CN115400071A - 负载非水溶性眼内药物控释的可注射水凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物缓控释领域，涉及一种负载非水溶性眼内药物控释的可注射水凝胶及其制备方法，方法包括：采用配制β‑环糊精溶液，加入高碘酸钠溶液反应；透析得到醛基化β‑环糊精；然后向透明质酸溶液中加入盐酸乙二胺和4‑二甲氨基吡啶溶解，再加入(1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙级碳二亚胺盐酸盐)和N‑羟基琥珀酰亚胺反应；透析得到氨基化透明质酸；配制含有伏立康唑和醛基化β‑环糊精的PBS溶液，含有氨基化透明质酸的PBS溶液；混合制备负载非水溶性眼内药物控释的可注射水凝胶。本发明将负载非水溶性药物的环糊精分子笼同时作为小分子交联剂直接交联到体系中，获得相对更均匀的可注射水凝胶，具有长效缓释控释的药物释放效果。
Description
技术领域
本发明属于药物缓控释技术领域，具体涉及一种负载非水溶性眼内药物控释的可注射水凝胶及其制备方法。
背景技术
众所周知，眼部疾病在治疗过程中难免会用到一些非水溶性的药物，多采用全身静脉注射、口服、滴眼液或玻璃体注射，甚至做玻切手术埋置的用药方式，但这几种用药方式均有各种不足。其中全身静脉注射、口服、滴眼液等存在药物利用率不高，全身毒副作用较大的问题，玻璃体注射或者玻切手术埋置属于对于机体有损伤的治疗手段，存在一定的风险性。而且上述用药方式都存在需要反复用药反复操作的问题，例如玻璃体注射中，由于药物的半衰期比较短，所以病人病程中，需要反复进行玻璃体腔穿刺注药，每一次玻璃体注射都算是一次眼部手术，容易引起患者依从性变差，可能造成眼内出血，视网膜脱离等并发症，并且存在费用昂贵的问题，造成患者较重的经济负担。
针对现有的眼部用非水溶性药物用药方式的不足，发明人研究并申请了名称为“一种伏立康唑眼内药物控释的可注射水凝胶的制备方法”、申请号为CN201810654715.7的发明专利，该发明是将药物负载到线性聚环糊精中，可注射水凝胶的交联体系是通过醛基化聚多糖(葡聚糖)和脱乙酰壳聚糖通过席夫碱反应交联在一起形成的，线性环糊精作为伏立康唑的载体只是简单分散缠结在体系中。其制备步骤如下：首先，制备白色絮状多醛基葡聚糖；然后，制备水溶性线型聚环糊精；最后制备含有伏立康唑和水溶性线型聚环糊精的PBS溶液，再将羧甲基壳聚糖溶解到上述PBS溶液中，得到伏立康唑眼内药物控释的可注射水凝胶。但是，上述发明存在以下几个缺点：
首先，其用于负载非水溶性眼内药物的线性聚环糊精是通过物理分散的过程，直接分散缠结在聚多糖的交联体系中的，其扩散降解过程仅仅依靠浓度梯度的驱动，当然也有一定的物理缠结过程的铆钉效应，但是没有通过化学交联键接到整个可注射水凝胶体系中去；
其次，所用醛基化葡聚糖和脱乙酰壳聚糖均为大分子材料，其扩散能力受大分子尺寸的影响，交联体系均匀度欠佳；
最后，所用聚多糖为常规生物大分子，与人体眼部玻璃体的主要成分相差较大，用于眼部用药时会产生一定的不适，所以上述可注射水凝胶的本体大分子体系有待于更新换代。
针对于上述缺点，目前亟需改进并更新研发一种用于负载非水溶性眼内药物的新剂型。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中存在的上述问题，提出了一种负载非水溶性眼内药物控释的可注射水凝胶及其制备方法，本发明通过选用二醛(或以上)基环糊精，控制醛基化含量，在赋予环糊精小分子一定含量醛基的同时，尽量保持环糊精分子笼的完整性，将非水溶性眼内药物负载到环糊精分子笼内的同时，作为席夫碱反应的醛基部分与氨基化透明质酸或其他含有伯氨基团的聚多糖反应完成交联，可以将负载药物的环糊精分子笼直接交联到体系中，获得相对更均匀的可注射水凝胶，该水凝胶所负载的非水溶性眼内药物具有缓释控释的释放效果。
本发明的技术方案是：
非水溶性眼内药物负载到水凝胶体系的过程并不是简单的、常规的操作，因为水凝胶是一个水性环境，如果直接将非水溶性眼内药物分散到水凝胶体系中，那么非水溶性眼内药物在此种体系中终究属于一个非均相的悬浮体系，药物分散肯定不会那么均匀，体现在疗效中，就有可能影响药物的生物利用度。
本发明设计将非水溶性眼内药物负载到环糊精分子笼中，充分利用环糊精分子笼内部疏水，外部亲水的特点，实现了非水溶性眼内药物在水凝胶体系中的分子级分散，体系会以一种小分子真溶液的状态呈现澄清透明的均相体系的特点，药物后期的缓释过程也会使药物分子以分子的形式一个个释放出来，可充分提高药物的生物利用度。
本发明将环糊精的醛基化程度控制在既不影响其载药能力，又因为醛基的引入而具有大的溶解度的状态，从而在利用环糊精分子笼充分负载非水溶性药物的同时利用其上的多醛基完成对氨基化透明质酸的交联。二者交联的过程利用的是伯氨基团和醛基发生的席夫碱反应，这一反应最大的特点就是不需要任何条件，只要两种溶液混合在一起，就可以直接反应原位交联，宏观上表现为凝胶化。本发明利用的醛基化环糊精属于较小分子物质，而氨基化透明质酸属于大分子，这样的组合有利于作为交联剂的醛基化环糊精较好的游弋于大分子氨基透明质酸之间，交易完成交联过程，此反应过程的灵活性优于相应的醛基化大分子和氨基化大分子的席夫碱反应。
基于上述设计理念，本发明提供了一种负载非水溶性眼内药物控释的可注射水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)50～60℃温度下，按β-环糊精的质量与水的体积比为(2～6)g：100mL的比值配制得到β-环糊精溶液，冷却至20～25℃，然后加入高碘酸钠溶液室温下反应1.5～2.5h，再加入适量乙二醇室温搅拌1.5～2.5h终止反应；得到的反应液透析4.0～8.0h后，置于-20～0℃下冰冻18～24h，然后于-50～-45℃冷冻干燥96～110h，得到多醛基化β-环糊精；
优选的，上述β-环糊精的质量与水的体积比为2g：100mL、4g：100mL或6g：100mL；β-环糊精的质量与水的体积比还可以为3g：100mL、5g：100mL、4g：200mL、6g：200mL、8g：200mL、10g：200mL、12g：200mL、6g：300mL、9g：300mL等。
(2)室温下，按透明质酸的质量与水的体积比为(0.4～0.6)g：100mL的比值制得透明质酸溶液，然后加入一定量的盐酸乙二胺和4-二甲氨基吡啶溶解，再加入一定量(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙级碳二亚胺盐酸盐)和N-羟基琥珀酰亚胺，调节pH为5，反应46～50h，调节pH为7，停止反应；将反应得到的溶液进行透析，透析72～96h后，置于-20～0℃下冰冻18～24h，然后于-50～-45℃冷冻干燥96～110h，得到氨基化透明质酸；
优选的，上述透明质酸的质量与水的体积比为0.4g：100mL、0.5g：100mL或0.6g：100mL；透明质酸的质量与水的体积比还可以为0.8g：200mL、1.0g：200mL、1.2g：200mL，还可以为1.2g：300mL、1.6g：400mL、2.0g：500mL等。
(3)将非水溶性眼内药物和步骤(1)得到的多醛基化β-环糊精溶解于0.01mol/LpH值为7.2～7.4的PBS溶液中，得到含有非水溶性眼内药物和醛基化β-环糊精的PBS溶液；将步骤(2)得到的氨基化透明质酸溶解到0.01mol/LpH值为7.2～7.4的PBS溶液中，得到含有氨基化透明质酸的PBS溶液；按体积比1:1将含有非水溶性眼内药物和醛基化β-环糊精的PBS溶液和含有氨基化透明质酸的PBS溶液在25～37℃下混合，得到负载非水溶性眼内药物控释的可注射水凝胶。
本发明以伏立康唑作为非水溶性眼内药物的模型药物，因此，优选地，所述非水溶性眼内药物包括伏立康唑。
进一步的，所述步骤(1)中，加入的高碘酸钠与β-环糊精的物质的量的比值为(2～4)：1。例如所述高碘酸钠与β-环糊精的物质的量的比值为2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1等。
进一步的，所述步骤(1)中，加入的乙二醇与高碘酸钠的摩尔比为(1.5～2.5)：1。例如所述乙二醇与高碘酸钠的摩尔比为1.5:1、1.8:1、2.0:1、2.3:1、2.5:1等。
进一步的，所述步骤(2)中，透明质酸的分子量为10～20万。
进一步的，所述步骤(2)中，加入的盐酸乙二胺与透明质酸的摩尔数之比为50:1；所加入的4-二甲氨基吡啶与透明质酸的摩尔数之比为30：1。
进一步的，所述步骤(2)中，加入的(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙级碳二亚胺盐酸盐)与透明质酸的摩尔数之比为50:1；所加入的N-羟基琥珀酰亚胺与透明质酸的摩尔数之比为50:1。
进一步的，所述步骤(2)中，调节pH选用1mol/L的氢氧化钠溶液。
进一步的，所述步骤(3)中，含有非水溶性眼内药物和醛基化β-环糊精的PBS溶液中，非水溶性眼内药物的浓度为1mg/mL～10mg/mL，醛基化β-环糊精的浓度为10mg/mL～50mg/mL；含有氨基化透明质酸的PBS溶液中氨基化透明质酸的浓度为30mg/mL～60mg/mL。
本发明还提供了采用上述制备方法制得的负载非水溶性眼内药物控释的可注射水凝胶。
本发明的有益效果：
(1)本发明选用可生物降解高分子材料透明质酸作为可注射水凝胶的主体大分子，透明质酸是人眼部玻璃体中除水之外含量最多的一种生物大分子，对于眼睛玻璃体具有优异的同质性的生物相容性，材料的适配性好；采用此种材料制备的水凝胶，属于一种适用于眼部玻璃体直接注射的药物控释水凝胶，提供了治疗眼部疾病过程中玻切手术的一项替代方案。
(2)本发明体系不但增强了药物控释效果而且克服了小分子交联剂二醛的毒性问题，同时克服了完全大分子交联体系不能同时完成药物负载的不足，而且小分子多醛作为交联剂，其在体系中的扩散能力要强于大分子，从而可以保证获得相对更均匀的可注射水凝胶，凝胶化时间也较易控制。
(3)本发明提供的水凝胶体系所用的醛基化β-环糊精无毒副作用、且同时具有负载非水溶性眼内药物的作用，能够使非水溶性眼内药物均匀分散于水溶液中形成小分子真溶液，为水凝胶的药物缓释过程提供了分子级别的释放过程，使得此可注射水凝胶的药物缓控释过程呈现多级释放。并且，可根据病情严重程度调整交联密度，从而调整药物负载量和缓释时间。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的可注射水凝胶在PBS溶液中凝胶化的数码照片图；
图2为本发明实施例1制备的可注射水凝胶的SEM图；
图3为本发明实施例2制备的可注射水凝胶的SEM图；
图4为本发明实施例3制备的可注射水凝胶的SEM图；
图5为本发明实施例1至3制备的可注射凝胶的红外光谱图；
其中，图5(A)中的CD为原料β-环糊精的红外光谱，图5(A)中的ACD2，ACD3，ACD4分别为实施例1、实施例2和实施例3中制备的醛基化环糊精的红外光谱；图5(B)中的HA为实施例1的原料透明质酸的红外光谱，NHA为实施例1的氨基化透明质酸的红外光谱，GEL为实施例1的醛基化环糊精和氨基化透明质酸形成凝胶后的红外光谱图；
图6为本发明实施例1至3制备的可注射水凝胶的降解重量百分比随时间的变化图；
其中，图中NHA/ACD2为实施例1制备的可注射水凝胶的降解重量百分比随时间的变化曲线；NHA/ACD3为实施例2制备的可注射水凝胶的降解重量百分比随时间的变化曲线；NHA/ACD4为实施例3制备的可注射水凝胶的降解重量百分比随时间的变化曲线；
图7为本发明实施例1至3制备的可注射水凝胶中伏立康唑的释放百分比随时间的变化图；
其中，图中NHA/ACD2为实施例1制备的可注射水凝胶中伏立康唑的释放百分比随时间的变化曲线；NHA/ACD3为实施例2制备的可注射水凝胶中伏立康唑的释放百分比随时间的变化曲线；NHA/ACD4为实施例3制备的可注射水凝胶中伏立康唑的释放百分比随时间的变化曲线；
图8为本发明实施例1制备的可注射水凝胶的外观凝胶状态的数码照片图；
图9为采用CCK8测试实施例1至3水凝胶对人脐静脉内皮细胞的细胞毒性实验数据柱状图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明提供了一种负载非水溶性眼内药物控释的可注射水凝胶的制备方法，在本具体实施例中，所负载的非水溶性眼内药物选用伏立康唑，制备步骤如下：
(1)制备醛基化β-环糊精：
在55℃下，按β-环糊精质量与水体积4g：100mL的比值，将β-环糊精(β-CD)溶解到蒸馏水中，得到β-CD溶液，将β-CD溶液冷却至23℃，再按照高碘酸钠与β-环糊精的物质的量比为2：1，将高碘酸钠溶液加到β-CD溶液中，室温下反应2h，再加入适量乙二醇，所加入乙二醇与高碘酸钠的摩尔比为2：1，室温搅拌2h终止反应；
将得到的反应液放入透析袋(MW500)中，使用去离子水进行透析，透析6h后，取出袋中溶液，在-10℃温度下将袋中溶液冰冻20h，然后放入温度为-47℃的冷冻干燥机中冷冻干燥103h，得到白色絮状多醛基化β-环糊精；
(2)制备氨基化透明质酸：
室温下，将分子量为15万的透明质酸溶解到100mL去离子水中，按透明质酸的质量与水的体积比为0.5g：100mL的比例制得透明质酸溶液，按照盐酸乙二胺与透明质酸摩尔数之比为50:1的量将盐酸乙二胺加入到透明质酸中至溶解，按照4-二甲氨基吡啶与透明质酸的摩尔数之比为30：1的量将4-二甲氨基吡啶同步加入到透明质酸溶液中直至溶解；再根据(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙级碳二亚胺盐酸盐)与透明质酸的摩尔数之比为50:1，以及N-羟基琥珀酰亚胺与透明质酸的摩尔数之比为50:1的量同步将(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙级碳二亚胺盐酸盐)和N-羟基琥珀酰亚胺加入上述溶液中；用1mol/L的氢氧化钠溶液将上述溶液的pH调到5，反应期间要不断地添加氢氧化钠溶液，使溶液的pH值保持在5左右；反应48h，将溶液的pH调到7停止反应，得到淡黄色的透明溶液；
将上述步骤中得到的淡黄色透明溶液放入透析袋(MW8000)中，再使用去离子水进行透析72～96h，得到无色透明溶液；将无色透明溶液在温度为-10℃下冰冻20h，再放入温度为-47℃的冷冻干燥机中冷冻干燥103h，得到白色海绵状产物氨基化透明质酸；
(3)制备可注射水凝胶：
将伏立康唑和醛基化β-环糊精溶解到0.01mol/LpH值为7.3的PBS溶液中，得到含有伏立康唑和醛基化β-环糊精的PBS溶液，溶液中伏立康唑的浓度为5mg/mL，醛基化β-环糊精的浓度为30mg/mL；将氨基化透明质酸溶解到0.01mol/LpH值为7.3的PBS溶液中，得到含氨基化透明质酸的PBS溶液；溶液中氨基化透明质酸的浓度为45mg/mL；
按体积比1:1将上述含有伏立康唑和醛基化β-环糊精的PBS溶液和含有氨基化透明质酸的PBS溶液在31℃下混合，即得到负载伏立康唑的眼内药物控释可注射水凝胶。
本实施例制备得到的可注射水凝胶在PBS溶液中呈现凝胶化的状态，具体如图1所示；如图2所示为本实施例1制备的可注射水凝胶的SEM图。
如图8所示，为实施例1的凝胶化过程示意图，从图中斜放的样品可以观察到，两种前体溶液一开始是流体状态，当把两种前体溶液混合均匀，放置3min后，试剂瓶中的混合溶液呈现完全凝胶化，即使此时的样品瓶仍然斜放，内部的凝胶也不会流平，说明水凝胶已然制备成功。下述实施例2和3均具有相似的实验现象。且此凝胶制备过程中的凝胶化时间可以根据需要调整，调控范围1min～5min，可以满足医生实际注射过程中不同操作时间需求。
实施例2
本发明提供了一种负载非水溶性眼内药物控释的可注射水凝胶的制备方法，在本具体实施例中，所负载的非水溶性眼内药物选用伏立康唑，制备步骤如下：
(1)制备醛基化β-环糊精：
在50℃下，按β-环糊精质量与水体积2g：100mL的比值，将β-环糊精(β-CD)溶解到蒸馏水中，得到β-CD溶液，将β-CD溶液冷却至20℃，再按照高碘酸钠与β-环糊精的物质的量比为3：1，将高碘酸钠溶液加到β-CD溶液中，室温下反应1.5h，再加入适量乙二醇，所加入乙二醇与高碘酸钠的摩尔比为1.5：1，室温搅拌1.5h终止反应；
将得到的反应液放入透析袋(MW500)中，使用蒸馏水进行透析，透析4.0h后，取出袋中溶液，在-20℃温度下将袋中溶液冰冻18h，然后放入温度为-50℃的冷冻干燥机中冷冻干燥96h，得到白色絮状多醛基化β-环糊精；
(2)制备氨基化透明质酸：
室温下，将分子量为10万的透明质酸溶解到100mL去离子水中，按透明质酸的质量与水的体积比为0.4g：100mL的比例制得透明质酸溶液，按照盐酸乙二胺与透明质酸摩尔数之比为50:1的量将盐酸乙二胺加入到透明质酸中至溶解，按照4-二甲氨基吡啶与透明质酸的摩尔数之比为30：1的量将4-二甲氨基吡啶同步加入到透明质酸溶液中直至溶解；再根据(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙级碳二亚胺盐酸盐)与透明质酸的摩尔数之比为50:1，以及N-羟基琥珀酰亚胺与透明质酸的摩尔数之比为50:1的量同步将(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙级碳二亚胺盐酸盐)和N-羟基琥珀酰亚胺加入上述溶液中；用1mol/L的氢氧化钠溶液将上述溶液的pH调到5，反应期间要不断地添加氢氧化钠溶液，使溶液的pH值保持在5左右；反应46h，将溶液的pH调到7停止反应，得到淡黄色的透明溶液；
将上述步骤中得到的淡黄色透明溶液放入透析袋(MW8000)中，再使用蒸馏水进行透析72h，得到无色透明溶液；将无色透明溶液在温度为-20℃下冰冻18h，再放入温度为-50℃的冷冻干燥机中冷冻干燥96h，得到白色海绵状产物氨基化透明质酸；
(3)制备可注射水凝胶：
将伏立康唑和醛基化β-环糊精溶解到0.01mol/LpH值为7.2的PBS溶液中，得到含有伏立康唑和醛基化β-环糊精的PBS溶液，溶液中伏立康唑的浓度为1mg/mL，醛基化β-环糊精的浓度为10mg/mL；将氨基化透明质酸溶解到0.01mol/LpH值为7.2的PBS溶液中，得到含氨基化透明质酸的PBS溶液；溶液中氨基化透明质酸的浓度为30mg/mL；
按体积比1:1将上述含有伏立康唑和醛基化β-环糊精的PBS溶液和含有氨基化透明质酸的PBS溶液在25℃下混合，即得到负载伏立康唑的眼内药物控释可注射水凝胶。
如图3所示为本实施例2制备的可注射水凝胶的SEM图。
实施例3
本发明提供了一种负载非水溶性眼内药物控释的可注射水凝胶的制备方法，在本具体实施例中，所负载的非水溶性眼内药物选用伏立康唑，制备步骤如下：
(1)制备醛基化β-环糊精：
在60℃下，按β-环糊精质量与水体积6g：100mL的比值，将β-环糊精(β-CD)溶解到去离子水中，得到β-CD溶液，将β-CD溶液冷却至25℃，再按照高碘酸钠与β-环糊精的物质的量比为4：1，将高碘酸钠溶液加到β-CD溶液中，室温下反应2.5h，再加入适量乙二醇，所加入乙二醇与高碘酸钠的摩尔比为2.5：1，室温搅拌2.5h终止反应；
将得到的反应液放入透析袋(MW500)中，使用蒸馏水进行透析，透析8.0h后，取出袋中溶液，在0℃温度下将袋中溶液冰冻24h，然后放入温度为-45℃的冷冻干燥机中冷冻干燥110h，得到白色絮状多醛基化β-环糊精；
(2)制备氨基化透明质酸：
室温下，将分子量为20万的透明质酸溶解到100mL去离子水中，按透明质酸的质量与水的体积比为0.6g：100mL的比例制得透明质酸溶液，按照盐酸乙二胺与透明质酸摩尔数之比为50:1的量将盐酸乙二胺加入到透明质酸中至溶解，按照4-二甲氨基吡啶与透明质酸的摩尔数之比为30：1的量将4-二甲氨基吡啶同步加入到透明质酸溶液中直至溶解；再根据(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙级碳二亚胺盐酸盐)与透明质酸的摩尔数之比为50:1，以及N-羟基琥珀酰亚胺与透明质酸的摩尔数之比为50:1的量同步将(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙级碳二亚胺盐酸盐)和N-羟基琥珀酰亚胺加入上述溶液中；用1mol/L的氢氧化钠溶液将上述溶液的pH调到5，反应期间要不断地添加氢氧化钠溶液，使溶液的pH值保持在5左右；反应50h，将溶液的pH调到7停止反应，得到淡黄色的透明溶液；
将上述步骤中得到的淡黄色透明溶液放入透析袋(MW8000)中，再使用蒸馏水进行透析96h，得到无色透明溶液；将无色透明溶液在温度为0℃下冰冻24h，再放入温度为-45℃的冷冻干燥机中冷冻干燥110h，得到白色海绵状产物氨基化透明质酸；
(3)制备可注射水凝胶：
将伏立康唑和醛基化β-环糊精溶解到0.01mol/LpH值为7.4的PBS溶液中，得到含有伏立康唑和醛基化β-环糊精的PBS溶液，溶液中伏立康唑的浓度为10mg/mL，醛基化β-环糊精的浓度为50mg/mL；将氨基化透明质酸溶解到0.01mol/LpH值为7.4的PBS溶液中，得到含氨基化透明质酸的PBS溶液；溶液中氨基化透明质酸的浓度为60mg/mL；
按体积比1:1将上述含有伏立康唑和醛基化β-环糊精的PBS溶液和含有氨基化透明质酸的PBS溶液在37℃下混合，即得到负载伏立康唑的眼内药物控释可注射水凝胶。
如图4所示为本实施例3制备的可注射水凝胶的SEM图。
试验例
对上述实施例1至3制备得到的可注射水凝胶分别进行测试，得到如图5所示的红外光图，其中，图5(A)中的CD为原料β-环糊精的红外光谱，图5(A)中的ACD2，ACD3，ACD4分别为实施例1、实施例2和实施例3中制备的醛基化环糊精的红外光谱；由红外谱图可以看出，ACD2，ACD3，ACD4分别在1739cm-1，1735cm-1，1731cm-1处出现-C＝O的强特征峰，证明醛基的生成。
图5(B)中的HA为实施例1的原料透明质酸的红外光谱，NHA为实施例1的氨基化透明质酸的红外光谱，GEL为实施例1的醛基化环糊精和氨基化透明质酸形成凝胶后的红外光谱图。如图所示的氨基化透明质酸NHA的红外谱图，3286cm-1和3090cm-1处的双峰(证明是伯胺-NH2伸缩振动，分别对应其不对称和对称伸缩振动)以及1622cm-1和1588cm-1(对应于-N-H弯曲振动和-C-N伸缩振动)两个特征峰的出现可以证明伯氨基的存在。对于水凝胶GEL的红外光谱，1730cm-1处峰消失，说明醛基消失，同时-NH2在3286cm-1和3090cm-1处的双峰基本消失，而888cm-1处出现较强特征峰对应-N-H的面外弯曲振动，说明水凝胶GEL中-NH2含量降低，-N-H基团含量增加，虽然-C＝N席夫碱键的伸缩振动峰出现在1690-1620cm-1处，和1622cm-1(对应于N-H面内弯曲振动)的特征峰重叠，不易辨识，但结合图1-4，仍能充分说明NHA的-NH2和ACD的-CHO发生了席夫碱反应，成功制备了可注射水凝胶。实施例2和3同实施例1。
图6为上述三个实施例制备的可注射水凝胶的降解重量百分比随时间的变化图；其中，图中NHA/ACD2为实施例1制备的可注射水凝胶的降解重量百分比随时间的变化曲线；NHA/ACD3为实施例2制备的可注射水凝胶的降解重量百分比随时间的变化曲线；NHA/ACD4为实施例3制备的可注射水凝胶的降解重量百分比随时间的变化曲线。从图中可以看出，30天内，NHA/ACD2、NHA/ACD3、NHA/ACD4的降解率分别是28％、22.8％、19.1％。这是由于实施例中交联剂ACD醛基含量从ACD2，ACD3到ACD4逐渐增大，导致水凝胶交联密度逐渐增大，降解速率也随之逐渐减慢，可用作长效药物控释载体。由于其在体外降解速率较低，所以当此种水凝胶置于体内时，即使有透明质酸酶的存在，其药物缓控释的长效性也足以满足需求。
图7为上述3个实施例制备的可注射水凝胶中伏立康唑的释放百分比随时间的变化图；其中，图中NHA/ACD2为实施例1制备的可注射水凝胶中伏立康唑的释放百分比随时间的变化曲线；NHA/ACD3为实施例2制备的可注射水凝胶中伏立康唑的释放百分比随时间的变化曲线；NHA/ACD4为实施例3制备的可注射水凝胶中伏立康唑的释放百分比随时间的变化曲线。如图所示三种NHA/ACD凝胶30天的体外药物释放曲线整体平稳。一开始12小时内，由于凝胶快速发生溶胀，凝胶基体中的伏立康唑会以较快的速度被释放到PBS中，12小时后药物释放速率会减缓。由于ACD2的氧化程度小(醛基含量2.8mmol/g)，可用于装载伏立康唑的环糊精多，则凝胶基体中的药物就较少，所以药物释放速率和累计药物释放量比NHA/ACD3(4.3mmol/g)和NHA/ACD4(4.8mmol/g)的要小。三十天内，NHA/ACD(2,3,4)的累计药物释放率分别为36.9％，57.2％，63.2％。药物控释时间可以满足长效释药的需求，而且可以根据病情需求，调整实施例中组分之一的醛基含量的大小，可以调整水凝胶的交联度，从而调控缓控释时间和稳定性。
采用CCK8法测试实施例1-3水凝胶对人脐静脉内皮细胞的细胞毒性，如图9所示，实施例1，2，3的水凝胶的培养液浸提液放到的细胞培养基中，水凝胶的用量模拟人眼玻璃体中的用量，24小时后通过紫外测定特定波长下透光率的变化，推算细胞存活率，将其与空白对照组作比较，细胞成活率均在97％以上，这说明本发明制备的水凝胶几乎没有细胞毒性，生物相容性好。
上述说明仅为本发明的优选实施例，并非是对本发明的限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改型等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种负载非水溶性眼内药物控释的可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)50～60℃温度下，按β-环糊精的质量与水的体积比为(2～6)g：100mL的比值配制得到β-环糊精溶液，冷却至20～25℃，然后加入高碘酸钠溶液室温下反应1.5～2.5h，再加入适量乙二醇室温搅拌1.5～2.5h终止反应；得到的反应液透析4.0～8.0h后，置于-20～0℃下冰冻18～24h，然后于-50～-45℃冷冻干燥96～110h，得到多醛基化β-环糊精；
(2)室温下，按透明质酸的质量与水的体积比为(0.4～0.6)g：100mL的比值制得透明质酸溶液，然后加入一定量的盐酸乙二胺和4-二甲氨基吡啶溶解，再加入一定量(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙级碳二亚胺盐酸盐)和N-羟基琥珀酰亚胺，调节pH为5，反应46～50h，调节pH为7，停止反应；将反应得到的溶液进行透析，透析72～96h后，置于-20～0℃下冰冻18～24h，然后于-50～-45℃冷冻干燥96～110h，得到氨基化透明质酸；
(3)将非水溶性眼内药物和步骤(1)得到的多醛基化β-环糊精溶解于0.01mol/LpH值为7.2～7.4的PBS溶液中，得到含有非水溶性眼内药物和醛基化β-环糊精的PBS溶液；将步骤(2)得到的氨基化透明质酸溶解到0.01mol/LpH值为7.2～7.4的PBS溶液中，得到含有氨基化透明质酸的PBS溶液；按体积比1:1将含有非水溶性眼内药物和醛基化β-环糊精的PBS溶液和含有氨基化透明质酸的PBS溶液在25～37℃下混合，得到负载非水溶性眼内药物控释的可注射水凝胶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述非水溶性眼内药物包括伏立康唑。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，加入的高碘酸钠与β-环糊精的物质的量的比值为(2～4)：1。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，加入的乙二醇与高碘酸钠的摩尔比为(1.5～2.5)：1。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，透明质酸的分子量为10～20万。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，加入的盐酸乙二胺与透明质酸的摩尔数之比为50:1；所加入的4-二甲氨基吡啶与透明质酸的摩尔数之比为30：1。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，加入的(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙级碳二亚胺盐酸盐)与透明质酸的摩尔数之比为50:1；所加入的N-羟基琥珀酰亚胺与透明质酸的摩尔数之比为50:1。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，调节pH选用1mol/L的氢氧化钠溶液。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，含有非水溶性眼内药物和醛基化β-环糊精的PBS溶液中，非水溶性眼内药物的浓度为1mg/mL～10mg/mL，醛基化β-环糊精的浓度为10mg/mL～50mg/mL；含有氨基化透明质酸的PBS溶液中氨基化透明质酸的浓度为30mg/mL～60mg/mL。
10.权利要求1至9任一项所述的制备方法制备得到的负载非水溶性眼内药物控释的可注射水凝胶。
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