CN107583031A - 一种清蛋白肽混合物的制备方法及其抑制癌细胞增殖作用 - Google Patents

一种清蛋白肽混合物的制备方法及其抑制癌细胞增殖作用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种清蛋白肽混合物的制备方法及其抑制癌细胞增殖作用，其制备步骤包括：清蛋白与水比例混合、加温、调节pH值、添加碱性蛋白酶进行酶解、灭酶、过滤；薏苡仁与水比例混合、煮沸提取、过滤、滤渣加入一定比例的水、继续煮沸提取、收集滤液，分别测定固形物，混合两种溶液、浓缩、喷雾干燥即可得到具有抑制癌细胞增殖作用的清蛋白肽混合物。本发明发现了清蛋白肽混合物比单用薏苡仁的抑制癌细胞增殖效果更强，工艺更简单。

Description

一种清蛋白肽混合物的制备方法及其抑制癌细胞增殖作用
技术领域
本发明涉及一种具有抑制癌细胞增殖作用的清蛋白肽混合物的制备方法。
背景技术
最新版的《世界癌症报告》显示，非洲、亚洲和中南美洲等发展中国家癌症发病形势最为严峻。2012年全世界共新增1400万癌症病例并有820万人死亡。其中，中国新增307万癌症患者并造成约220万人死亡，分别占全球总量的21.9％和26.8％。全国肿瘤登记中心发布的2012年数据显示，中国每年新增癌症病例约350万，约有250万人因此死亡。
癌症，又称恶性肿瘤。肿瘤是指机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞异常增生而形成的局部肿块。良性肿瘤容易清除干净，一般不转移、不复发，对器官、组织只有挤压和阻塞作用；但恶性肿瘤还可以破坏组织、器官的结构和功能，引起坏死出血合并感染，患者最终可能由于器官功能衰竭而死亡。
清蛋白多肽是以鸡蛋清为原料，经酶解、分离、精制和干燥等加工过程而制得的相对分子量在200～800Dalton的小分子低聚肽，鸡蛋含的营养素成分丰富全面，而被称为“人类理想的营养库”。营养学家称它为“完全蛋白质模式”。蛋清蛋白含有丰富的蛋白质和人体所必需的多种氨基酸，且氨基酸组成配比均衡性好，是机体利用率较高的一种蛋白质。清蛋白多肽是以鸡蛋清为原料，利用现代生物工程技术经酶切提取的具有生物活性的小分子多肽，具有易吸收，生物利用率高等特点，同时具有多种生理功能，在营养和保健方面均有其不可替代的优势。
蛋白质以及多肽与机体免疫力密切有关。文献报道蛋白质营养不良可引起淋巴组织广泛的萎缩，尤其是儿童胸腺、脾、淋巴结等均可受到影响，致使组织形态遭受改变。实验表明：清蛋白多肽对机体免疫功能具有增强作用。因此补充清蛋白多肽可促进免疫组织的功能恢复，提高机体抗病能力。对少年、儿童及老年抵抗病毒和细菌的侵袭，增强抗病能力是非常有利的。清蛋白肽作为小分子蛋白肽，在保留清蛋白营养价值的同时，由于具有更小的分子量，可不经消化直接被人体吸收，快速补充人体所需营养。清蛋白肽含有人体所需的20种必需和非必需的氨基酸，氨基酸组成配比均衡性好，可作为开发此类产品的单一原料。清蛋白肽具有调节免疫的作用，可广泛用于保健食品和医用食品领域。
薏苡仁(又称薏米)营养价值很高，被誉为“世界禾本科植物之王”。薏苡仁，味甘淡微甜，营养丰富，含碳水化合物质量比52％-80％，蛋白质质量比13％-17％，脂肪质量比4％-7％，油以不饱和脂肪酸为主，其中亚麻油酸占质量比34％，并有特殊的薏仁酯；磨粉面食，为价值很高的保健食品。薏苡仁入药有健脾、利尿、清热、镇咳之效。本发明是基于中国传统中药材与现代营养科学展开的一系列的研究工作。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种具有抑制癌细胞增殖作用的清蛋白肽混合物的制备方法。该混合物具有显著的抑制癌细胞增殖的效果，且制备方法简单。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
一种具有抑制癌细胞增殖作用的清蛋白肽混合物，原料包括重量比为5:2-5的清蛋白酶解液和薏苡仁提取物，所述清蛋白酶解液的固形物含量15-35％，所述薏苡仁提取物的固形物含量10-30％。
优选地，所述清蛋白酶解液的制备方法如下：
(1)将清蛋白加入其质量5-20倍的水，升温至40℃-60℃，打浆备用；
(2)将步骤(1)打浆后的料液的pH值调节至pH 7-9，添加占所述料液质量3-5％的碱性蛋白酶进行酶解反应5-10h；
(3)将步骤(2)的酶解液加热至沸腾，灭活0.5-2h；
(4)将步骤(3)灭活后的酶解液降温至60-80℃，进行过滤操作得所述清蛋白酶解液。
在上述任一方案中优选地，步骤(3)中的过滤方式为板框过滤。
在上述任一方案中优选地，所述薏苡仁提取物的制备方法如下：
(1)薏苡仁进行第一次水煮至沸腾3-5h，水量为薏苡仁质量的10-15倍，然后进行过滤；
(2)薏苡仁进行第二次水煮至沸腾1-3h，水量为薏苡仁质量的5-10倍，然后进行过滤；
(3)集合两次过滤的滤液得所述薏苡仁提取物。
在上述任一方案中优选地，步骤(1)和(2)中的过滤方式为板框过滤。
本发明还提供所述的具有抑制癌细胞增殖作用的清蛋白肽混合物的制备方法，包括以下各步骤：
(1)将清蛋白加入其质量5-20倍的水，升温至40℃-60℃，打浆备用；
(2)将步骤(1)打浆后的料液的pH值调节至pH 7-9，添加占所述料液质量3-5％的碱性蛋白酶进行酶解反应5-10h；
(3)将步骤(2)的酶解液加热至沸腾，灭活0.5-2h；
(4)将步骤(3)灭活后的酶解液降温至60-80℃，进行过滤操作得所述清蛋白酶解液；
(5)薏苡仁进行第一次水煮至沸腾3-5h，水量为薏苡仁质量的10-15倍，然后进行过滤；
(6)薏苡仁进行第二次水煮至沸腾1-3h，水量为薏苡仁质量的5-10倍，然后进行过滤；
(7)集合两次过滤的滤液得所述薏苡仁提取物；
(8)对清蛋白肽酶解液和薏苡仁提取物滤液分别进行固形物测定，将清蛋白酶解液和薏苡仁提取物滤液按一定比例混合；
(9)将步骤(8)混合液进行低温减压浓缩，温度40-60℃，压力0.03-0.07MPa，然后喷雾干燥，进口风温度180-220℃，出口风温度80-110℃，制得所述具有抑制癌细胞增殖作用的清蛋白肽混合物。
优选地，所述过滤方式均为板框过滤。
本发明所述的具有抑制癌细胞增殖作用的清蛋白肽混合物可用于食品、功能食品及药品的制备。
本发明的有益效果：本发明制备的清蛋白肽混合物产品多肽含量大于20％，总糖含量大于10％。本发明与现有领域相比，首次将清蛋白肽与薏苡仁提取物配伍制备产品，其中清蛋白肽含量为3.75％和薏苡仁提取物含量为3％；将经过碱性蛋白酶水解得到的清蛋白肽酶解液与薏苡仁水提液通过固形物测定的方法，按比例混合后通过低温减压浓缩，喷雾干燥得到清蛋白肽和薏苡仁提取物混合物；清蛋白肽与薏苡仁提取物的混合物用于抑制癌细胞增殖。首次通过上述工艺制备得到了具有抑制癌细胞增殖的清蛋白肽混合物。本发明的混合物具有显著的抑制癌细胞增殖的效果，且制备过程上简化了传统工艺，将浓缩和干燥合并一步完成，省去了干燥后物料进行混合的过程，大大节约人工成本、提高产品质量。
附图说明
图1是本发明具有抑制癌细胞增殖作用的清蛋白肽混合物的制备方法的工艺流程图。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1一种具有抑制癌细胞增殖作用的清蛋白肽混合物
制备方法包括以下各步骤：
(1)将清蛋白中加入质量是其20倍的水，升温至50℃，打浆备用；
(2)将打浆后的料液用稀氢氧化钠调节酸度至pH为8；添加碱性蛋白酶占物料质量的3％，进行酶解8h；
(3)将酶解得到的水解液加热至沸腾，灭活0.5h；
(4)对灭活后的水解液降温至60℃，进行板框过滤操作；
(5)薏苡仁进行第一次水煮至沸腾3h，水量为薏苡仁质量的10倍，进行板框过滤；
(6)薏苡仁进行第二次水煮至沸腾1h，水量为薏苡仁质量的5倍，进行板框过滤；
(7)集合(5)、(6)两次过滤的滤液；
(8)对清蛋白肽酶解液和薏苡仁提取物滤液分别进行固形物测定：清蛋白肽酶解液固形物含量17.3％、薏苡仁提取物滤液固形物含量22.8％，两者按总质量5:3的比例混合；
(9)将混合液进行低温减压浓缩，温度60℃，压力0.07MPa；喷雾干燥进口风温度200℃，出口风温度90℃，制得成品。
成品中多肽含量大于38.7％，总糖含量大于21.1％，水分4.1％，符合产品标准中多肽含量大于20％，总糖含量大于10％的要求。
实施例2一种具有抑制癌细胞增殖作用的清蛋白肽混合物的制备
制备方法包括以下各步骤：
(1)将清蛋白加入其质量10倍的水进行升温50℃，打浆备用；
(2)将打浆后的料液用稀氢氧化钠调节至pH 9；添加碱性蛋白酶占物料质量的4％，进行酶解6h；
(3)将酶解得到的水解液加热至沸腾，灭活0.5h；
(4)对灭活后的水解液降温至60℃，进行板框过滤操作；
(5)薏苡仁进行第一次水煮至沸腾5h，水量为薏苡仁质量的15倍，进行板框过滤；
(6)薏苡仁进行第二次水煮至沸腾3h，水量为薏苡仁质量的10倍，进行板框过滤；
(7)集合(5)、(6)两次过滤的滤液；
(8)对清蛋白肽酶解液和薏苡仁提取物滤液分别进行固形物测定：清蛋白肽酶解液固形物含量31.3％、薏苡仁提取物滤液固形物含量21.9％，两者按总固形物总质量5:4的比例混合；
(9)将混合液进行低温减压浓缩，温度60℃，压力0.03MPa；喷雾干燥进口风温度200℃，出口风温度90℃，制得成品。
成品多肽含量大于39.0％，总糖含量大于20.3％，水分4.5％，符合产品标准中多肽含量大于20％，总糖含量大于10％的要求。
实施例3一种具有抑制癌细胞增殖作用的清蛋白肽混合物的制备
制备方法包括以下各步骤：
(1)将清蛋白加入其质量10倍的水进行升温50℃，打浆备用；
(2)将打浆后的料液用稀氢氧化钠调节至pH 9；添加碱性蛋白酶占物料质量的3％，进行酶解7h；
(3)将酶解得到的水解液加热至沸腾，灭活0.5h；
(4)对灭活后的水解液降温至60℃，进行板框过滤操作；
(5)薏苡仁进行第一次水煮至沸腾4h，水量为薏苡仁质量的13倍，进行板框过滤；
(6)薏苡仁进行第二次水煮至沸腾2h，水量为薏苡仁质量的8倍，进行板框过滤；
(7)集合(5)、(6)两次过滤的滤液；
(8)对清蛋白肽酶解液和薏苡仁提取物滤液分别进行固形物测定：清蛋白肽酶解液固形物含量30.9％、薏苡仁提取物滤液固形物含量21.3％，两者按总质量5:4的比例混合；
(9)将混合液进行低温减压浓缩，温度60℃，压力0.03MPa；喷雾干燥进口风温度205℃，出口风温度93℃，制得成品。
成品多肽含量大于38.8％，总糖含量大于20.2％，水分4.3％，符合产品标准中多肽含量大于20％，总糖含量大于10％的要求。
实施例4一种具有抑制癌细胞增殖作用的清蛋白肽混合物的制备
制备方法包括以下各步骤：
(1)将清蛋白加入其质量5倍的水进行升温40℃，打浆备用；
(2)将打浆后的料液用稀氢氧化钠调节至pH 7；添加碱性蛋白酶占物料质量的5％，进行酶解10h；
(3)将酶解得到的水解液加热至沸腾，灭活2h；
(4)对灭活后的水解液降温至60℃，进行板框过滤操作；
(5)薏苡仁进行第一次水煮至沸腾4h，水量为薏苡仁质量的13倍，进行板框过滤；
(6)薏苡仁进行第二次水煮至沸腾2h，水量为薏苡仁质量的8倍，进行板框过滤；
(7)集合(5)、(6)两次过滤的滤液；
(8)对清蛋白肽酶解液和薏苡仁提取物滤液分别进行固形物测定：清蛋白肽酶解液固形物含量15％、薏苡仁提取物滤液固形物含量10％，两者按总质量5:2的比例混合；
(9)将混合液进行低温减压浓缩，温度40℃，压力0.03MPa；喷雾干燥进口风温度180℃，出口风温度110℃，制得成品。
成品多肽含量大于38.0％，总糖含量大于20.0％，水分4.1％，符合产品标准中多肽含量大于20％，总糖含量大于10％的要求。
实施例5不同的清蛋白肽混合溶液对肝癌细胞抑制实验
根据实施例3所述工艺得到的清蛋白肽混合物，制备得到浓度分别为低剂量组10mg/L、中剂量组30mg/L、高剂量组50mg/L受试样品组溶液。
根据实施例3中薏苡仁提取物的工艺的制备方法，制备浓度为13.3mg/L的薏苡仁提取物溶液作为对照组。
取乙醇溶液为空白组。
取对数生长期的人肝癌细胞SMMC-7721，倒出培养液，加入0.25％胰酶溶液，37℃消化2～3min后，倒置显微镜下观察细胞，待80％细胞变圆时倒去消化液.加入20％小牛血清添加量的培养液4mL，吸管反复吹打，使全部细胞被冲下，轻轻吹打混匀，制成单细胞悬液，调整培养液使细胞浓度为105个/mL，取105个/mL细胞悬液，以每孔195μL接种96孔板，培养24h后，将不同剂量清蛋白肽混合溶液以及空白组、对照组溶液各加入5μL，对照组加入5μL20％乙醇，每种设6个平行孔。培养2天后，每孔加入5mg/mLMTT20μL，继续培养4h，吸出培养液，加入150μLDMSO，轻微振荡溶解结晶，自动酶标仪在490nm处测定吸光度值，按下面公式计算细胞生长抑制率.
细胞生长抑制率(Ig)＝(1－给药组吸光度/对照组吸光度)×100％
实验结果：
由表1可知，受试样品低剂量组、中剂量组、高剂量组对人肝癌细胞SMMC-7721生长的抑制作用与空白组比较具有显著差异，即样品组具有显著的抑制人肝癌细胞SMMC-7721生长的作用。
表1清蛋白肽混合物与薏苡仁对人肝癌细胞SMMC-7721生长抑制的影响比对试验
实施例6不同浓度的清蛋白肽混合溶液对胃癌细胞抑制实验
根据实施例3所述工艺得到的清蛋白肽混合物，制备得到浓度分别为低剂量组10mg/L、中剂量组30mg/L、高剂量组50mg/L受试样品组溶液。
根据实施例3中薏苡仁提取物的工艺的制备方法，制备浓度为13.3mg/L的薏苡仁提取物溶液作为对照组。
取乙醇溶液为空白组。
取对数生长期的人胃癌细胞BGC823，用培养液稀释制备细胞悬液，调整细胞浓度为5×104个/mL。取96孔培养板，设空白组、对照组(加入20％乙醇)和给药组，按设计方案将细胞悬液接种于96孔培养板中，每孔加入细胞悬液200μL。将96孔培养板在5％CO2培养箱中37℃培养24h，倾去上清液，给药组先分别加入不同浓度的清蛋白肽混合溶液20μL，再加培养液至200μL，其他组直接加培养液至足量，混匀；各孔继续培养24h，倾去上清液，每孔加入5mg/mLMTT20μL，培养液180μL。96孔培养板在1000r/min条件下离心10min，小心吸弃孔内上清液，每孔加DMSO100μL，轻微振荡溶解结晶，自动酶标仪在490nm处测定吸光度值，按下面公式计算细胞生长抑制率.
细胞生长抑制率(Ig)＝(1－给药组吸光度/对照组吸光度)×100％
实验结果：
由表2可知，受试样品低剂量组、中剂量组、高剂量组对人胃癌细胞BGC823生长的抑制作用与空白组比较具有显著差异，即样品组具有显著的抑制人胃癌细胞BGC823生长的作用。
表2清蛋白肽混合物与薏苡仁对人胃癌细胞BGC823生长抑制的影响比对试验
实施例7不同浓度的清蛋白肽混合溶液对人肺癌细胞SPC-A1抑制实验
根据实施例3所述工艺得到的清蛋白肽混合物，制备得到浓度分别为低剂量组10mg/L、中剂量组30mg/L、高剂量组50mg/L受试样品组溶液。
根据实施例3中薏苡仁提取物的工艺的制备方法，制备浓度为13.3mg/L的薏苡仁提取物溶液作为对照组。
取乙醇溶液为空白组。
取对数生长期的人肺癌细胞SPC-A1，用培养液稀释制备细胞悬液，调整细胞浓度为5×104个/mL。取96孔培养板，设空白组、对照组(加入20％乙醇)和给药组，按设计方案将细胞悬液接种于96孔培养板中，每孔加入细胞悬液200μL。将96孔培养板在5％CO2培养箱中37℃培养24h，倾去上清液，给药组先分别加入不同浓度的清蛋白肽混合溶液20μL，再加培养液至200μL，其他组直接加培养液至足量，混匀；各孔继续培养24h，倾去上清液，每孔加入5mg/mLMTT20μL，培养液180μL。96孔培养板在1000r/min条件下离心10min，小心吸弃孔内上清液，每孔加DMSO100μL，轻微振荡溶解结晶，自动酶标仪在490nm处测定吸光度值，按下面公式计算细胞生长抑制率.
细胞生长抑制率(Ig)＝(1－给药组吸光度/对照组吸光度)×100％
实验结果：
由表3可知，受试样品低剂量组、中剂量组、高剂量组对人肺癌细胞SPC-A1生长的抑制作用与空白组比较具有显著差异，即样品组具有显著的抑制人肺癌细胞SPC-A1的作用。
表3清蛋白肽混合物与薏苡仁对人肺癌细胞SPC-A1生长抑制的影响比对试验
实施例8不同浓度的清蛋白肽混合溶液对人宫颈癌细胞Hela抑制实验
根据实施例3所述工艺得到的清蛋白肽混合物，制备得到浓度分别为低剂量组10mg/L、中剂量组30mg/L、高剂量组50mg/L受试样品组溶液。
根据实施例3中薏苡仁提取物的工艺的制备方法，制备浓度为13.3mg/L的薏苡仁提取物溶液作为对照组。
取乙醇溶液为空白组。
取对数生长期的人宫颈癌细胞Hela，用培养液稀释制备细胞悬液，调整细胞浓度为3×104个/mL。取96孔培养板，设空白组、对照组(加入20％乙醇)和给药组，按设计方案将细胞悬液接种于96孔培养板中，每孔加入细胞悬液200μL。将96孔培养板在5％CO2培养箱中37℃培养24h，倾去上清液，给药组先分别加入不同浓度的清蛋白肽混合溶液20μL，各孔继续培养72h，倾去上清液，每孔加入5mg/mLMTT20μL，继续培养4h。96孔培养板在1000r/min条件下离心10min，小心吸弃孔内上清液，每孔加DMSO150μL，轻微振荡溶解结晶，自动酶标仪在490nm处测定吸光度值，按下面公式计算细胞生长抑制率.
细胞生长抑制率(Ig)＝(1－给药组吸光度/对照组吸光度)×100％
实验结果：
由表4可知，受试样品低剂量组、中剂量组、高剂量组对人宫颈癌细胞Hela生长的抑制作用与空白组比较具有显著差异，即样品组具有显著的抑制人宫颈癌细胞Hela的作用。
表4清蛋白肽混合物与薏苡仁对人宫颈癌细胞Hela生长抑制的影响比对试验
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种具有抑制癌细胞增殖作用的清蛋白肽混合物，其特征在于：原料包括质量比为5:2-5的清蛋白酶解液和薏苡仁提取物，所述清蛋白酶解液的固形物含量15-35％，所述薏苡仁提取物的固形物含量10-30％。
2.根据权利要求1所述的具有抑制癌细胞增殖作用的混合物清蛋白肽混合物，其特征在于：所述清蛋白酶解液的制备方法如下：
(1)将清蛋白加入其质量5-20倍的水，升温至40℃-60℃，打浆备用；
(2)将步骤(1)打浆后的料液的pH值调节至7-9，添加占所述料液质量3-5％的碱性蛋白酶进行酶解反应5-10h；
(3)将步骤(2)的酶解液加热至沸腾，灭活0.5-2h；
(4)将步骤(3)灭活后的酶解液降温至60-80℃，进行过滤操作得所述清蛋白酶解液。
3.根据权利要求2所述的具有抑制癌细胞增殖作用的清蛋白肽混合物，其特征在于：步骤(4)中的过滤方式为板框过滤。
4.根据权利要求1所述的具有抑制癌细胞增殖作用的清蛋白肽混合物，其特征在于：所述薏苡仁提取物的制备方法如下：
(1)薏苡仁进行第一次水煮至沸腾3-5h，水量为薏苡仁质量的10-15倍，然后进行过滤；
(2)薏苡仁进行第二次水煮至沸腾1-3h，水量为薏苡仁质量的5-10倍，然后进行过滤；
(3)集合两次过滤的滤液得所述薏苡仁提取物。
5.根据权利要求4所述的具有抑制癌细胞增殖作用的清蛋白肽混合物，其特征在于：步骤(1)和(2)中的过滤方式为板框过滤。
6.根据权利要求1至5任一项所述的具有抑制癌细胞增殖作用的清蛋白肽混合物的制备方法，其特征在于：包括以下各步骤：
(1)将清蛋白加入其质量5-20倍的水，升温至40℃-60℃，打浆备用；
(2)将步骤(1)打浆后的料液的pH值调节至pH 7-9，添加占所述料液质量3-5％的碱性蛋白酶进行酶解反应5-10h；
(3)将步骤(2)的酶解液加热至沸腾，灭活0.5-2h；
(4)将步骤(3)灭活后的酶解液降温至60-80℃，进行过滤操作得所述清蛋白酶解液；
(5)薏苡仁进行第一次水煮至沸腾3-5h，水量为薏苡仁质量的10-15倍，然后进行过滤；
(6)薏苡仁进行第二次水煮至沸腾1-3h，水量为薏苡仁质量的5-10倍，然后进行过滤；
(7)集合两次过滤的滤液得所述薏苡仁提取物；
(8)对清蛋白肽酶解液和薏苡仁提取物滤液分别进行固形物测定，将清蛋白酶解液和薏苡仁提取物滤液按一定比例混合；
(9)将步骤(8)混合液进行低温减压浓缩，温度40-60℃，压力0.03-0.07MPa，然后喷雾干燥，进口风温度180-220℃，出口风温度80-110℃，制得所述具有抑制癌细胞增殖作用的清蛋白肽混合物。
7.根据权利要求6所述的具有抑制癌细胞增殖作用的清蛋白肽混合物的制备方法，其特征在于：所述过滤方式均为板框过滤。
8.权利要求1至6任一事项所述的清蛋白肽混合物可以是粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、口服液。
9.权利要求1至6任一项所述的清蛋白肽混合物可应用于食品、功能食品以及药品。
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