CN114058663A

CN114058663A - 一种多功能牡蛎活性多肽及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN114058663A
Application number: CN202111323232.7A
Authority: CN
Inventors: 杨发明; 王玉鑫; 胡乐; 汪皱池; 赵頔; 崔胜豪; 陈丽琦; 郭婷婷; 吴昶成; 陈景帝
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2021-11-10
Filing date: 2021-11-10
Publication date: 2022-02-18

Abstract

本发明公开了一种多功能牡蛎活性多肽及其制备方法和应用，将新鲜牡蛎全脏器清洗，沥干，高速组织捣碎匀浆，加入去离子水，调pH值为6.5‑7.5，温水浴20‑60 min后，分别加复合蛋白酶，酶解3‑6 h，酶解结束后100℃灭酶10 min，采用梯度离心后取上清液，冷藏温度条件下，通过不同截留分子量的超滤膜进行分离，得到分子量小于3000 Da的酶解液，经浓缩、冷冻干燥，得到多功能牡蛎活性多肽。本发明的多功能牡蛎活性多肽应用到软组织修复药物中，其效果明显优于现有技术的药物，具有抗氧化、促凝血及细胞增殖的功能，且组织缺损修复快，抑制疤痕形成，促缺损皮肤组织重塑再生效果优异。

Description

一种多功能牡蛎活性多肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种多功能牡蛎活性多肽及其制备方法和在软组织修复药物中的应用。

背景技术

太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）是我国南海海域主要养殖品种，肉质鲜美，营养丰富全面，素有“海洋牛奶”之称。牡蛎是第一批入选食药同源的食物，国内外学者研究发现牡蛎多肽具有抗氧化、免疫、抗肿瘤、抑菌、改善记忆、解酒护肝等功能活性，这为促进缺损皮肤组织重塑再生奠定了理论基础，但尚未有对其进行深入药用价值的相关报道。因此，充分开发利用牡蛎功能价值的研究是非常必要的。

软组织具有生物和细胞的多层结构，是保护人体免受外界伤害和病原微生物侵害的重要屏障。缺损软组织重塑再生即皮肤伤口愈合由四个连续和重叠的过程引起：止血、炎症、增殖和重塑再生。虽然皮肤是可再生的，但很少发生完美的恢复。尤其是当皮肤愈合中断时，常伴有永久性疤痕，其发病率可能会增加，从而显着降低生活质量。目前，常用的创伤修复药物主要有：基因工程细胞因子、抗菌药物、酶清创制剂、中药制剂，抗氧化剂和皮质类固醇等。

医用敷料已被广泛用于促进各种创伤类型的愈合，然而，针对皮肤外伤的天然无瘢痕制剂及创伤患者专用型临床营养品却非常缺乏，急需开发有助于伤口愈合的天然活性物质，研制方便高效的促愈产品。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种多功能牡蛎活性多肽及其制备方法和在软组织修复药物中的应用。本发明的多功能牡蛎活性多肽相比于现有技术的药物，具有抗氧化、促凝血及细胞增殖的功能，组织缺损修复快，其主要治疗作用包括止血、抗菌、抗炎、调节生长因子、促进伤口愈合和抑制瘢痕形成等活性，促软组织修复效果明显。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种多功能牡蛎活性多肽的制备方法包括以下步骤：

将新鲜牡蛎全脏器清洗，沥干，高速组织捣碎匀浆，加入去离子水，调pH值为6.5-7.5，温水浴20-60 min后，分别加 1000 U/g蛋白的复合蛋白酶，酶解3-6 h，酶解结束后，100 ℃ 灭酶10 min。采用梯度离心后取上清液，冷藏温度条件下，通过不同截留分子量的超滤膜进行分离，得到分子量小于3000 Da的酶解液，浓缩，-80 ℃ 保存24 h，冷冻干燥，得到多功能牡蛎活性多肽（即为CAPs）。

优选地，多功能牡蛎活性多肽的制备方法所述的温水浴的温度为45-65 ℃。

优选地，多功能牡蛎活性多肽的制备方法所述的复合蛋白酶为庞博动物蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶中的一种或几种。

优选地，多功能牡蛎活性多肽的制备方法所述的梯度离心的具体过程为3000 r/min转速离心5 min，然后5000 r/min转速离心5 min，最后8000r/min转速离心20 min。

优选地，多功能牡蛎活性多肽的制备方法所述的冷藏温度的温度为2-8 ℃。

本发明提供的多功能牡蛎活性多肽的制备方法，是通过温水浴的方式，使水溶性蛋白质能较全面的从细胞壁中溶出，弱化组织大分子相互作用结构，并且提前达到蛋白酶最佳作用温度，有利于对蛋白质的充分酶解。通过对酶解液采取梯度离心的方法，有利于不同颗粒的逐步离心沉淀，有利于多肽的获得，与现有技术相比，能获得具有多功能的活性多肽。

上述的多功能牡蛎活性多肽在软组织修复药物中的应用，其可制成包括粉末状、溶液状、乳状、膏状、水凝胶状、复合纤维膜状的任一种产品。

本发明多功能牡蛎活性多肽具有良好的生物学特性，与创伤周围组织的亲和性好，会使角质层水化，增加通透性并增强药物吸收，同时，小肽，微量元素和其他生物活性物质直接作用于皮肤伤口。通过缩短炎症期，促进CD31，FGF和EGF增殖，以及通过TGF-β/Smad信号通路增强了胶原蛋白的合成，并增加了其伤口中III型胶原蛋白的含量，从而缩短上皮形成时间，显著提高了伤口愈合效率并且抑制了疤痕的形成。由于多功能牡蛎活性多肽分子量低，具有消化吸收性快，可直接被肠道吸收，进入血液，达到身体各个部位。通过外源补充活性多肽后，皮肤和结缔组织中成纤维细胞、脂肪细胞及毛细血管等能够合成自身的胶原蛋白，从而形成正常的结缔组织，使受损、老化的皮肤得到填充和修复，达到延缓皮肤衰老的目的。因此，利用多功能牡蛎活性多肽制备的药物可作用于伤口的止血期、炎症期、增殖期和重塑再生期四个创伤愈合时期，可以作为抑制瘢痕形成的再生愈合活性物质用于缺损皮肤的治疗。

进一步的，所述复合纤维膜状产品为通过静电纺丝技术制得的静电纺丝复合纤维膜，所述的制备方法为：

a. 将多功能牡蛎活性多肽溶于超纯水中，使其完全溶解，以制得多功能牡蛎活性多肽溶液；

b. 将载体材料溶于溶剂中，以制得载体材料溶液；所述载体材料包括基料和辅料，所述基料与辅料的质量比为1:1-3:1；所述基料为聚乙二醇或聚醋酸乙烯酯，所述辅料为鱼皮胶原蛋白或壳聚糖；所述溶剂为二氯甲烷、三氟乙酸、氯仿中的任一种；所述载体材料溶液的浓度为7%-12%；

c. 将步骤a和步骤b所得的溶液充分涡旋混合，使其充分溶解，制得纺丝溶液；纺丝溶液中多功能牡蛎活性多肽的浓度为3-12%；

d. 使用步骤c所获得纺丝溶液，采用静电纺丝的方法，制备获得生物活性敷料；静电纺丝所用溶剂为二氯甲烷、三氟乙酸、氯仿中的任一种。

进一步的，步骤d中静电纺丝电压为10-15 kV，注射器针头与接收板之间的距离可为10-15 cm，注射泵的推进速度可为0.05-0.50 mL/min，纺丝环境温度可为35-39 ℃。

本发明中，所述鱼皮胶原蛋白可采用任一现有技术实现，例如购自上海麦克林生化科技有限公司，相关CAS号：9007-34-5，具有促进伤口修复的功能因子，可与多功能牡蛎活性多肽协同复配，在复合纤维膜中增强其创口的快速愈合、预防瘢痕形成的功效。

进一步的，所述多功能牡蛎活性多肽溶液的浓度为10-20 mg/mL。

进一步的，步骤d中静电纺丝电压为10-15 kV，注射器针头与接收板之间的距离可10-15 cm，注射泵的推进速度可为0. 05-0.50 mL/min，纺丝环境温度可为35-39 ℃。

本发明将和静电纺丝技术联合起来，辅以载体材料制备一种可以调节免疫微环境，具有抗炎作用，有利于创口的快速愈合，预防瘢痕形成，可发挥持久作用的新型生物敷料。

特别的，本发明提供一种多功能牡蛎活性多肽复合纤维膜用于创伤修复药物中的用途。

静电纺丝技术制备的纤维膜具有很高的孔隙率及良好的透气性，即可使伤口保持理想的湿润程度，又有利于细胞的呼吸作用。在静电纺丝过程中将药物成分加入纺丝液中，可以得到复合了一些药物成分的纳米纤维，当纳米纤维降解或者遇到水溶胀后，可以将药物成分缓慢释放出来，这种方式不仅可以提高药物的药效，降低了药物的毒副作用。而同轴静电纺丝技术可以在纤维表面进行功能化修饰，同时也可以将功能材料包裹于纤维内部，以起到持久发挥功效的作用。

本发明通过添加多功能牡蛎活性多肽，利用静电纺丝技术，制备获得生物活性敷料，作为创面敷料，具有较大的比表面积和孔隙结构，很好的黏附支持细胞生长，可以提供天然仿生的类细胞外基质，具有抗炎作用，保护其不被伤口微环境降解失活，促进胶原蛋白和细胞因子的合成、分泌，极大改善胶原蛋白沉积，形成有序的篮筐编织样式排列，使之具备正常真皮的特征。本发明提供的方法操作方便，可重复性强，在创伤修复药物中有巨大的应用前景。

本发明的多功能牡蛎活性多肽复合纤维膜，采用鱼皮胶原蛋白或壳聚糖作为载体，由于鱼皮胶蛋白或壳聚糖本身具有良好的功能活性，能够协效放大多功能牡蛎活性多肽复合纤维膜的抗炎作用以及促进创口快速愈合的效果，使得其在创伤修复中的功效优于单独使用多功能牡蛎活性多肽直接对伤口进行涂抹的功效。所述静电纺丝原料均可通过任一现有技术实现。

本发明相比于其它伤口愈合材料有以下优点：

（1）敷料制备方法简单易行，所制得的生物敷料伤口黏附良好，安全无毒，应用方便。

（2）具有生物活性的多功能牡蛎活性多肽敷料在隔绝创面，透气性好的同时又有止血、抗菌、保湿。

（3）同时具有抗炎作用，有利于创口的快速愈合，预防瘢痕形成。

附图说明

图1为本发明一实施例制备的CAPs抗氧化活性评价图；

图2为本发明一实施例制备的CAPs细胞增殖效果评价图；

图3为本发明一实施例制备的CAPs对小鼠创面的影响图；

图4为本发明一实施例制备的CAPs对创伤皮肤组织的H&E染色图；

图5为本发明一实施例制备的CAPs对创伤皮肤组织的免疫组化图；

图6为本发明一实施例制备的CAPs对创伤皮肤组织的天狼星红苦味酸染色图；

图7为本发明另一实施例制备的CAPs对创伤皮肤组织的H&E染色图；

图8为本发明另一实施例制备的CAPs对创伤皮肤组织的天狼星红苦味酸染色图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种多功能牡蛎活性多肽的制备方法包括以下步骤：

将新鲜牡蛎全脏器清洗，沥干，高速组织捣碎匀浆，加入去离子水，调pH值为6.5，温水浴40 min后，分别加 1000 U/g蛋白的复合蛋白酶，酶解5 h，酶解结束后，100 ℃ 灭酶10 min。采用梯度离心后取上清液，冷藏温度条件下，通过不同截留分子量的超滤膜进行分离，得到分子量小于3000 Da的酶解液，浓缩，-80 ℃ 保存24 h，冷冻干燥，得到多功能牡蛎活性多肽（即为CAPs）。

本实施例中，多功能双用途牡蛎活性多肽的制备方法所述的温水浴的温度为45℃。

本实施例中，多功能双用途牡蛎活性多肽的制备方法所述的复合蛋白酶为庞博动物蛋白酶。

本实施例中，多功能双用途牡蛎活性多肽的制备方法所述的梯度离心的具体过程为3000 r/min转速离心5 min，然后5000 r/min转速离心5 min，最后8000 r/min转速离心20 min。

优本实施例中，多功能双用途牡蛎活性多肽的制备方法所述的冷藏温度的温度为2-8 ℃。

应用于软组织修复药物中的性能表征：

（1）体外多功能活性验证体系，所述验证体系为抗氧化活性、血浆再钙化凝结时间、细胞增殖效果；

（2）建立小鼠软组织缺损模型；

（3）对缺损模型的小鼠进行多用途给药；

（4）对软组织重塑再生效果进行功效评价，所述功效评价包括一级功效评价和二级功效评价；所述一级功效评价包括止血活性评价、抗菌活性评价的的任一种或两种；所述二级功效评价为缺损软组织重塑再生评价，所述缺损软组织重塑再生评价包括伤口愈合率测定、掉痂时间测定、炎症因子测定、上皮化、胶原蛋白生成分析中的任一种或几种的组合。

步骤（1）中，抗氧化活性测定方法为ABTS 自由基清除率、DPPH 自由基清除率、还原力的测定的任一种或两种。

步骤（1）中，血浆再钙化凝结时间测定方法为以柠檬酸钠为抗凝剂的新鲜兔血以1000 rpm离心10分钟，并分离血浆以进一步使用。向每个试管中添加血浆（0.1 mL），然后以0.1 mg / mL的浓度添加0.1 mL CAPs，以2% 柠檬酸溶液作为阴性对照组，并以云南白药（1mg / mL）作为阳性对照组，并在37 ℃ 水浴中孵育1分钟。然后，添加0.1 mL的0.025 mol /L的氯化钙溶液，并置于37 ℃ 的水浴中。同时，启动了秒表，并每15秒钟缓慢倾斜试管一次，直到出现白色颗粒状纤维蛋白，记录重新钙化所花费的时间。每个样品重复实验五次，取平均值。

步骤（1）中，细胞增殖效果测定方法为采用25 cm²的细胞培养瓶培养角质形成细胞（HaCaT）和成纤维细胞（HSF）。完全培养基配置：90% DMEM、10% 胎牛血清和 1% 双抗。向培养瓶中加入吹打用完全培养基混匀的细胞混悬液5 mL，于 37℃、5 % CO₂饱和湿度的培养箱中培养，当细胞密度达到 80%-90% 时，进行消化和传代。将培养好的 HaCaT 角质形成细胞和 HSF 成纤维细胞稀释成 2×10⁵个/mL，每孔100 μL 加入 96 孔板，于 5% CO₂、37℃ 饱和湿度培养 4 h，至细胞完全贴壁后，取用 PBS 梯度配置 1 000 μg·mL^-1、500 μg·mL^-1、250 μg·mL^-1、125 μg·mL^-1、62.5 μg·mL^-1的 < 3 K Da超滤组分分离纯化的组分，将样品过 0.22 μm 滤膜后，各 10 μL 加入贴壁的细胞中。培养 24 h 后加入 100 μL 培养基稀释好的 CCK8 进行反应 1 h 然后在 450 nm 测 OD 值。

步骤（2）中，小鼠软组织缺损模型方法为：采用4周龄雄性小鼠按动物保健和处理程序进行饲养，腹腔注射350 mg/kg水合氯醛麻醉，背部皮肤脱毛消毒后，用直径0.8 cm打孔器在鼠背部打一个圆孔，切取全层皮肤，深至筋膜，每只动物分笼饲养。

步骤（3）中，双用途给药的方式为：取多功能牡蛎活性多肽20-25 mg总氮含量/mL水（膏状）涂抹伤口，涂满为止，每天涂抹给药一次，采用无菌生理盐水为阴性对照组（即为BC），连续给药14天；阳性对照组（即为PC）采用同样方法。通过外用方式对缺损软组织涂抹多功能牡蛎活性多肽，由于多功能牡蛎活性多肽具有良好的生物学特性，与创伤周围组织的亲和性好，会使角质层水化，增加通透性并增强药物吸收，同时，小肽，微量元素和其他生物活性物质直接作用于皮肤伤口。通过缩短炎症期，促进CD31，FGF和EGF增殖，以及通过TGF-β/Smad信号通路增强了胶原蛋白的合成，并增加了其伤口中III型胶原蛋白的含量，从而缩短上皮形成时间，显著提高了伤口愈合效率并且抑制了疤痕的形成。

步骤（3）中，双用途给药的方式为：按照0.5-2 g/kg·bw的给药量，采用多功能牡蛎活性多肽对小鼠进行灌胃，每天灌胃给药一次，灌胃量为0.1 mL/10g·bw，采用无菌生理盐水为阴性对照组，连续给药14天。通过内服方式为人体提供多功能牡蛎活性多肽，由于多功能牡蛎活性多肽分子量低，具有消化吸收性快，可直接被肠道吸收，进入血液，达到身体各个部位。通过外源补充胶原蛋白多肽后，皮肤和结缔组织中成纤维细胞、脂肪细胞及毛细血管等能够合成自身的胶原蛋白，从而形成正常的结缔组织，使受损、老化的皮肤得到填充和修复。

步骤（4）中，止血活性评价的方法为：采用断尾法，每组5只雄性KM小鼠，在距尾尖0.5 cm处剪除，用已称量的无菌滤纸吸取出血量并开始用秒表计时，每30秒换一张滤纸，不出血后进行称重和记录出血时间，取平均值。

步骤（4）中，抗菌活性评价的方法为：选用与感染相关的菌种，将活化好的菌液用无菌生理盐水稀释，在96孔板中加入50 μL生理盐水为空白对照、加入50 μL，25-55 mg/mL样品，样品浓度以总氮含量计，加入50 μL TSB培养基和50uL稀释后的菌液，混匀，在550 nm波长，记录为0 h的OD值，37 ℃ 培养，分别测定8 h和24 h的OD值，分别计算抑菌率。

具体的，所述抗菌活性评价的方法为：将大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、海藻希瓦氏菌、李斯特氏菌、铜绿假单胞菌、泥鳅嗜水汽菌、无乳链球菌等种于3% TSB液体培养基中进行活化，将溶藻弧菌、副溶血性弧菌利用3% TSB-3% NaCl₂培养基活化。将活化好的菌液用无菌生理盐水稀释至OD 550值为0.1，在96孔板中加入50uL生理盐水为空白对照、加入50 μL，20-70 mg/mL样品（以总氮算）为样品组，各组均加入50 μL TSB培养基和50uL稀释后的菌液，混匀，550 nm测定吸光度，记录为0 h OD值，然后放入37℃培养箱中培养8 h测定一次OD值，24 h测定一次OD值。分别计算抑菌率，公式如下(1)所示：

抑菌率（%）=（空白OD-样品OD）/空白OD*100 （1）。

步骤（4）中，所述伤口愈合率测定和掉痂时间测定的方法为：所述步骤（2）中涂抹给药后，从第0天开始，每2天在同一固定高度拍照记录伤口创面情况，用软件计算伤口愈合率、记录掉痂时间；伤口愈合率测定的公式（2）为：

Wound healing rate = (D0-Dn)/D0×100% (2)，

式中：D0为初始伤口形状的直径；Dn为未愈合的伤口形状的直径，单位为cm。

步骤（4）中，所述炎症因子浸润测定和上皮化分析测定中涉及的因子包括H&E染色、免疫组化（FGF、EGF、CD31）中的任两种或以上。

步骤（4）中，炎症细胞浸润、上皮化分析测定采用H&E、免疫组化切片染色。具体方法为：处死小鼠后，取皮肤组织进行组织学分析。将样品在4 ℃ 的4% 多聚甲醛中固定24小时，然后通过浸入70-100% 的乙醇溶液中进行脱水。根据染色步骤，分别用H&E和免疫组化染色试剂对小鼠的皮肤组织进行染色，并使用显微镜进行组织病理学分析，并使用Image-pro plus 6.0软件对每张照片进行分析，以获得正的累积光密度。

步骤（4）中，胶原蛋白生成分析采用天狼星红苦味酸染色分析。具体为：将制备的切片进行常规脱蜡，然后用天狼星红苦味酸染色液染色8-10分钟。用自来水除去载玻片表面的残留污渍，然后将切片用无水乙醇脱水并用中性胶密封。通过偏光显微镜（放大倍数：200）观察用天狼星红苦味酸溶液染色的样品，并使用Image-Pro plus 6.0对肉芽组织中的胶原蛋白（I型和III型）进行定量分析。

本实施例中，阳性对照组可选用现有技术中创伤修复功效明显的云南白药（涂抹）及功能营初元Ⅰ型产品（口服）。所述云南白药为现有技术由云南白药集团股份有限公司生产的云南白药粉剂，国药准字Z53020798；所述初元Ⅰ型产品为现有技术江中药业股份有限公司生产的初元复合肽营养饮品Ⅰ型，食品生产许可证编号：SC10636010711337。

本发明多功能牡蛎活性多肽具有良好的生物学特性，与创伤周围组织的亲和性好，会使角质层水化，增加通透性并增强药物吸收，同时，小肽，微量元素和其他生物活性物质直接作用于皮肤伤口。通过缩短炎症期，促进CD31，FGF和EGF增殖，以及通过TGF-β/Smad信号通路增强了胶原蛋白的合成，并增加了其伤口中III型胶原蛋白的含量，从而缩短上皮形成时间，显著提高了伤口愈合效率并且抑制了疤痕的形成。由于多功能牡蛎活性多肽分子量低，具有消化吸收性快，可直接被肠道吸收，进入血液，达到身体各个部位。通过外源补充活性多肽后，皮肤和结缔组织中成纤维细胞、脂肪细胞及毛细血管等能够合成自身的胶原蛋白，从而形成正常的结缔组织，使受损、老化的皮肤得到填充和修复，达到延缓皮肤衰老的目的。因此，多功能牡蛎活性多肽可作用于伤口的止血期、炎症期、增殖期和重塑再生期四个创伤愈合时期，可以作为抑制瘢痕形成的再生愈合活性物质用于缺损皮肤的治疗。

本实施例提供的多功能牡蛎活性多肽在软组织创伤药物的新用途，其效果明显优于现有技术的药物，具有抗氧化、促凝血及细胞增殖的功能，组织缺损修复快，且抑制疤痕形成，促缺损皮肤组织重塑再生效果更明显。

实施例2

一种多功能牡蛎活性多肽的制备方法包括以下步骤：

将新鲜牡蛎全脏器清洗，沥干，高速组织捣碎匀浆，加入去离子水，调pH值为7.5，温水浴20 min后，分别加 1000 U/g蛋白的复合蛋白酶，酶解3 h，酶解结束后，100 ℃ 灭酶10 min。采用梯度离心后取上清液，冷藏温度条件下，通过不同截留分子量的超滤膜进行分离，得到分子量小于3000 Da的酶解液，浓缩，-80 ℃ 保存24 h，冷冻干燥，得到多功能牡蛎活性多肽（即为CAPs）。

本实施例中，多功能双用途牡蛎活性多肽的制备方法所述的温水浴的温度为65℃。

本实施例中，多功能双用途牡蛎活性多肽的制备方法所述的复合蛋白酶为庞博中性蛋白酶。

本实施例中，多功能双用途牡蛎活性多肽的制备方法所述的梯度离心的具体过程为3000 r/min转速离心5 min，然后5000 r/min转速离心5 min，最后8000r/min转速离心20min。

本实施例中，多功能双用途牡蛎活性多肽的制备方法所述的冷藏温度的温度为2-8 ℃。

实施例3

一种多功能牡蛎活性多肽的制备方法包括以下步骤：

将新鲜牡蛎全脏器清洗，沥干，高速组织捣碎匀浆，加入去离子水，调pH值为7.0，温水浴20 min后，分别加 1000 U/g蛋白的复合蛋白酶，酶解6 h，酶解结束后，100 ℃ 灭酶10 min。采用梯度离心后取上清液，冷藏温度条件下，通过不同截留分子量的超滤膜进行分离，得到分子量小于3000 Da的酶解液，浓缩，-80 ℃ 保存24 h，冷冻干燥，得到多功能牡蛎活性多肽（即为CAPs）。

本实施例中，多功能双用途牡蛎活性多肽的制备方法所述的温水浴的温度为55℃。

本实施例中，多功能双用途牡蛎活性多肽的制备方法所述的复合蛋白酶为庞博胰蛋白酶。

实施例4

一种多功能牡蛎活性多肽的制备方法包括以下步骤：

将新鲜牡蛎全脏器清洗，沥干，高速组织捣碎匀浆，加入去离子水，调pH值为7.0，温水浴40 min后，分别加 1000 U/g蛋白的复合蛋白酶，酶解5 h，酶解结束后，100 ℃ 灭酶10 min。采用梯度离心后取上清液，冷藏温度条件下，通过不同截留分子量的超滤膜进行分离，得到分子量小于3000 Da的酶解液，浓缩，-80 ℃ 保存24 h，冷冻干燥，得到多功能牡蛎活性多肽（即为CAPs）。

实施例5

一种多功能牡蛎活性多肽的制备方法包括以下步骤：

实施例6

一种多功能牡蛎活性多肽的制备方法包括以下步骤：

将新鲜牡蛎全脏器清洗，沥干，高速组织捣碎匀浆，加入去离子水，调pH值为6.5，温水浴60 min后，分别加 1000 U/g蛋白的复合蛋白酶，酶解6 h，酶解结束后，100 ℃ 灭酶10 min。采用梯度离心后取上清液，冷藏温度条件下，通过不同截留分子量的超滤膜进行分离，得到分子量小于3000 Da的酶解液，浓缩，-80 ℃ 保存24 h，冷冻干燥，得到多功能牡蛎活性多肽（即为CAPs）。

实施例7

本实施例中，将实施例1制备的牡蛎活性肽可制成复合纤维膜状产品。所述复合纤维膜状产品为通过静电纺丝技术制得的静电纺丝复合纤维膜，所述的制备方法为：

a. 将牡蛎活性肽溶于超纯水中，采用超声等现有技术使其完全溶解，以制得牡蛎活性肽溶液；

b. 将载体材料溶于溶剂中，以制得载体材料溶液；所述载体材料包括基料和辅料，所述基料与辅料的质量比为1:1；所述基料为聚乙二醇，所述辅料为鱼皮胶原蛋白；所述溶剂为二氯甲烷中；所述载体材料溶液的浓度为7%；

c. 将步骤a和步骤b所得的溶液充分涡旋混合，使其充分溶解，制得纺丝溶液；纺丝溶液中牡蛎活性肽的浓度为9%；

d. 使用步骤c所获得纺丝溶液，采用静电纺丝的方法，制备获得生物活性敷料；静电纺丝所用溶剂为二氯甲烷。

本实施例中，所述鱼皮胶原蛋白可采用任一现有技术实现，例如购自上海麦克林生化科技有限公司，相关CAS号：9007-34-5，具有促进伤口修复的功能因子，可与多功能牡蛎活性多肽协效复配，在复合纤维膜中增强其创口的快速愈合、预防瘢痕形成的功效。

本实施例中，所述牡蛎活性肽溶液的浓度为15 mg/mL。

本实施例中，步骤d中静电纺丝电压为12 kV，注射器针头与接收板之间的距离可为12 cm，注射泵的推进速度可为0.4 mL/min，纺丝环境温度可为37 ℃。

本实施例将和静电纺丝技术联合起来，辅以载体材料制备一种可以调节免疫微环境，具有抗炎作用，有利于创口的快速愈合，预防瘢痕形成，可发挥持久作用的新型生物敷料。

特别的，本实施例提供一种牡蛎活性肽复合纤维膜用于创伤修复药物中的用途。

本实施例敷料制备方法简单易行，所制得的生物敷料伤口黏附良好，安全无毒，应用方便。具有生物活性的牡蛎活性肽敷料在隔绝创面，透气性好的同时又有止血、抗菌、保湿，同时具有抗炎作用，有利于创口的快速愈合，预防瘢痕形成。

实施例8

b. 将载体材料溶于溶剂中，以制得载体材料溶液；所述载体材料包括基料和辅料，所述基料与辅料的质量比为2:1；所述基料为聚乙二醇，所述辅料为壳聚糖；所述溶剂为三氟乙酸中；所述载体材料溶液的浓度为9%；

c. 将步骤a和步骤b所得的溶液充分涡旋混合，使其充分溶解，制得纺丝溶液；纺丝溶液中牡蛎活性肽的浓度为10%；

d. 使用步骤c所获得纺丝溶液，采用静电纺丝的方法，制备获得生物活性敷料；静电纺丝所用溶剂为三氟乙酸。

本实施例中，所述牡蛎活性肽溶液的浓度为20 mg/mL。

本实施例中，步骤d中静电纺丝电压为14 kV，注射器针头与接收板之间的距离可为11 cm，注射泵的推进速度可为0.1 mL/min，纺丝环境温度可为38 ℃。

实施例9

b. 将载体材料溶于溶剂中，以制得载体材料溶液；所述载体材料包括基料和辅料，所述基料与辅料的质量比为3:1；所述基料为聚醋酸乙烯酯，所述辅料为鱼皮胶原蛋白；所述溶剂为氯仿中；所述载体材料溶液的浓度为6%；

c. 将步骤a和步骤b所得的溶液充分涡旋混合，使其充分溶解，制得纺丝溶液；纺丝溶液中牡蛎活性肽的浓度为5%；

d. 使用步骤c所获得纺丝溶液，采用静电纺丝的方法，制备获得生物活性敷料；静电纺丝所用溶剂为氯仿。

本实施例中所述牡蛎活性肽溶液的浓度为10 mg/mL。

本实施例中步骤d中静电纺丝电压为15 kV，注射器针头与接收板之间的距离可为14 cm，注射泵的推进速度可为0.4 mL/min，纺丝环境温度可为38 ℃。

表1. CAPs特征肽段分析

由表1可知，所获得的CAPs特征肽段分子量集中在1162-2296 Da，以亮氨酸为开头，赖氨酸为结尾；特征肽段：谷氨酸-亮氨酸、谷氨酸-甘氨酸，相关研究表明，特征片段与抗氧化活性密切相关。

图1是实施例1制备的制CAPs抗氧化活性评价图，从图中可以看出制备的CAPs随浓度的增加，其总抗氧化能力递增。

图2是实施例1制备的CAPs细胞增殖效果评价图，从图中可以看出制备的CAPs在24h时，具有显著促进皮肤表皮细胞的增殖的作用，其中浓度为6.25 μg/mL效果最好。

图5是实施例1制备的CAPs对创伤皮肤组织的免疫组化图，从图中可以看出制备的CAPs涂抹、灌胃两种给药方式具有通过促进成纤维细胞增殖、血管再生，从而加快小鼠皮肤伤口愈合的作用。

图6是实施例1制备的CAPs对创伤皮肤组织的天狼星红苦味酸染色图，从图中可以看出制备的CAPs涂抹、灌胃两种给药方式具有通过促进胶原蛋白分泌，调节Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白比例，从而抑制瘢痕增生的作用。

图7是实施例7-9对创伤皮肤组织的H&E染色图，从图中可以看具有通过抑制炎症细胞浸润、促进肉芽组织再生、缩短上皮化进程，从而加快小鼠皮肤伤口愈合的效果。

图8是实施例7-9对创伤皮肤组织的天狼星红苦味酸染色图，从图中可以看出具有通过促进胶原蛋白分泌，调节Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白比例，从而抑制瘢痕增生的作用。

将实施例7-9制备的复合纤维膜生物敷料，取少量目标纤维，在其表面喷金，于扫描电镜下观察纤维形貌。结果显示，携载牡蛎活性肽的复合纤维膜材料，电纺纤维较为光滑，排列不规则，也没有明显的液滴形成，最后形成的纤维膜类物质是呈现多孔状。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。需注意的是，本发明中所未详细描述的技术特征，均可以通过任一现有技术实现。

Claims

1.一种多功能牡蛎活性多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将新鲜牡蛎全脏器清洗，沥干，高速组织捣碎匀浆，加入去离子水，调pH值为6.5-7.5，温水浴20-60 min后，分别加 1000 U/g蛋白的复合蛋白酶，酶解3-6 h，酶解结束后，100 ℃ 灭酶10 min；

（2）采用梯度离心后取上清液，冷藏温度条件下，通过不同截留分子量的超滤膜进行分离，得到分子量小于3000 Da的酶解液，浓缩，-80 ℃ 保存24 h，冷冻干燥，得到多功能牡蛎活性多肽。

2.根据权利要求1所述的多功能牡蛎活性多肽的制备方法，其特征在于，所述的温水浴的温度为45-65 ℃。

3.根据权利要求1所述的多功能牡蛎活性多肽的制备方法，其特征在于，所述的复合蛋白酶为庞博动物蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的多功能牡蛎活性多肽的制备方法，其特征在于，所述的梯度离心的具体过程为3000 r/min转速离心5 min，然后5000 r/min转速离心5 min，最后8000 r/min转速离心20 min。

5.根据权利要求1所述的多功能牡蛎活性多肽的制备方法，其特征在于，所述的冷藏温度的温度为2-8 ℃。

6.一种由权利要求1-5任一项所述的制备方法制得的多功能牡蛎活性多肽。

7.一种如权利要求6所述的多功能牡蛎活性多肽在软组织修复药物中的应用，其特征在于，将多功能牡蛎活性多肽制成包括粉末状、溶液状、乳状、膏状、水凝胶状、复合纤维膜状的任一种药物。

8.根据权利要求7所述的多功能牡蛎活性多肽在软组织修复药物中的应用，其特征在于，所述复合纤维膜状药物为通过静电纺丝技术制得的静电纺丝复合纤维膜，其制备方法为：

b. 将载体材料溶于溶剂中，以制得载体材料溶液；所述载体材料包括基料和辅料，所述基料与辅料的质量比为1:1-3:1；所述基料为聚乙二醇或聚醋酸乙烯酯，所述辅料为鱼皮胶原蛋白或壳聚糖；所述溶剂为二氯甲烷、三氟乙酸、氯仿中的任一种；所述载体材料溶液的浓度为7%-12wt%；

c. 将步骤a和步骤b所得的溶液充分涡旋混合，使其充分溶解，制得纺丝溶液；纺丝溶液中多功能牡蛎活性多肽的浓度为3-12wt%；

d. 使用步骤c所获得纺丝溶液，采用静电纺丝的方法，制备获得静电纺丝复合纤维膜；静电纺丝所用溶剂为二氯甲烷、三氟乙酸、氯仿中的任一种。

9.根据权利要求8所述的多功能牡蛎活性多肽在软组织修复药物中的应用，其特征在于，步骤d中静电纺丝电压为10-15 kV，注射器针头与接收板之间的距离可为10-15 cm，注射泵的推进速度可为0.05-0.50 mL/min，纺丝环境温度可为35-39 ℃。