CN103555799A - 一种免疫活性肽冻干粉及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明的一种免疫活性肽冻干粉及其制备方法，属于农产品精深加工及其副产物综合利用的技术领域，涉及一种免疫活性肽冻干粉及其制备方法。实现了以水分含量为1.0%～5.0%、蛋白质含量为40%～70%的玉米蛋白粉、小麦蛋白粉、大米蛋白粉、大豆蛋白粉、绿豆蛋白粉和禽蛋蛋清粉中的任意一种为原料，设计原料超微粉碎、蛋白溶液调配和均质化、高压脉冲电场环境下可控酶解、低温灭酶、低温离心、低温膜分离、真空冷冻干燥的工艺路线，获得水分含量为1.2%～1.8%、蛋白质含量为72%～86%、分子量为10～30kDa的免疫活性肽冻干粉。经免疫活性评价实验证明，与对照组相比，受试组小鼠的脾淋巴细胞增殖能力显著提高。

Description

一种免疫活性肽冻干粉及其制备方法

技术领域

本发明属于农产品精深加工及其副产物综合利用的技术领域，涉及一种免疫活性肽冻干粉及其制备方法，能够实现利用高压脉冲电场技术，在常温条件下，获得一种水分含量为1.2%～1.8%、蛋白质含量为72%～86%、分子量为10～30kDa的免疫活性肽冻干粉，经免疫活性评价实验证明，与对照组相比，受试组小鼠的脾淋巴细胞增殖能力显著提高10%～20%（P<0.01）。

背景技术

近年来，随着人们对各种免疫机理及调控途径的理解不断深入，免疫活性肽日趋成为生物活性肽领域的研究热点，其开发应用与深入研究具有重要意义。免疫活性肽是具备增强免疫功能和免疫刺激功能的一类生物活性肽，能够促进机体细胞移动，促进细胞吞噬功能，并起到抗肿瘤和抗菌作用。免疫活性肽包括内源肽和外源肽，当内源肽不足以提供机体免疫功能时，就需要有外源肽作为补充。据文献报道，研究者们已从牛乳、人乳和植物蛋白中获得了不同序列的免疫活性肽达三十余种，其中牛乳源活性肽是目前研究最多、最深入的免疫活性肽。国内对免疫活性肽的研究主要集中于天然肽的分离、纯化方面，而且对基因组合肽库和化学组合肽库的构建、筛选及应用已经开始起步。我国是农作物生产和消费大国，每年的玉米、大豆、小麦等农作物产量居世界前列，所以，研究开发从植物蛋白酶解物中获得免疫活性肽正日益引起重视。随着研究手段和方法的不断提高，免疫活性肽将更广泛地应用于婴幼儿食品、功能性食品和保健药品中，将对食品工业和畜牧产业的发展影响深远。

目前免疫活性肽的制备方法通常为热环境下的酶解法，其不易保持肽的活性稳定，而有关非热加工技术在免疫活性肽方面的研究尚未见报道。常见的酶解工艺需要借助高温使蛋白质变性和灭酶，整个酶解过程也在50—60℃的水浴条件下进行，虽然制备的活性肽水解度较好，肽得率高，但是活性不易稳定保持。在前期研究中，我们均采用热环境下的酶解技术制备获得玉米肽、大豆肽、小麦肽和禽蛋蛋清肽等生物活性肽，但因其制备方法繁复，条件温度高而常易出现产品的活性变质、功能性降低、异味生成等不良影响。为提高并保持肽的活性，需要结合实际操作，寻求非热或低温的技术方法。所以，本发明旨在利用高压脉冲电场（PEF）这一新兴非热加工技术来制备免疫活性肽冻干粉，以达到工艺流程时间缩短、能耗降低、产品性质稳定等目标。

非热加工技术是目前食品工业的开发热点，其中高压脉冲电场技术因具有较好的可行性、高效性和环保性，在食品和农畜产品加工中的应用前景广阔，而将其应用于酶解工艺实为首例。PEF是近年来研究最多的非热加工技术之一，相比热处理的作用特点，PEF的处理时间短，可以在几百或几十微秒内完成全部电能的释放，良好适应工业化生产；PEF通常选取室温或者低温的条件进行，对食品质量属性来说，能够减少食品感官和物理特性的有害变化；PEF的能耗低、效率高，能够减少在工业生产中的能源和资金消耗，环保优势较高。一些研究证实，PEF可以改变某些蛋白质的二级结构，作用结果为疏水基团和巯基的外露，引起蛋白的起泡性和乳化性的提高。另外，我们在前期研究中发现，PEF技术对部分多肽的活性有快速激活或抑制作用。然而，研究者对通过PEF来提高酶解效率，增强肽产品的功能性方面尚未探究。因此，本发明是在大量实验研究的基础上，利用高压脉冲电场的非热加工特性进行蛋白质的快速酶解，来制备一种免疫活性肽冻干粉。

免疫活性肽的功能评价方法有很多，淋巴细胞增殖和分化是机体免疫应答过程中的重要阶段，检测淋巴细胞增殖水平是细胞免疫研究的一种常用方法。根据《保健食品检验与评价技术规范实施手册》的功能学检验方法中所规定的增强免疫力功能检验方法，采用刀豆蛋白A（ConA）诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验的MTT法。实验原理为，体内T淋巴细胞受ConA刺激后出现母细胞的增殖反应，活细胞特别是增殖细胞中的线粒体水解酶可将MTh分解为兰紫色结晶，通过检测其光密度值能反映脾淋巴细胞的增殖情况，增殖情况越明显即受试小鼠的免疫功能越强。

发明内容

本专利需要解决的技术问题：

要求以水分含量为1.0～5.0%、蛋白质含量为40～70%的玉米蛋白粉、小麦蛋白粉、大米蛋白粉、大豆蛋白粉、绿豆蛋白粉和禽蛋蛋清粉中的任意一种为原料，利用高压脉冲电场技术，获得水分含量为1.2%～1.8%、蛋白质含量为72%～86%、分子量为10～30kDa的免疫活性肽冻干粉。设计原料超微粉碎、蛋白溶液调配和均质化、高压脉冲电场环境下可控酶解、低温灭酶、低温离心、低温膜分离、真空冷冻干燥的工艺路线，以小鼠脾淋巴细胞转化实验为检验方法，优选高压脉冲电场可控酶解技术的最佳工艺参数，实现了受试小鼠的实验组相比对照组，实验结果优势显著性提高10%～20%（P<0.01）。

本发明的技术方案：

1.一种免疫活性肽冻干粉及其制备方法，其特征在于，是以水分含量为1.0%～5.0%、蛋白质含量在40%～70%的玉米蛋白粉、小麦蛋白粉、大米蛋白粉、大豆蛋白粉、绿豆蛋白粉或禽蛋蛋清粉中的任意一种为原料，经过原料超微粉碎、蛋白溶液调配和均质化、高压脉冲电场环境下可控酶解、低温灭酶、低温离心、低温膜分离、真空冷冻干燥过程，制备出水分含量为1.2%～1.8%、蛋白质含量为72%～86%、分子量为10～30kDa的免疫活性肽冻干粉，经免疫活性评价实验证明，与对照组相比，受试组小鼠的脾淋巴细胞增殖能力显著提高10%～20%（P<0.01）；

1）所述的原料超微粉碎过程，是将水分含量为1.0%～5.0%、蛋白质含量40%～70%的玉米蛋白粉、小麦蛋白粉、大米蛋白粉、大豆蛋白粉、绿豆蛋白粉或禽蛋蛋清粉中的任意一种为原料进行超微粉碎至颗粒细度为300～400目，获得蛋白超微粉密封备用；

2）所述的蛋白溶液调配和均质化，是选择纯净水、去离子水、渗透水和蒸馏水中的任意一种，将300～400目的蛋白超微粉调至底物蛋白浓度为1%～10%（W/W）的蛋白溶液；利用高速分散均质机对蛋白溶液进行均质化处理，调控转速为1000～4000r/min，处理时间为5～30min，获得均质化蛋白溶液；

3）所述的高压脉冲电场环境下可控酶解，是在环境温度为15～25℃的条件下，将长度为1～3mm、半径为0.5～1mm的双电极安装于高压脉冲电场装置上，依次选用75%的乙醇、蒸馏水分别清洗装置内物料循环管路2～3次，设定装置电场强度为5～50kV/cm，电场频率为500～3000Hz的工作状态下，待机；再用1M NaOH溶液将均质化蛋白溶液调节pH值为6～11，按[E]/[S]为2%～12%（W/W）加入碱性蛋白酶，要求酶活范围为50万～150万u/g，用1M NaOH溶液控制均质化蛋白溶液的pH值变化在±0.05内；开启恒流泵，使高压脉冲电场装置管路中充满均质化蛋白溶液后，再调节恒流泵工作状态，使均质化蛋白溶液在高压脉冲电场装置内的恒定流速为1～10mL/min后，开启恒流泵和高压脉冲电场装置，循环处理2～5次，得到酶反应液；

4）所述的低温灭酶，是将高压脉冲电场环境下可控酶解处理后的酶反应液迅速置于冰浴条件下的反应瓶中，控制酶反应液的温度为2～8℃，冰浴时间为5～35min，获得酶解液；

5）所述的低温离心过程，是将酶解液进行低温离心，离心温度为4℃、转速为6000～12000×g、离心时间为5～30min，收集酶解上清液备用；

6）所述的低温膜分离过程，是在环境温度为15～20℃的条件下，将酶解上清液进行低温膜分离处理，先用NaOH和蒸馏水分别对截流量为30kDa和10kDa的超滤膜进行清洗，控制NaOH浓度为0.01～0.15M、NaOH温度为10～30℃、NaOH清洗时间为1～2h，控制蒸馏水的温度为10～30℃、清洗时间为1～3h，控制NaOH和蒸馏水的膜面流速均为2.0～4.5mL/min，压力均为5～30pis；再依次选用截流量为30kDa和10kDa的超滤膜进行膜分离，控制酶解上清液的温度为2～10℃、膜面流速为2.0～4.5mL/min、压力为5～30pis，最后收集分子量为10～30kDa的酶解组分分离液备用；

7）所述的真空冷冻干燥过程，是将低温膜分离后的酶解组分分离液转移到冷冻盘中进行预冻，控制液面厚度在5～10mm，预冻温度为-30～-15℃，预冻时间为2～6h，然后再置于真空冷冻干燥机冷冻仓内，控制真空度小于10Pa，真空冷冻干燥时间为9～15h，即可获得水分含量为1.2%～1.8%，蛋白质含量为72%～86%、分子量为10～30kDa的免疫活性肽冻干粉。

2.一种免疫活性肽冻干粉及其制备方法，其特征在于，免疫活性肽冻干粉的水分含量为1.2%～1.8%、蛋白质含量为72%～86%、分子量为10～30kDa；经免疫活性评价实验证明，与对照组相比，受试组小鼠的脾淋巴细胞增殖能力显著提高10%～20%（P<0.01）。

3.根据权利要求1所述的一种免疫活性肽冻干粉及其制备方法，其特征在于，是以水分含量为1.0%～5.0%、蛋白质含量在40%～70%的玉米蛋白粉、小麦蛋白粉、大米蛋白粉、大豆蛋白粉、绿豆蛋白粉和禽蛋蛋清粉中的任意一种为原料。

4.根据权利要求1所述的一种免疫活性肽冻干粉及其制备方法，其特征在于，在蛋白溶液调配和均质化过程时，选择纯净水、去离子水、渗透水和蒸馏水中的任意一种。

5.根据权利要求1所述的一种免疫活性肽冻干粉及其制备方法，其特征在于，在高压脉冲电场环境下可控酶解过程时，用蒸馏水清洗高压脉冲电场装置内物料循环管路2～3次中的蒸馏水，选用去离子水、纯净水、渗透水、蒸馏水中的任意一种。

6.根据权利要求1所述的一种免疫活性肽冻干粉及其制备方法，其特征在于，在高压脉冲电场环境下可控酶解过程时，选用碱性蛋白液体酶或固体酶，要求酶活范围为60万～120万u/g。

7.根据权利要求1所述的一种免疫活性肽冻干粉及其制备方法，其特征在于，在高压脉冲电场环境下可控酶解过程时，设定装置电场强度为10～40kV/cm，电场频率为1000～3000Hz。

8.根据权利要求1所述的一种免疫活性肽冻干粉及其制备方法，其特征在于，在低温膜分离过程时，在环境温度为15～20℃的条件下，先用NaOH和蒸馏水分别对截流量为30kDa和10kDa的超滤膜进行清洗，控制NaOH浓度为0.01～0.1M、NaOH温度为20～30℃、NaOH清洗时间为1～2h，控制蒸馏水的温度为20～30℃、清洗时间为1～3h，控制NaOH和蒸馏水的膜面流速为2～4mL/min，压力为10～30pis；再依次选用截流量为30kDa和10kDa的超滤膜进行膜分离，控制酶解上清液的温度为2～10℃、膜面流速为2～4mL/min、压力为10～30pis，最后收集分子量为10～30kDa的酶解组分分离液备用。

9.根据权利要求1所述的一种免疫活性肽冻干粉及其制备方法，其特征在于，在真空冷冻干燥过程时，将低温膜分离后的酶解组分分离液转移到冷冻盘中进行预冻，控制液面厚度在5～8mm，预冻温度为-25～-15℃，预冻时间为2～5h，然后再置于真空冷冻干燥机冷冻仓内，控制真空度小于10Pa，真空冷冻干燥时间为9～13h，即可获得水分含量为1.2%～1.8%，蛋白质含量为72%～86%、分子量为10～30kDa的免疫活性肽冻干粉。

10.一种本发明的免疫活性肽冻干粉的制备方法制得的免疫活性肽冻干粉，其水分含量为1.2%～1.8%、蛋白质含量为72%～86%、分子量为10～30kDa；经免疫活性评价实验证明，与对照组相比，受试组小鼠的脾淋巴细胞增殖能力显著提高10%～20%（P<0.01）。

本发明实现了在最优酶解条件和高压脉冲电场技术的支持下，制备一种免疫活性肽冻干粉。其优势主要体现在以下三个方面：

第一，本专利技术是以高压脉冲电场技术制备免疫活性肽冻干粉为创新点。将PEF技术应用于免疫活性肽冻干粉的酶解过程中，其优势突出体现在：（1）PEF可以提高免疫活性肽作用于体内的活性，显著提高受试小鼠脾淋巴细胞增殖能力；（2）PEF可以缩短酶解时间在1h内，并可以进行连续工业化生产；（3）PEF的能耗较低，更适合于食品原料附加值产品开发的绿色低碳主题；（4）PEF的处理温度低，可有效保持产品的物理及化学性质。

第二，本专利技术是以碱性蛋白酶酶解技术为主要技术。多数研究表明，碱性蛋白酶制备生物活性肽是可行有效的，产品得率和水解度均较高。本专利旨在提高肽得率的同时，改善免疫活性肽的品质，提高感官度，并通过单因素和响应面的实验设计方法，优选出最佳酶解条件和高压脉冲电场处理条件，避免了以往肽的酶解效果不佳的技术难题。

第三，本专利技术是以小鼠脾淋巴细胞转化实验为检验方法。根据《保健食品检验与评价技术规范实施手册》中第二部分功能学检验方法所规定的增强免疫力功能检验方法，进行受试小鼠的脾淋巴细胞转化实验，可检验受试小鼠的机体免疫功能变化，为深入研究动、植物源肽的稳定性和生物功能性奠定了理论基础。

本发明的技术效果：

（1）本发明实现了以水分含量为1.0%～5.0%、蛋白质含量在40%～70%的玉米蛋白粉、小麦蛋白粉、大米蛋白粉、大豆蛋白粉、绿豆蛋白粉和禽蛋蛋清粉中的任意一种为原料，利用高压脉冲电场技术，在常温条件下，获得一种水分含量为1.2%～1.8%、蛋白质含量为72%～86%、分子量为10～30kDa的免疫活性肽冻干粉。设计原料超微粉碎、蛋白溶液调配和均质化、高压脉冲电场环境下可控酶解、低温灭酶、低温离心、低温膜分离、真空冷冻干燥的工艺路线。以ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验中的MTT法为检验方法，优选酶解技术和高压脉冲电场技术的最佳工艺参数，实现了受试小鼠的实验组相比对照组，其实验结果优势显著性提高10%～20%（P<0.01）。

（2）本发明所设计的免疫活性肽冻干粉生产技术路线简单，所需设备投资少，产品价值高，有利于促进农畜副产物的综合利用和产业开发。因此，本专利申请要求保护的是一种免疫活性肽冻干粉及其制备方法，即以玉米蛋白粉、小麦蛋白粉、大米蛋白粉、大豆蛋白粉、绿豆蛋白粉和禽蛋蛋清粉中的任意一种为原料，通过原料超微粉碎、蛋白溶液调配和均质化、高压脉冲电场环境下可控酶解、低温灭酶、低温离心、低温膜分离、真空冷冻干燥过程制备一种免疫活性肽冻干粉的方法。

具体实施方式

实施例1：将水分含量为3.5%，蛋白质含量为66%的玉米蛋白粉进行超微粉碎至颗粒细度为320目，获得玉米蛋白超微粉密封备用。用纯净水将320目的玉米蛋白超微粉调至底物蛋白浓度为2%（W/W）的玉米蛋白溶液。利用高速分散均质机对玉米蛋白溶液进行均质化处理，调控转速为2000r/min，处理时间为10min。在环境温度为25℃的条件下，将长度为1mm、半径为0.5mm的双电极安装于高压脉冲电场装置上，依次选用75%的乙醇、蒸馏水分别清洗装置内物料循环管路2次，设定装置电场强度为10kV/cm，电场频率为2000Hz的工作状态下，待机；再用1M NaOH溶液将经均质化玉米蛋白溶液调节pH值为6，按[E]/[S]为2%（W/W）加入碱性蛋白酶，要求酶活范围为120万u/g，用1M NaOH溶液控制玉米蛋白溶液的pH值变化在±0.05内；开启恒流泵，使高压脉冲电场装置管路中充满玉米蛋白溶液后，再调节恒流泵工作状态，使玉米蛋白溶液在高压脉冲电场装置内的恒定流速为1.6mL/min后，开启恒流泵和高压脉冲电场装置，循环处理3次；将高压脉冲电场环境下可控酶解处理后的酶反应液迅速置于冰浴条件下的反应瓶中，控制蛋白溶液的温度为4℃，冰浴时间为15min；将酶解液进行低温离心，离心温度为4℃、转速为6000×g、离心时间为15min，收集酶解上清液。将酶解上清液进行膜分离处理，在环境温度为15～20℃的条件下，先用NaOH和蒸馏水分别对截流量为30kDa和10kDa的超滤膜进行清洗，控制NaOH浓度为0.01M、NaOH温度为20℃、NaOH清洗时间为1h，控制蒸馏水的温度为20℃、清洗时间为2h，控制NaOH和蒸馏水的膜面流速均为2.5mL/min，压力均为20pis；再依次选用截流量为30kDa和10kDa的超滤膜进行膜分离，控制料液温度为10℃、膜面流速为2.5mL/min、压力为20pis，最后收集分子量为10～30kDa的酶解组分分离液。将酶解组分分离液转移到冷冻盘中进行预冻，控制液面厚度在8mm，预冻温度为-25℃，预冻时间为5h，然后再置于真空冷冻干燥机冷冻仓内，控制真空度小于10Pa，真空冷冻干燥时间为10h，即可获得水分含量为1.5%、蛋白质含量为72%、分子量为10～30kDa的玉米免疫活性肽冻干粉。经免疫活性评价实验证明，受试小鼠的实验组相比对照组，脾淋巴细胞增殖能力显著提高10.2%（P<0.05）。

实施例2：将水分含量为4.5%，蛋白质含量为69%的小麦蛋白粉进行超微粉碎至颗粒细度为320目，获得小麦蛋白超微粉密封备用。用纯净水将320目的小麦蛋白超微粉调至底物蛋白浓度为4%（W/W）的小麦蛋白溶液。利用高速分散均质机对小麦蛋白溶液进行均质化处理，调控转速为2000r/min，处理时间为10min。在环境温度为25℃的条件下，将长度为1mm、半径为0.5mm的双电极安装于高压脉冲电场装置上，依次选用75%的乙醇、蒸馏水分别清洗装置内物料循环管路2次，设定装置电场强度为10kV/cm，电场频率为1000Hz的工作状态下，待机；再用1M NaOH溶液将经均质化的小麦蛋白溶液调节pH值为8，按[E]/[S]为4%（W/W）加入碱性蛋白酶，要求酶活范围为60万u/g，用1M NaOH溶液控制小麦蛋白溶液的pH值变化在±0.05内；开启恒流泵，使高压脉冲电场装置管路中充满均质化小麦蛋白溶液后，再调节恒流泵工作状态，使均质化小麦蛋白溶液在高压脉冲电场装置内的恒定流速为5mL/min后，开启恒流泵和高压脉冲电场装置，循环处理3次；将高压脉冲电场环境下可控酶解处理后的酶反应液迅速置于冰浴条件下的反应瓶中，控制酶反应液的温度为4℃，冰浴时间为15min；将酶解液进行低温离心，离心温度为4℃、转速为6000×g、离心时间为15min，收集酶解上清液。将酶解上清液进行膜分离处理，在环境温度为15～20℃的条件下，先用NaOH和蒸馏水分别对截流量为30kDa和10kDa的超滤膜进行清洗，控制NaOH浓度为0.01M、NaOH温度为20℃、NaOH清洗时间为1h，控制蒸馏水的温度为20℃、清洗时间为2h，控制NaOH和蒸馏水的膜面流速均为3mL/min，压力均为10pis；再依次选用截流量为30kDa和10kDa的超滤膜进行膜分离，控制料液温度为8℃、膜面流速为2.5mL/min、压力为20pis，最后收集分子量为10～30kDa的酶解组分分离液。将离心后的酶解组分分离液转移到冷冻盘中进行预冻，控制液面厚度在5mm，预冻温度为-25℃，预冻时间为5h，然后再置于真空冷冻干燥机冷冻仓内，控制真空度小于10Pa，真空冷冻干燥时间为10h，即可获得水分含量为1.8%、蛋白质含量为85%、分子量为10～30kDa的小麦免疫活性肽冻干粉。经免疫活性评价实验证明，受试小鼠的实验组相比对照组，脾淋巴细胞增殖能力显著提高13.5%（P<0.05）。

实施例3：将水分含量为4.7%，蛋白质含量为43%的大豆蛋白粉进行超微粉碎至颗粒细度为320目，获得大豆蛋白超微粉密封备用。用纯净水将320目的大豆蛋白超微粉调至底物蛋白浓度为1%（W/W）的大豆蛋白溶液。利用高速分散均质机对大豆蛋白溶液进行均质化处理，调控转速为4000r/min，处理时间为10min。在环境温度为25℃的条件下，将长度为3mm、半径为1mm的双电极安装于高压脉冲电场装置上，依次选用75%的乙醇、蒸馏水分别清洗装置内物料循环管路2次，设定装置电场强度为40kV/cm，电场频率为3000Hz的工作状态下，待机；再用1M NaOH溶液将经均质化的大豆蛋白溶液调节pH值为11，按[E]/[S]为12%（W/W）加入碱性蛋白酶，要求酶活范围为120万u/g，用1M NaOH溶液控制大豆蛋白溶液的pH值变化在±0.05内；开启恒流泵，使高压脉冲电场装置管路中充满均质化大豆蛋白溶液后，再调节恒流泵工作状态，使均质化大豆蛋白溶液在高压脉冲电场装置内的恒定流速为1.6mL/min后，开启恒流泵和高压脉冲电场装置，循环处理3次；将高压脉冲电场环境下可控酶解处理后的酶反应液迅速置于冰浴条件下的反应瓶中，控制酶反应液的温度为4℃，冰浴时间为15min；将酶解液进行低温离心，离心温度为4℃、转速为12000×g、离心时间为30min，收集酶解上清液。将酶解上清液进行膜分离处理，在环境温度为15～20℃的条件下，先用NaOH和蒸馏水分别对截流量为30kDa和10kDa的超滤膜进行清洗，控制NaOH浓度为0.01M、NaOH温度为20℃、NaOH清洗时间为1h，控制蒸馏水的温度为20℃、清洗时间为2h，控制NaOH和蒸馏水的膜面流速均为2.5mL/min，压力均为20pis；再依次选用截流量为30kDa和10kDa的超滤膜进行膜分离，控制料液温度为10℃、膜面流速为2.5mL/min、压力为20pis，最后收集分子量为10～30kDa的酶解组分分离液。将离心后的酶解组分分离液转移到冷冻盘中进行预冻，控制液面厚度在6mm，预冻温度为-15℃，预冻时间为2h，然后再置于真空冷冻干燥机冷冻仓内，控制真空度小于10Pa，真空冷冻干燥时间为12h，即可获得水分含量为1.5%、蛋白质含量为79%、分子量为10～30kDa的大豆免疫活性肽冻干粉。经免疫活性评价实验证明，受试小鼠的实验组相比对照组，脾淋巴细胞增殖能力显著提高12.7%（P<0.05）。

实施例4：将水分含量为3.6%，蛋白质含量为69%的蛋清蛋白粉进行超微粉碎至颗粒细度为320目，获得蛋清蛋白超微粉密封备用。用纯净水将320目的蛋清蛋白超微粉调至底物蛋白浓度为5%（W/W）的蛋清蛋白溶液。利用高速分散均质机对蛋清蛋白溶液进行均质化处理，调控转速为2000r/min，处理时间为10min。在环境温度为25℃的条件下，将长度为1mm、半径为0.5mm的双电极安装于高压脉冲电场装置上，依次选用75%的乙醇、蒸馏水分别清洗装置内物料循环管路2次，设定装置电场强度为40kV/cm，电场频率为2000Hz的工作状态下，待机；再用1M NaOH溶液将经均质化的蛋清蛋白溶液调节pH值为9.5，按[E]/[S]为2%（W/W）加入碱性蛋白酶，要求酶活范围为120万u/g，用1M NaOH溶液控制蛋清蛋白溶液的pH值变化在±0.05内；开启恒流泵，使高压脉冲电场装置管路中充满均质化蛋清蛋白溶液后，再调节恒流泵工作状态，使均质化蛋清蛋白溶液在高压脉冲电场装置内的恒定流速为1mL/min后，开启恒流泵和高压脉冲电场装置，循环处理5次；将高压脉冲电场环境下可控酶解处理后的酶反应液迅速置于冰浴条件下的反应瓶中，控制酶反应液的温度为4℃，冰浴时间为15min；将酶解液进行低温离心，离心温度为4℃、转速为6000×g、离心时间为10min，收集酶解上清液。在环境温度为15～20℃的条件下，先用NaOH和蒸馏水分别对截流量为30kDa和10kDa的超滤膜进行清洗，控制NaOH浓度为0.01M、NaOH温度为20℃、NaOH清洗时间为1h，控制蒸馏水的温度为20℃、清洗时间为1h，控制NaOH和蒸馏水的膜面流速均为2mL/min，压力均为20pis；再依次选用截流量为30kDa和10kDa的超滤膜进行膜分离，控制料液温度为10℃、膜面流速为2.5mL/min、压力为10pis，最后收集分子量为10～30kDa的酶解组分分离液。将离心后的酶解组分分离液转移到冷冻盘中进行预冻，控制液面厚度在8mm，预冻温度为-20℃，预冻时间为5h，然后再置于真空冷冻干燥机冷冻仓内，控制真空度小于10Pa，真空冷冻干燥时间为10h，即可获得水分含量为1.2%、蛋白质含量为80%、分子量为10～30kDa的蛋清免疫活性肽冻干粉。经免疫活性评价实验证明，受试小鼠的实验组相比对照组，脾淋巴细胞增殖能力显著提高19.8%（P<0.05）。

实施例5：将水分含量为3.2%，蛋白质含量为66%的玉米蛋白粉进行超微粉碎至颗粒细度为320目，获得玉米蛋白超微粉密封备用。用纯净水将320目的玉米蛋白超微粉调至底物蛋白浓度为10%（W/W）的玉米蛋白溶液。利用高速分散均质机对玉米蛋白溶液进行均质化处理，调控转速为4000r/min，处理时间为20min。在环境温度为25℃的条件下，将长度为1mm、半径为0.5mm的双电极安装于高压脉冲电场装置上，依次选用75%的乙醇、蒸馏水分别清洗装置内物料循环管路3次，设定装置电场强度为40kV/cm，电场频率为2500Hz的工作状态下，待机；再用1M NaOH溶液将经均质化的玉米蛋白溶液调节pH值为6，按[E]/[S]为6%（W/W）加入碱性蛋白酶，要求酶活范围为120万u/g，用1M NaOH溶液控制玉米蛋白溶液的pH值变化在±0.05内；开启恒流泵，使高压脉冲电场装置管路中充满均质化玉米蛋白溶液后，再调节恒流泵工作状态，使均质化玉米蛋白溶液在高压脉冲电场装置内的恒定流速为1.6mL/min后，开启恒流泵和高压脉冲电场装置，循环处理4次；将高压脉冲电场环境下可控酶解处理后的酶反应液迅速置于冰浴条件下的反应瓶中，控制酶反应液的温度为4℃，冰浴时间为15min；将酶解液进行低温离心，离心温度为4℃、转速为6000×g、离心时间为15min，收集酶解上清液。将酶解上清液进行膜分离处理，在环境温度为15～20℃的条件下，先用NaOH和蒸馏水分别对截流量为30kDa和10kDa的超滤膜进行清洗，控制NaOH浓度为0.01M、NaOH温度为20℃、NaOH清洗时间为1h，控制蒸馏水的温度为20℃、清洗时间为2h，控制NaOH和蒸馏水的膜面流速均为2.5mL/min，压力均为20pis；再依次选用截流量为30kDa和10kDa的超滤膜进行膜分离，控制料液温度为10℃、膜面流速为4mL/min、压力为10pis，最后收集分子量为10～30kDa的酶解组分分离液。将离心后的酶解组分分离液转移到冷冻盘中进行预冻，控制液面厚度在5mm，预冻温度为-15℃，预冻时间为5h，然后再置于真空冷冻干燥机冷冻仓内，控制真空度小于10Pa，真空冷冻干燥时间为10h，即可获得水分含量为1.8%、蛋白质含量为72%、分子量为10～30kDa的玉米免疫活性肽冻干粉。经免疫活性评价实验证明，受试小鼠的实验组相比对照组，脾淋巴细胞增殖能力显著提高18.9%（P<0.05）。

Claims (7)

1.一种免疫活性肽冻干粉的制备方法，其特征在于，是以水分含量为1.0%～5.0%、蛋白质含量在40%～70%的玉米蛋白粉、小麦蛋白粉、大米蛋白粉、大豆蛋白粉、绿豆蛋白粉和禽蛋蛋清粉中的任意一种为原料，经过原料超微粉碎、蛋白溶液调配和均质化、高压脉冲电场环境下可控酶解、低温灭酶、低温离心、低温膜分离、真空冷冻干燥过程，制备出水分含量为1.2%～1.8%、蛋白质含量为72%～86%、分子量为10～30kDa的免疫活性肽冻干粉；

1）所述的原料超微粉碎过程，是将原料进行超微粉碎至颗粒细度为300～400目，获得蛋白超微粉密封备用；

2）所述的蛋白溶液调配和均质化，是选择纯净水、去离子水、渗透水和蒸馏水中的任意一种，将蛋白超微粉调至底物蛋白浓度为1%～10%（W/W）的蛋白溶液；利用高速分散均质机对蛋白溶液进行均质化处理，调控转速为1000～4000r/min，处理时间为5～30min，获得均质化蛋白溶液；

3）所述的高压脉冲电场环境下可控酶解，是在环境温度为15～25℃的条件下，将长度为1～3mm、半径为0.5～1mm的双电极安装于高压脉冲电场装置上，依次选用75%的乙醇、水分别清洗装置内物料循环管路2～3次，设定装置电场强度为5～50kV/cm，电场频率为500～3000Hz的工作状态下，待机；再用1M NaOH溶液将均质化蛋白溶液调节pH值为6～11，按[E]/[S]为2%～12%（W/W）加入碱性蛋白酶，要求酶活范围为50万～150万u/g，用1M NaOH溶液控制均质化蛋白溶液的pH值变化在±0.05内；开启恒流泵，使高压脉冲电场装置管路中充满均质化蛋白溶液后，再调节恒流泵工作状态，使均质化蛋白溶液在高压脉冲电场装置内的恒定流速为1～10mL/min后，开启恒流泵和高压脉冲电场装置，循环处理2～5次，得到酶反应液；

4）所述的低温灭酶，是将高压脉冲电场环境下可控酶解处理后的酶反应液迅速置于冰浴条件下的反应瓶中，控制酶反应液的温度为2～8℃，冰浴时间为5～35min，获得酶解液；

5）所述的低温离心过程，是将酶解液进行低温离心，离心温度为4℃、转速为6000～12000×g、离心时间为5～30min，收集酶解上清液备用；

6）所述的低温膜分离过程，是在环境温度为15～20℃的条件下，将酶解上清液进行低温膜分离处理，先用NaOH和蒸馏水分别对截流量为30kDa和10kDa的超滤膜进行清洗，控制NaOH浓度为0.01～0.15M、NaOH温度为10～30℃、NaOH清洗时间为1～2h，控制蒸馏水的温度为10～30℃、清洗时间为1～3h，控制NaOH和蒸馏水的膜面流速均为2.0～4.5mL/min，压力均为5～30pis；再依次选用截流量为30kDa和10kDa的超滤膜进行膜分离，控制酶解上清液的温度为2～10℃、膜面流速为2.0～4.5mL/min、压力为5～30pis，最后收集分子量为10～30kDa的酶解组分分离液备用；

7）所述的真空冷冻干燥过程，是将低温膜分离后的酶解组分分离液转移到冷冻盘中进行预冻，控制液面厚度在5～10mm，预冻温度为-30～-15℃，预冻时间为2～6h，然后再置于真空冷冻干燥机冷冻仓内，控制真空度小于10Pa，真空冷冻干燥时间为9～15h，即可获得免疫活性肽冻干粉。

2.根据权利要求1所述的一种免疫活性肽冻干粉的制备方法，其特征在于，在高压脉冲电场环境下可控酶解过程时，用水清洗高压脉冲电场装置内物料循环管路，所述的水，选用去离子水、纯净水、渗透水、蒸馏水中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的一种免疫活性肽冻干粉的制备方法，其特征在于，在高压脉冲电场环境下可控酶解过程时，选用碱性蛋白液体酶或固体酶，要求酶活范围为60万～120万u/g。

4.根据权利要求1所述的一种免疫活性肽冻干粉的制备方法，其特征在于，在高压脉冲电场环境下可控酶解过程时，设定装置电场强度为10～40kV/cm，电场频率为1000～3000Hz。

5.根据权利要求1所述的一种免疫活性肽冻干粉的制备方法，其特征在于，在低温膜分离过程时，在环境温度为15～20℃的条件下，先用NaOH和蒸馏水分别对截流量为30kDa和10kDa的超滤膜进行清洗，控制NaOH浓度为0.01～0.1M、NaOH温度为20～30℃、NaOH清洗时间为1～2h，控制蒸馏水的温度为20～30℃、清洗时间为1～3h，控制NaOH和蒸馏水的膜面流速为2～4mL/min，压力为10～30pis；再依次选用截流量为30kDa和10kDa的超滤膜进行膜分离，控制酶解上清液的温度为2～10℃、膜面流速为2～4mL/min、压力为10～30pis，最后收集分子量为10～30kDa的酶解组分分离液备用。

6.根据权利要求1所述的一种免疫活性肽冻干粉的制备方法，其特征在于，在真空冷冻干燥过程时，将低温膜分离后的酶解组分分离液转移到冷冻盘中进行预冻，控制液面厚度在5～8mm，预冻温度为-25～-15℃，预冻时间为2～5h，然后再置于真空冷冻干燥机冷冻仓内，控制真空度小于10Pa，真空冷冻干燥时间为9～13h。

7.一种权利要求1的免疫活性肽冻干粉的制备方法制得的免疫活性肽冻干粉，其水分含量为1.2%～1.8%、蛋白质含量为72%～86%、分子量为10～30kDa；经免疫活性评价实验证明，与对照组相比，受试组小鼠的脾淋巴细胞增殖能力显著提高10%～20%（P<0.01）。