CS)溶解于100mL去离子水中，随后加入5mL浓度为0.042g mL-1高碘酸钠水溶液，反应2.0h后加入乙二醇终止氧化，再通过透析收集聚合物，最后通过冷冻干燥得到OHA产物和OCS产物；
(4)OHA-GL-OCS/rhFGF的制备
将OCS与硫酸软骨素按照摩尔比3:1的比例溶于含bFGF的PBS缓冲液中，得到OCS/rhFGF溶液，随后分别将GelMA-LVX与OHA溶于PBS缓冲液得到浓度为1mg/mL的GL溶液与质量体积比为25％的OHA溶液；最后将GL溶液、OCS/rhFGF溶液、OHA溶液按照2:1:1的体积比加入透明模具中，通过震荡即可实现醛基与氨基的席夫碱反应，再辅以紫外光交联获得同时载有生长因子与药物的多网络水凝胶OHA-GL-OCS/rhFGF。
试验例
本发明对合成的OHA-GL-OCS/bFGF水凝胶的物理化学性质、细胞相容性、体外促修复性质及其在爆炸引起的眼部创伤愈合过程中起到的作用及机理进行研究，结果如图1-6所示。
图1是合成OHA-GL-OCS/bFGF水凝胶所需的聚合物的FTIR光谱。由图2(A)所示的GelMA的FTIR光谱可以看出，1612cm-1处的红外吸收峰归属于碳碳双键的特征吸收峰，证明双键明胶的形成。由图2(B)和图2(C)可知，1710cm-1处的红外吸收峰是醛基的特征吸收峰。图2(D)可以看出，GelMA聚合物中1645cm-1处的吸收峰是酰胺键(-CONH-)的伸缩振动引起的，由此说明LVX中-COOH与GelMA中-NH2的成功反应。
图2是本发明制得的OHA-GL-OCS/R水凝胶的成胶示意图。由图可知，相比于流动态的GelMA溶液，加入OHA溶液、OCS溶液并充分混合振荡、紫外光照后的OHA-GL-OCS/R为凝胶状态。
图3为本发明制得的OHA-GL-OCS/bFGF水凝胶的物理化学表征结果。由图3(A)可知，OHA-GL-OCS/bFGF多孔的三维结构类似细胞外基质环境，有利于营养物质和代谢产物的流通。图3(B)所示的FTIR光谱中不仅可以观察到GelMA中-CONH-和-C＝C-的吸收峰(1610-1630cm-1处的吸收峰)，并且1700cm-1处吸收峰的消失证明OHA和OCS中醛基与GelMA中的氨基发生了席夫碱反应。图3(C)所示的自愈合实验结果说明分离的OHA-GL-OCS/bFGF水凝胶可以沿着切口逐步愈合。通过比较1％剪切应变下材料在室温环境中的储存模量，进一步确定OHA-GL-OCS/bFGF水凝胶的强度，如图3(D)所示，水凝胶的储存模量(G’)和(G”)分别为258和130Pa，并且在10分钟内的G’的值都高于G”，表明凝胶的时间稳定性。
图4为本发明制得的OHA-GL-OCS/bFGF水凝胶的流变性质。如图4(A)所示，随着剪切速率的增大，水凝胶的粘度显著降低，这一现象被称为剪切稀释效应，说明OHA-GL-OCS/bFGF水凝胶可以具有可注射性质。图4(B)说明了水凝胶在高低振荡循环变化过程中的模量变化，可见，OHA-GL-OCS/bFGF水凝胶的G’与G”在5次循环中未出现明显的变化，表现出一种自愈合特性。
图5为本发明制得的OHA-GL-OCS/bFGF水凝胶对人角膜上皮细胞(HCEC)相容性的测定结果。具体实验过程为：首先将OHA-GL-OCS/bFGF水凝胶置于55℃培养箱中灭菌5h，随后将HCEC细胞以每孔5000个细胞的密度接种在48孔细胞培养板中，并置于37℃培养箱中过夜培养。待细胞完全贴壁后，向细胞培养液中加入20μg不同浓度的灭菌凝胶。培养液中OHA-GL-OCS/bFGF凝胶的最终浓度为0、25、50、100和200μg mL-1。在继续孵育24小时后，分别通过AlamarBlueTM检测试剂盒和LIVE/DEADTM染色试剂盒表征HCEC细胞的存活情况。由图5可以看出，OHA-GL-OCS/bFGF水凝胶在0-200μg mL-1浓度范围内的细胞毒性特别低，尤其是浓度在50-100μg mL-1内的材料对HCEC细胞的增殖有一定的促进作用。
图6为本发明制得的OHA-GL-OCS/bFGF水凝胶促HCEC细胞迁移结果。具体实验过程为：首先将OHA-GL-OCS/bFGF水凝胶灭菌处理，随后将HCEC细胞按照每孔50000个的密度接种在6孔板中，使用含10％FBS的DMEM培养液在37℃恒温恒湿培养箱中培养至细胞汇合形成单层。移除旧培养液并用10μL移液管尖端在培养板底部制造划痕。每孔至少包含3条划痕。随后，用PBS轻轻吹洗细胞，直至洗去被划掉的细胞。同时，配制含1％FBS的DMEM培养液作为迁移培养液。将OHA-GL-OCS/bFGF水凝胶按照100μg mL-1的浓度分散在迁移培养液中，并加入含划痕的6孔板中。在水凝胶与细胞在37℃共培养的第0、6、12和24小时用倒置显微镜观察划痕，并用连接在显微镜上的数码相机拍摄划痕图像。由图6可知，材料与细胞共培养24h后，与低血清培养液(TCP组)相比，含水凝胶浸出液的细胞培养液可加快HCEC细胞的迁移。
本发明中所制备的用于角膜爆炸灼烧及化学烧伤后防护的多功能软性角膜接触镜(OHA-GL-OCS/R)，制备原料绿色、制备流程简易，具有可透光、可自愈合性、可降解的特点，可以加快HCEC细胞的增殖与迁移，因此该水凝胶材料在角膜爆炸灼烧及化学烧伤引起的眼部损伤修复中有着很好的应用前景。
综上所述，本发明所制备的用于角膜爆炸灼烧及化学烧伤后防护的多功能水凝胶材料可以高效的负载抗菌药物和生长因子。OHA-GL-OCS/R水凝胶的自愈合、可注射性能使得材料在特定的模具中通过模压作用制备出OHA-GL-OCS/R角膜接触镜。除此之外，当OHA-GL-OCS/R作用于角膜爆炸灼烧及化学烧伤造成的创面时，随着水凝胶的降解可以实现药物和生长因子的可控释放，这使得其在角膜爆炸灼烧及化学烧伤后的防护应用中具有显著优势。
虽然对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。

Claims (10)

1.一种多功能可降解水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)合成甲基丙烯酰化水凝胶
将明胶置于PBS缓冲液中水浴加热，再加入甲基丙烯酸酐，持续搅拌后透析纯化，制得甲基丙烯酰化水凝胶；
(2)化学接枝合成GelMA-LVX
将左氧氟沙星于MES缓冲液中溶解后，依次加入羧基活化剂A、羧基活化剂B以及步骤(1)制备的甲基丙烯酰化水凝胶，持续搅拌后透析纯化，冷冻干燥制得GelMA-LVX聚合物；
(3)高碘酸钠氧化法合成醛基化透明质酸和醛基化硫酸软骨素
将透明质酸水溶液、硫酸软骨素水溶液分别与高碘酸钠水溶液反应后，加入乙二醇停止氧化，再依次透析和冷冻干燥，分别制得醛基化透明质酸和醛基化硫酸软骨素；
(4)制备多功能可降解水凝胶
将步骤(3)制得的醛基化硫酸软骨素与硫酸软骨素按照摩尔比3:1的比例溶于含生长因子的PBS缓冲液中，制得OCS/R溶液，将步骤(2)制得的GelMA-LVX聚合物和步骤(3)制得的醛基化透明质酸分别溶于PBS缓冲液中，制得浓度为1～2mg/mL的GL溶液和质量体积比为20～30％的OHA溶液，将GL溶液、OCS/R溶液和OHA溶液按照体积比2:1:1的比例混合并震荡，再通过紫外光交联，即可制得多功能可降解水凝胶。
2.如权利要求1所述的多功能可降解水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中明胶为鱼皮明胶或猪皮明胶，明胶的分子量为10000～1000000，明胶置于PBS缓冲液后的浓度为0.01～0.02g/mL。
3.如权利要求1所述的多功能可降解水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中甲基丙烯酸酐与PBS缓冲液的体积比为1～2:10，搅拌的时间为55～65min。
4.如权利要求1所述的多功能可降解水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的羧基活化剂A为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，羧基活化剂B为N-羟基丁二酰亚胺，所述步骤(2)中左氧氟沙星与甲基丙烯酰化水凝胶的质量比为1～4:1。
5.如权利要求4所述的多功能可降解水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括以下步骤：于避光条件下，将左氧氟沙星于MES缓冲液中溶解，加热搅拌1h后加入2mmol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，反应30min，再加入2mmol N-羟基丁二酰亚胺，搅拌10～12h后加入步骤(1)制备的甲基丙烯酰化水凝胶，持续搅拌10～12h，将反应产物于去离子水中的透析纯化45～50h后，冷冻干燥制得GelMA-LVX聚合物。
6.如权利要求1所述的多功能可降解水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)的反应均在避光下室温进行或者冰水浴进行，醛基化透明质酸的反应时间为100～140min，醛基化硫酸软骨素的反应时间为160～200min，醛基化透明质酸和醛基化硫酸软骨素的浓度均为0.01～0.02g/mL。
7.如权利要求1所述的多功能可降解水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中的生长因子为bFGF、EGF、aFGF、rhEGF或rhFGF。
8.采用权利要求1-7任一项所述的多功能可降解水凝胶的制备方法制备得到的多功能可降解水凝胶。
9.如权利要求8所述的多功能可降解水凝胶，其特征在于，包括相互穿插的水凝胶网络A和水凝胶网络B，所述凝胶网络A为OHA-GL，凝胶网络A的结构式为
Figure FDA0003538078600000031
所述水凝胶网络B为GL-OCS/R，所述水凝胶网络B的结构式为
Figure FDA0003538078600000032
10.一种多功能可降解角膜接触镜，其特征在于，将权利要求8或9所述的多功能可降解水凝胶通过模压成型制得。
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