CN110229857A - 燕窝肽及其解聚耦合酶解的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了解聚耦合酶解制备燕窝肽的方法，包括对浸泡过的燕窝进行变性，将变性后的燕窝进行粉碎，将粉碎后的燕窝调节pH至6.5‑7.5，然后加入蛋白酶，进行酶解，对酶解产物灭酶，过滤。本发明还提供了该方法制备的燕窝肽及其在药物或保健食品中的应用等。

Description

燕窝肽及其解聚耦合酶解的制备方法

技术领域

本发明属于蛋白质和肽技术领域，具体而言，本发明涉及涉及燕窝蛋白的解聚耦合酶解制备方法及其制备获得的燕窝肽。

背景技术

燕窝(Edible bird's nest,EBN)是指雨燕科多种金丝燕用唾液和少量绒羽等凝结所筑的巢窝。燕窝是一种名贵补品，具有养阴润燥、补中益气、入胃补脾、化痰止咳等功能，被誉为“八珍之首”。中医认为燕窝：养阴润燥、益气补中、治虚损、咳痰喘、咯血、久痢，适宜于体质虚弱，营养不良，久痢久疟，痰多咳嗽，老年慢性支气管炎、支气管扩张、肺气肿、肺结核、咯血吐血和胃痛病人食用。现代医学发现，燕窝可促进免疫功能，有延缓人体衰老，延年益寿的功效。研究发现，燕窝主要成分有：水溶性蛋白质、碳水化合物、微量元素(包括钙、磷、铁、钠、钾)及对促进人体活力起重要作用的氨基酸，其中蛋白质含量在60％左右。

当前，已经有一些燕窝的肽类产品被报道。例如，中国专利申请CN107974479A公开了一种以微波和膜技术制备燕窝低聚肽的方法，包括：先将燕窝粉碎，用热去离子水浸泡胀发，用胶体磨循环研磨成燕窝浆，添加去离子水，调节pH值至10.6，用微波处理流出蛋白质，在微波辅助下进行双酶水解，再经超滤和纳滤聚集燕窝低聚肽。该低聚肽的肽段分布在5肽-16肽，肽的相对分子量为539-1745Da。

又如，中国专利申请CN108070018A公开了一种从燕窝中提取燕窝天然肽的方法，该方法通过筛选试验获得提取燕窝天然肽的最佳条件，包括初始的pH值为9.5、终止的pH值为≤8.4等。该方法提取的燕窝天然肽的肽段从5肽至19肽。

还如，中国专利申请CN108893511A公开了一种燕窝提取小分子肽的方法，包括：用清水浸泡燕窝并干燥；将干燥后的燕窝粉碎，筛选；将筛选后的粉末进行破壁，得精细粉；向精细粉添加去离子水，利用木聚糖酶、果胶酶、木瓜蛋白酶复合梯度酶解，再经木瓜蛋白酶对蛋白质进行酶解。

另外，中国专利申请CN107488225A公开了一种燕窝提取小分子肽的方法，包括：将燕窝经过太阳晒干，粉碎成粉末，在粉末中加无离子水调制成混合液，将混合液放入超声水浴锅中振荡后在碱性环境下进行电磁加热酶解，用安装了带3层滤膜的离心滚筒的离心机分离混合液得到精滤液，将所述精滤液置于冰库冷低温稳定，将精滤液移动至真空干燥机干燥后得所述燕窝提取的小分子肽，提高人体对燕窝小分子肽的吸收能力。

这些现有技术制备燕窝的肽类产品的方法，有的繁琐，设备投入大，有的简陋，产率低下，除此之外，更严重的是，这些技术制备的燕窝的肽类产品虽然大都均标榜将燕窝中的蛋白质分解为易吸收的小分子肽，提高燕窝的生物利用率，但是它们实际的药用或者保健效果不确切，难以实际推广使用。

本发明人凭借长期的深入研究，令人意外地对燕窝研究出了一种解聚耦合酶解制备燕窝肽的方法，不但方法易操作，设备投入不大，而且用该方法制备出的新的燕窝肽除了具有小分子肽易吸收等特点，而且药用、保健效果确切，能显著提高免疫力。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供新的燕窝肽，其药用、保健效果确切，优于传统技术制备的燕窝产品。另外，本发明还提供了该燕窝肽的制备方法和在诸如提高免疫力方面的应用等。

具体而言，在第一方面，本发明提供了燕窝肽，其通过包括如下步骤的解聚耦合酶解制备方法制备：

(1)取干净的燕窝，加水浸泡；

(2)对浸泡过的燕窝进行变性；

(3)将变性后的燕窝进行粉碎；

(4)将粉碎后的燕窝调节pH至6.5-7.5，然后加入蛋白酶，进行酶解；

(5)对酶解产物灭酶，过滤；和

(6)任选对过滤的酶解液进行浓缩、干燥。

优选在本发明第一方面的燕窝肽的制备步骤(1)中，燕窝和水的重量比为1：40-80，优选为1：50-70，如1：60。

也优选在本发明第一方面的燕窝肽的制备步骤(1)中，浸泡的温度为15-30℃，优选为22-26℃，如室温。通常，室温可以是25℃。

还优选在本发明第一方面的燕窝肽的制备步骤(1)中，浸泡的时间为2-6小时，优选为3-5小时，如4小时。

本发明第一方面的燕窝肽的制备步骤(2)中变性的方法可以是物理方法，如加热、加压、脱水、搅拌、振荡、紫外线照射和/或超声波处理等，也可以是化学方法，如用强酸、强碱、尿素、重金属盐和/或十二烷基硫酸钠(SDS)等处理等，还可以是上述物理或化学方法中两种或两种以上的组合。在本发明的具体实施方式中，变性是加热变性。

优选在本发明第一方面的燕窝肽的制备步骤(2)中，加热的温度为90-100℃，优选为95-100℃，如100℃。

也优选在本发明第一方面的燕窝肽的制备步骤(2)中，加热的时间为30-60分钟，优选为35-50分钟，如40分钟。

本发明第一方面的燕窝肽的制备步骤(3)中粉碎的方法可以是超微粉碎、胶体磨粉碎、破壁粉碎、球磨机粉碎、均质机均质和/或高压均质机的一种或者几种的组合。在本发明的具体实施方式中，粉碎是匀浆。

优选在本发明第一方面的燕窝肽的制备步骤(4)中，调节pH的试剂为酸，优选为醋酸。

也优选在本发明第一方面的燕窝肽的制备步骤(4)中，蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、动物蛋白水解酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶、基质蛋白酶、风味酶中的一种或者两种以上的组合。在本发明的具体实施方式中，蛋白酶是动物蛋白水解酶和/或木瓜蛋白酶。

还优选在本发明第一方面的燕窝肽的制备步骤(4)中，酶解的温度为25-60℃，优选为30-55℃，如50℃。

另外优选在本发明第一方面的燕窝肽的制备步骤(4)中，酶解的时间为1-6小时，优选为2-5小时，如3小时。

优选在本发明第一方面的燕窝肽的制备步骤(5)中，灭酶的温度为80-100℃，优选为85-98℃，如95℃。

也优选在本发明第一方面的燕窝肽的制备步骤(5)中，灭酶的时间为15-60分钟，优选为20-45分钟，如30分钟。

还优选在本发明第一方面的燕窝肽的制备步骤(5)中，过滤的膜孔径为150-200目，优选为180-200目，如200目。

在本文中，任选表示可以选择，也可以不选择。即，本发明第一方面的燕窝肽的制备步骤(6)是可以不被选择进行的，则本发明第一方面的燕窝肽存在于溶液中；也可以选择进行该步骤(6)，使得本发明第一方面的燕窝肽以固体形式存在。

本发明第一方面的燕窝肽的分子粒径微小，分散均匀，主要为含有2-20个氨基酸残基的多肽。优选本发明第一方面的燕窝肽的分子量在200-2500Da之间的小分子肽的含量为70-90％(w/w)，优选为80-90％(w/w)，如为86-88％(w/w)。

在第二方面，本发明提供了药物组合物，其包括本发明第一方面的燕窝肽和药学上可接受的辅料。在本发明的具体实施方式中，本发明第二方面的药物组合物可用于恢复受损的免疫器官，提高巨噬细胞吞噬率。

在本文中，术语“药学上可接受的辅料”包括药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂等，它们与药物活性成分相容。运用药学上可接受的辅料制备药物制剂对本领域普通技术人员来说是公知的。本发明的药物组合物包含本发明第一方面的燕窝肽作为活性成分，将该燕窝肽和药学上可接受的辅剂(如本领域普通技术人员所熟知的载体、赋形剂、稀释剂等)组合在一起，配制成各种制剂，优选为固体制剂和液体制剂，如片剂、丸剂、胶囊(包括持续释放或延迟释释放形式)、粉剂、混悬剂、颗粒剂、酊剂、糖浆剂、乳液剂、悬浮液等剂型以及各种缓释剂型，从而适合各种给药形式，例如口服或经过皮肤等的给药形式，最优选是口服。

在第三方面，本发明提供了保健食品组合物，其包括本发明第一方面的燕窝肽和保健食品中可接受的辅料。在本发明的具体实施方式中，本发明第三方面的保健食品组合物可用于恢复受损的免疫器官，提高巨噬细胞吞噬率。

在本文中，术语“保健食品中可接受的辅料”包括食品上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、调味剂、着色剂、增香剂等，它们与保健食品的保健活性成分相容。本发明第一方面的燕窝肽可以直接加入食品或者食品原料中，例如可以添加在含有或者不含有甜味剂的汤或羹中。

在第四方面，本发明提供了解聚耦合酶解制备燕窝肽的方法，其包括如下步骤：

(1)取干净的燕窝，加水浸泡；

(2)对浸泡过的燕窝进行变性；

(3)将变性后的燕窝进行粉碎；

(4)将粉碎后的燕窝调节pH至6.5-7.5，然后加入蛋白酶，进行酶解；

(5)对酶解产物灭酶，过滤；和

(6)任选对过滤的酶解液进行浓缩、干燥。

优选在本发明第四方面的方法的步骤(1)中，燕窝和水的重量比为1：40-80，优选为1：50-70，如1：60。

也优选在本发明第四方面的方法的步骤(1)中，浸泡的温度为15-30℃，优选为22-26℃，如室温。通常，室温可以是25℃。

还优选在本发明第四方面的方法的步骤(1)中，浸泡的时间为2-6小时，优选为3-5小时，如4小时。

本发明第四方面的方法的步骤(2)中变性的方法可以是物理方法，如加热、加压、脱水、搅拌、振荡、紫外线照射和/或超声波处理等，也可以是化学方法，如用强酸、强碱、尿素、重金属盐和/或十二烷基硫酸钠(SDS)等处理等，还可以是上述物理或化学方法中两种或两种以上的组合。在本发明的具体实施方式中，变性是加热变性。

优选在本发明第四方面的方法的步骤(2)中，加热的温度为90-100℃，优选为95-100℃，如100℃。

也优选在本发明第四方面的方法的步骤(2)中，加热的时间为30-60分钟，优选为35-50分钟，如40分钟。

本发明第四方面的方法的步骤(3)中粉碎的方法可以是超微粉碎、胶体磨粉碎、破壁粉碎、球磨机粉碎、均质机均质和/或高压均质机的一种或者几种的组合。在本发明的具体实施方式中，粉碎是匀浆。

优选在本发明第四方面的方法的步骤(4)中，调节pH的试剂为酸，优选为醋酸。

也优选在本发明第四方面的方法的步骤(4)中，蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、动物蛋白水解酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶、基质蛋白酶、风味酶中的一种或者两种以上的组合。在本发明的具体实施方式中，蛋白酶是动物蛋白水解酶和/或木瓜蛋白酶。

还优选在本发明第四方面的方法的步骤(4)中，酶解的温度为25-60℃，优选为30-55℃，如50℃。

另外优选在本发明第四方面的方法的步骤(4)中，酶解的时间为1-6小时，优选为2-5小时，如3小时。

优选在本发明第四方面的方法的步骤(5)中，灭酶的温度为80-100℃，优选为85-98℃，如95℃。

也优选在本发明第四方面的方法的步骤(5)中，灭酶的时间为15-60分钟，优选为20-45分钟，如30分钟。

还优选在本发明第四方面的方法的步骤(5)中，过滤的膜孔径为150-200目，优选为180-200目，如200目。

在第五方面，本发明提供了本发明第一方面的燕窝肽在制备提高或恢复免疫力的药物或保健食品中的应用。在本发明的具体实施方式中，本发明第一方面的燕窝肽可用于恢复受损的免疫器官，提高巨噬细胞吞噬率，恢复或提高的能力显著优于以传统方法制成的燕窝产品。

优选在本发明第五方面的应用中，药物是本发明第二方面的药物组合物。

也优选在本发明第五方面的应用中，保健食品是本发明第三方面的保健食品组合物。

本发明的有益效果在于：提供了新的燕窝肽，其药用、保健效果确切，能显著提高免疫力，效果显著优于传统方法制备的燕窝产品；该燕窝肽采用解聚耦合酶解制备燕窝肽的方法制备，制备方法易操作，设备投入不大。

为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。

另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明的内容。如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆实验指南(第3版)》(科学出版社)、《微生物学实验(第4版)》(高等教育出版社)以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。

实施例1燕窝肽的示例性制备方法1

称取干燥燕窝(马来西亚白燕)6.5g，清洗干净后加入60倍(相对于干燥燕窝)纯化水室温浸泡4小时。将浸泡过的燕窝连同水置于密闭容器，以100℃沸水浴中加热变性40分钟，然后冷却至50℃。将变性后的燕窝装入匀浆机(MA60型号，可购自OuHor公司)以3000转/秒均质匀浆5分钟。向匀浆的燕窝加入稀盐酸,调节pH至7，然后加入13mg木瓜蛋白酶(20万u/g酶活力，可购自南宁庞博生物工程有限公司)和13mg碱性蛋白酶(20万u/g酶活力，可购自南宁庞博生物工程有限公司)，于50℃恒温摇床酶切3小时。将酶解产物加热至95℃，保持30分钟，使酶失活，然后，过200目滤布除杂，得澄清酶解液。最后，将酶解液浓缩，冷冻干燥得到燕窝肽粉6.1克。

经GPC凝胶渗透色谱检测，所得的燕窝肽粉中分子量在200-2500Da之间的小分子肽的含量为87％。

实施例2燕窝肽的示例性制备方法2

制备方法基本相同于实施例1的方法，所不同的是用13mg动物蛋白水解酶(20万u/g酶活力，可购自南宁庞博生物工程有限公司)代替木瓜蛋白酶进行酶解。最终得到燕窝肽粉6.0克，经检测，所得的燕窝肽粉中分子量在200-2500Da之间的小分子肽的含量为80％。

对比例1无粉碎过程的燕窝肽制备方法

制备方法基本相同于实施例1的方法，所不同的是变性后的燕窝不装入匀浆机，而是冷却至50℃后直接调节pH，加木瓜蛋白酶酶解和碱性蛋白酶，并进行后续步骤。最终得到燕窝肽粉6.0克，经检测，所得的燕窝肽粉中分子量在200-2500Da之间的小分子肽的含量为63％。

对比例2无变性过程的燕窝肽制备方法

制备方法基本相同于实施例1的方法，所不同的是浸泡过的燕窝不进行变性，而是直接装入匀浆机匀浆，并进行后续步骤。最终得到燕窝肽粉6.0克，经检测，所得的燕窝肽粉中分子量在200-2500Da之间的小分子肽的含量为55％。

对比例3燕窝肽的传统制备方法

称取干燥燕窝6.5g，清洗干净后加入60倍(相对于干燥燕窝)纯化水室温浸泡4小时。将浸泡过的燕窝置于密闭容器，以95℃高温炖煮12小时，然后过200目滤布，得澄清过滤液。最后，将过滤液浓缩，冷冻干燥得到燕窝肽粉5.9克。

经GPC凝胶渗透色谱检测，所得的燕窝肽粉中分子量在200-2500Da之间的小分子肽的含量为43％。

效果实施例燕窝肽对小鼠免疫功能的作用

采用根据本发明实施例和对比例制备的燕窝肽，来观察对小鼠免疫功能的作用，具体实验如下：

1，实验方法

取70只昆明小鼠，随机分成如下7组，每组10只，每天灌胃给药如下各组的药物，每天一次，每次0.1ml，连续进行4周：

(1)正常组：生理盐水

(2)模型组：生理盐水

(3)燕窝肽组一：根据本发明实施例1制备的燕窝肽，剂量为20mg/kg

(4)燕窝肽组二：根据本发明实施例2制备的燕窝肽，剂量为20mg/kg

(5)燕窝肽组三：根据本发明对比例1制备的燕窝肽，剂量为20mg/kg

(6)燕窝肽组四：根据本发明对比例2制备的燕窝肽，剂量为20mg/kg

(7)燕窝肽组五：根据本发明对比例3制备的燕窝肽，剂量为20mg/kg。

除正常对照组以外，其余各组小鼠均于首次给药后第21日皮下注射氢化可的松，剂量为15mg/kg，每天一次，连续进行6天。末次给药后，小鼠禁食不禁水12小时，每只小鼠腹腔注射2％鸡红细胞悬液1mL，30min后称重，然后后脱颈椎处死，分别剥离脾脏、胸腺称重，用以计算脾指数和胸腺指数；另外收集腹腔巨噬细胞，进行染色和计数，计算吞噬率。

2，实验结果

各组小鼠的脾指数和胸腺指数的结果如表1所示，其中，模型组的脾指数和胸腺指数均显著低于正常组，表明连续注射氢化可的松会显著减少免疫器官与体重的比值，表明造模成功；按照传统方法的燕窝肽组五能小幅提高脾指数和胸腺指数，然而相对于模型组，这种提高没有显著性；按照本发明方法的燕窝肽组一和组二均能相对于模型组显著提高脾指数和胸腺指数；用不完整的方法的燕窝肽组三和组四提高脾指数和胸腺指数的幅度介于按照传统方法和按照本发明方法之间，提高的胸腺指数显著高于模型组，但是脾指数的提高相对于模型组没有显著性。

表1各药物对小鼠的脾指数和胸腺指数的影响

组别	脾指数	胸腺指数
			正常组	4.43±0.41	1.53±0.37
模型组	3.11±0.30	1.15±0.28
			燕窝肽组一	3.80±0.33	1.91±0.31
燕窝肽组二	3.72±0.36	1.85±0.22
			燕窝肽组三	3.57±0.52	1.69±0.29
燕窝肽组四	3.64±0.55	1.72±0.25
			燕窝肽组五	3.42±0.46	1.59±0.39

结果表明，按照本发明方法制备的燕窝肽能够显著恢复受损的免疫器官；即使省略本发明方法的一部分步骤，其制备的燕窝肽也能显著恢复受损的部分免疫器官，恢复幅度不如本发明方法制备的；而按传统方法制备的燕窝肽虽然从均值上看能恢复，但是群体上没有显示出存在显著的恢复。

各组小鼠的巨噬细胞吞噬率的结果如表2所示，其中，模型组的巨噬细胞吞噬率显著低于正常组，表明连续注射氢化可的松会显著降低巨噬细胞吞噬能力，表明造模成功；无论按照传统方法，用不完整的方法，还是按照本发明方法，所制备的燕窝肽均能相对于模型组显著提高巨噬细胞吞噬率，其中，按照本发明方法的提高幅度最大，而按照传统方法的提高幅度最小。

表2各药物对小鼠的巨噬细胞吞噬能力的影响

组别	巨噬细胞吞噬率(％)
		正常组	33.6±5.1
模型组	24.3±4.7
		燕窝肽组一	42.5±3.9
燕窝肽组二	40.8±2.8
		燕窝肽组三	36.4±3.5
燕窝肽组四	37.5±5.3
		燕窝肽组五	33.4±4.4

结果表明，使用各种方法制备的燕窝肽均能显著提高小鼠的巨噬细胞吞噬能力，促进免疫功能，而按照本发明方法制备的效果最好。

Claims (10)

1.燕窝肽，其通过包括如下步骤的解聚耦合酶解制备方法制备：

(1)取干净的燕窝，加水浸泡；

(2)对浸泡过的燕窝进行变性，优选加热变性；

(3)将变性后的燕窝进行粉碎，优选进行匀浆；

(4)将粉碎后的燕窝调节pH至6.5-7.5，然后加入蛋白酶，进行酶解；

(5)对酶解产物灭酶，过滤；和

(6)任选对过滤的酶解液进行浓缩、干燥。

2.权利要求1所述的燕窝肽，其中，

步骤(1)中的燕窝和水的重量比为1：40-80，优选为1：50-70，如1：60；

步骤(1)中的浸泡的温度为15-30℃，优选为22-26℃，如室温；和/或，

步骤(1)中的浸泡的时间为2-6小时，优选为3-5小时，如4小时。

3.权利要求1所述的燕窝肽，其中，

步骤(2)中的加热的温度为90-100℃，优选为95-100℃，如100℃；和/或，

步骤(2)中的加热的时间为30-60分钟，优选为35-50分钟，如40分钟。

4.权利要求1所述的燕窝肽，其中，

步骤(4)中的调节pH的试剂为酸，优选为醋酸；

步骤(4)中的蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、动物蛋白水解酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶、基质蛋白酶、风味酶中的一种或者两种以上的组合，优选为动物蛋白水解酶和/或木瓜蛋白酶；

步骤(4)中的酶解的温度为25-60℃，优选为30-55℃，如50℃；和/或，

步骤(4)中的酶解的时间为1-6小时，优选为2-5小时，如3小时。

5.权利要求1所述的燕窝肽，其中，

步骤(5)中的灭酶的温度为80-100℃，优选为85-98℃，如95℃；

步骤(5)中的灭酶的时间为15-60分钟，优选为20-45分钟，如30分钟；和/或，

步骤(5)中的过滤的膜孔径为150-200目，优选为180-200目，如200目。

6.权利要求1所述的燕窝肽，其中分子量在200-2500Da之间的小分子肽的含量为70-90％(w/w)，优选为80-90％(w/w)，如为86-88％(w/w)。

7.药物组合物，其包括权利要求1-6之任一所述的燕窝肽和药学上可接受的辅料。

8.保健食品组合物，其包括权利要求1-6之任一所述的燕窝肽和保健食品中可接受的辅料。

9.解聚耦合酶解制备燕窝肽的方法，其包括如下步骤：

(1)取干净的燕窝，加水浸泡；

(2)对浸泡过的燕窝进行变性，优选加热变性；

(3)将变性后的燕窝进行粉碎，优选进行匀浆；

(4)将粉碎后的燕窝调节pH至6.5-7.5，然后加入蛋白酶，进行酶解；

(5)对酶解产物灭酶，过滤；和

(6)任选对过滤的酶解液进行浓缩、干燥。

10.权利要求1-6之任一所述的燕窝肽在制备提高或恢复免疫力的药物或保健食品中的应用。