CN105907826A - 一种植物多肽/蛋白的清洁制备方法 - Google Patents

一种植物多肽/蛋白的清洁制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种分子量区间可控的植物多肽/蛋白的清洁制备方法，包括以下步骤：(1)原料预处理；(2)调浆；(3)提取与分离；(4)净化，得蛋白液；(5)酶解：将上述蛋白液加热变性；加入Na2SO3，再加入蛋白酶；蛋白酶选自：Alcalase碱性蛋白酶，AS1398中性蛋白酶，胃蛋白酶，木瓜蛋白酶；(6)多肽脱苦；(7)用纳滤膜进行分离，得多肽溶液；(8)干燥失水得多肽产品。通过该方法制备得到的产品，分子量区间可控，具有高溶解性、低粘度、酸溶稳定性、低苦味等特性。本发明的产品可被广泛应用于食品、运动食品、疗效保健食品、蛋白饮料、减肥食品、新型发酵食品中。

Description

一种植物多肽/蛋白的清洁制备方法
技术领域
本发明涉及一种植物多肽/蛋白的清洁制备方法，特别涉及一种以玉米、小麦、大豆等为原料，首先经过预处理、分离、纯化制备预备型植物蛋白，然后经现代生物技术、分离技术制备的分子量区间可控的多肽产品的清洁制备方法。
背景技术
肽由2个或2个以上氨基酸脱水缩合而成，是蛋白质机构和功能的片段，并使蛋白质具有各种生理功能，其本身也具有很强的特殊的生理功能。由2个或3个氨基酸脱水缩合而成的，分别成为二肽和三肽，以此类推为四肽、五肽等。一般而言，肽链上氨基酸数目在10以下为寡肽，达到10～50个为多肽，50个以上为蛋白质。多肽是人体自身存在而且必须的活性物质、营养物质，几乎广泛分布于动物及人类全身，特别是大脑，几乎对所用的细胞都有调节作用，如缺失，免疫系统、各功能系统就会发生紊乱。
过去人们认为，动物摄取的蛋白质在消化道内经蛋白酶和肽酶的作用降解为寡肽片段和游离氨基酸，而只有游离氨基酸才能被动物直接吸收利用，寡肽则只有再降解成游离氨基酸才能被利用。但现代营养学研究发现，人类摄食蛋白质经消化道的酶作用后，大多是以2～7个氨基酸组成的寡肽形式被消化吸收的，以游离氨基酸形式吸收的比例很小。进一步的试验又揭示了寡肽比游离氨基酸消化更快、吸收更多，表明肽的生物效价和营养价值比游离氨基酸更高。寡肽有助于肠道吸收，这是因为：肽中氨基酸残基吸收速度大于等量游离氨基酸吸收速度，肽吸收可避免游离氨基酸之间的吸收竞争，间接提高吸收效果，减少不必要的能量消耗，因为吸收一个寡肽所消耗的动能等同于吸收多个氨基酸所需的动能。因此寡肽较易吸收，且不受氨基酸的影响，因此，当动物由于疾病或其他因素对某种氨基酸不能很好吸收时，可通过添加含有此种氨基酸的寡肽来提供氨基酸。寡肽的这种吸收优势具有很大的潜在的营养作用。近年来，天然药物、自然疗法己开始被西方社会认识。美国FDA 1999年开始允许大豆蛋白制品标注“预防心血管疾病的功能”，这就意味着健康与保健品将被人类社会重新认识。
功能性植物多肽是将大分子植物蛋白质(植物蛋白由于溶解度低，无法作为功能性成分在乳品、饮料、糖果等食品体系中加以利用；而且，有些植物蛋白具有一定的抗原性，再加上植物蛋白质的消化率和生物效价远不及牛奶、鸡蛋等动物性蛋白，这大大限制了植物蛋白的利用范围)利用现代生物技术切割成小分子片段，以产生原植物蛋白所不具有的生物调节功能，一方面供人体生长发育所需的营养物质，促进人体对蛋白质、维生素及微量元素的吸收；另一方面发挥其特有的生理学功能，如：降低血脂、延缓衰老、美体养颜、抗氧化、抗忧郁、改善睡眠、增强记忆、抑制肿瘤等。现已广泛的应用于医药、保健、食品、化妆品等行业。
目前，市场上的植物多肽产品，平均分子量较大，特定区间分子量占比不可控，而不同分子量多肽的作用机理、作用效果不同，所以其发挥作用的可控性较差。因此，尚有改进的必要。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种分子量区间可控的植物多肽/蛋白的清洁制备方法，通过该方法制备得到的产品，分子量区间可控，具有高溶解性、低粘度、酸溶稳定性、低苦味等特性；在营养及生理功能方面，具有易消化吸收、低抗原性、加速肌肉恢复疲劳、促进脂肪代谢、降低胆固醇、防治肝性脑病、辐射保护作用、强抗氧化性以及降血压等生理功能。本发明的产品可被广泛应用于食品、运动食品、疗效保健食品、蛋白饮料、减肥食品、新型发酵食品中。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种分子量区间可控的植物多肽/蛋白的清洁制备方法，包括以下步骤：
(1)原料预处理：取原料(选自大豆粕、花生粕、玉米黄粉、小麦胚芽)，进行超声波预处理300～800秒，然后粉碎，过10～100目筛，备用；
(2)调浆：在搅拌条件下，将上述粉碎过筛的原料缓慢加入pH值为9～10的碱溶液中，控制固液比为1:5～15(质量比)，得浆液；
所述碱溶液选自氢氧化钠溶液、氢氧化钙溶液或/和氨水；
(3)提取与分离：在搅拌条件下，将上述浆液升温至40～70℃，反应1～5h，以充分浸提，使蛋白充分溶出；反应后，固液分离(过滤)，得上清液，备用；所得固态物质，干燥后可作为高纤维副产品，用于制备食品或饲料产品；
(4)净化：调节上述上清液的pH至3～5(用酸调节，可以是盐酸、硫酸、乙酸等)，静置(使蛋白质充分絮凝)，然后固液分离，得到粗蛋白，用95％(体积百分数)乙醇溶液洗涤两次，以除去醇溶性物质，然后再用水洗至中性，得质量浓度为5％～20％的中性蛋白液(可直接负压干燥制备得植物蛋白质产品)；
(5)酶解：将上述蛋白液加热至80℃～100℃，变性10min～30min；然后，加入0.1％的Na2SO3(按干物质计)，搅拌均匀，再加入蛋白酶(蛋白酶的加入量为粗蛋白质量的1％～5％)，在30～70℃下酶解3～24h，得水解液；
所述蛋白酶选自以下蛋白酶中的一种或任几种：Alcalase碱性蛋白酶(可购自Novo公司)，AS1398中性蛋白酶(可购自Novo公司)，胃蛋白酶(可购自Sigma公司)，木瓜蛋白酶(可购自河南郑州酶制剂厂)；
(6)多肽脱苦：上述水解液，在25～30℃条件下，通过活性碳柱，或直接加入活性炭(活性炭的用量为多肽质量的30％～50％)，活性炭脱色后固液分离，再加入β-环糊精(用量为多肽质量的6％～10％)，进行脱苦处理，得无苦味水解液；
优选的，所述活性碳柱的规格为直径0.5米，高3.5米活性碳柱，控制流速为0.5方/小时；
(7)上述无苦味水解液，用纳滤膜进行分离(操作压力为10～500psi)，得多肽，调整纳滤膜的截留分子量，可得到不同分子量区间的产品，比如：通过调整纳滤膜的截留分子量，可得到以下液体产品：
①具有高ACE活性抑制率产品：多肽相对分子质量为628.7，氨基酸序列为Tyr-Gly-Asn-Leu-Tyr。
②具有高清除.OH的多肽产品：以相对分子质量为268的二或三肽为主,并含有少量相对分质量为670的组分，主要由Ser、Gly、Tyr、Phe和Ile组成。
③具有抗氧化功能的玉米多肽产品：分子量分布在1000Da以下，主要集中在500～600Da左右，富含Glu、Ala、Leu和Pro。
④分子量2000Da以下的大豆肽，具有较强的抗氧化活性，试验确认具有抗氧化活性的大豆肽的主要分子量在1100Da左右。
(8)上述液体产品，经过冷冻干燥、负压干燥等方式失水得产品，产品纯度较产品质量标准GB/T22492-2008要求蛋白含量(90％)提高5％～10％，肽含量(80％)提高15％～20％；较质量标准QB/T4707-2014要求蛋白含量(80％)提高10％～15％，肽含量(70％)提20％～30％。国家标准和行业标准基于目前市场产品制定，总体体现和代表了传统市场流通产品的质量水平，本发明的产品的纯度明显高于国家标准和行业标准，产品的质量水平更高。
植物多肽ACE活性的测定方法为：样品溶于超纯水，离心(7200×g,15min)，取上清液进行ACE抑制活性测定。取10μL样品和40μL2.17mmol/L底物(hippuryl-L-His-L-Leu溶于pH8.30.05mol/L硼酸缓冲液，其中含0.3mol/LNaCl)于37℃保温6min，加入20μLACE(0.1U溶于1.0mL相同的缓冲液中)，37℃下反应30min后，加入80μL 1mol/L的HCI溶液终止反应，至室温取10μL反应产物进样，通过RP-HPLC洗脱图谱测定马尿酸生成量，以马尿酸的生成量来判断样品对ACE活性的抑制作用，同时做空白对照。
色谱条件：
HPLC系统：HEWLETT PACKARD SERIES1050；
色谱柱：Symmetry C183.9mm×l50mm PN；
流速：1.0mL/min；
检测波长：228nm；
进样量：10μL；
柱温：30℃；
流动相：12％乙腈(含0.5％乙酸)。
本发明的分子量区间可控的植物多肽/蛋白的清洁制备方法，具有以下优点：
(1)利用“碱溶酸沉”法制备出高含量的植物蛋白，为提取植物活性肽提供高品质的原料。
(2)采用纳滤分离技术，实现了对特殊功效分子量区间产品的有效控制。
(3)采用活性炭柱的方式，提高了生产效率，实现了工序的连续运行，和β-环糊精搭配使用，使脱苦效果提高，增加了植物多肽的使用范围。
利用本发明的方法制备得到的产品，分子量区间可控，具有高溶解性、低粘度、酸溶稳定性、低苦味等特性；在营养及生理功能方面，具有易消化吸收、低抗原性、加速肌肉恢复疲劳、促进脂肪代谢、降低胆固醇、防治肝性脑病、辐射保护作用、强抗氧化性以及降血压等生理功能。本发明的产品可被广泛应用于食品、运动食品、疗效保健食品、蛋白饮料、减肥食品、新型发酵食品中。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1以大豆粕为原料制备植物多肽
步骤如下：
(1)原料预处理：首先对大豆粕进行检测，保证无腐败发霉现象，然后，进行超声波预处理360秒，然后粉碎，过60目筛，备用。
(2)调浆：在搅拌条件下，将上述粉碎过筛的原料缓慢加入pH值为9.5的氢氧化钠溶液中，固液比为1:10(质量比)。
(3)提取与分离：在搅拌条件下，升温至55±2℃，反应2.5h，以充分浸提；反应后，固液分离，得上清液，备用。
(4)净化：调节上述上清液的pH至5，静置以使蛋白质充分絮凝，然后固液分离，得到粗蛋白，用95％乙醇溶液洗涤2次，除去醇溶性物质，水洗至中性，配制得质量浓度为12.5％的中性蛋白液。
(5)酶解：上述蛋白液加热至90℃，变性25min，然后加入0.1％Na2SO3预处理；然后，再加入质量分数为1.5％的碱性蛋白酶(Alcalase碱性蛋白酶，购自Novo公司)，60℃下酶解3h，得水解液。
(6)多肽脱苦：上述水解液，经过28℃活性碳柱(直径0.5米，高3.5米，控制流速为0.5方/小时)，再加入2％β-环糊精(按多肽含量计)进行脱苦处理(40℃，25min)；得无苦味水解液。
(7)上述无苦味水解液，过纳滤膜系统：一号膜孔径为2000，二号膜孔径为1000；操作压强为60pis；膜分离后干燥得到产品：过一号膜前为产品A；过一号膜后、二号膜前产品为B；过二号膜后产品为C，产品A、B、C的情况如表1所示：产品A与质量标准(GB/T2249-2008)要求粗蛋白(90％)肽含量(80％)相当，产品B较标准粗蛋白含量提高5.5％，肽含量提高16％；产品C较标准粗蛋白含量提高8.8％，肽含量提高18.7％。
表1
粗蛋白％ 肽含量％ 肽相对分子质量 突出功效 富含氨基酸
产品A 91.5 81 3000
产品B 95 93 1400 抗氧化性
产品C 98 95 550 抗氧化性 Gul、Ala、Leu
实施例2以花生粕为原料制备植物多肽
步骤如下：
(1)原料预处理：首先对花生粕进行检测，保证无腐败发霉现象，然后，进行超声波预处理600秒，然后粉碎，过80目筛，备用。
(2)调浆：在搅拌条件下，将上述粉碎过筛的原料缓慢加入pH值为9.5的碱溶液氢氧化钠溶液中，固液比为1:12(质量比)。
(3)提取与分离：在搅拌条件下，升温至55±2℃，反应3h，以充分浸提；反应后，固液分离，得上清液，备用。
(4)净化：调节上述上清液的pH至4.5，静置以使蛋白质充分絮凝，然后固液分离，得到粗蛋白，用95％乙醇溶液洗涤2次，除去醇溶性物质，水洗至中性，配制得质量浓度为15％的中性蛋白液。
(5)酶解：上述蛋白液加热至80℃，变性30min，然后加入0.1％Na2SO3预处理；然后，再加入质量分数为3％的碱性蛋白酶，60℃下酶解3h，得水解液。
(6)多肽脱苦：上述水解液，先用35％粉末状活性炭(按多肽含量计)25℃下吸附40min，抽滤去除活性炭，再加入2％β-环糊精(按多肽含量计)进行脱苦处理(40℃，25min)；得无苦味水解液。
(7)上述无苦味水解液，过纳滤膜系统：一号膜孔径为2000，二号膜孔径为1000；操作压强为60pis；膜分离后干燥得到产品：过一号膜前为产品A；过一号膜后、二号膜前产品为B；过二号膜后产品为C，产品A、B、C的情况如表2所示：产品A与质量标准(GB/T2249-2008)要求粗蛋白(90％)肽含量(80％)相当，产品B较标准粗蛋白含量提高6.7％，肽含量提高16.3％；产品C较标准粗蛋白含量提高10％，肽含量提高21.25％。
表2
粗蛋白％ 肽含量％ 肽相对分子质量 突出功效 富含氨基酸
产品A 90.3 80.5 3000
产品B 96 93 1400 抗氧化性
产品C 99 97 550 高ACE活性抑制率 Try、Gul、Asn
实施例3以玉米黄粉为原料制备植物多肽
步骤如下：
(1)原料预处理：首先对玉米黄粉进行检测，保证无腐败发霉现象，然后，进行超声波预处理380秒，然后粉碎，过100目筛，备用。
(2)调浆：在搅拌条件下，将上述粉碎过筛的原料缓慢加入pH值为9.5的氢氧化钠溶液中，固液比为1:8(质量比)。
(3)提取与分离：在搅拌条件下，升温至55±2℃，反应3h，以充分浸提；反应后，固液分离，得上清液，备用。
(4)净化：调节上述上清液的pH至4.5，静置以使蛋白质充分絮凝，然后固液分离，得到粗蛋白，用95％乙醇溶液洗涤2次，除去醇溶性物质，水洗至中性，配制得质量浓度为％的中性蛋白液。
(5)酶解：上述蛋白液加热至80℃，变性30min，然后加入0.1％Na2SO3预处理；然后，再加入质量分数为3％的碱性蛋白酶，60℃下酶解3h，得水解液。
(6)多肽脱苦：上述水解液，先过30℃活性炭柱(直径0.5米，高3.5米，控制流速为0.5方/小时)，再加入2％β-环糊精(按多肽含量计)进行脱苦处理(40℃，25min)；得无苦味水解液。
(7)上述无苦味水解液，过纳滤膜系统：一号膜孔径为2000，二号膜孔径为1000；操作压强为60pis；膜分离后干燥得到产品：过一号膜前为产品A；过一号膜后、二号膜前产品为B；过二号膜后产品为C，产品A、B、C的情况如表3所示：产品A与质量标准(QB/T4707-2014)要求粗蛋白(80％)肽含量(70％)相当，产品B较标准粗蛋白含量提高12.5％，肽含量提高6.3％；产品C较标准粗蛋白含量提高15％，肽含量提高30％。
表3
粗蛋白％ 肽含量％ 肽相对分子质量 突出功效 富含氨基酸
产品A 80.5 71 3500
产品B 90 85 1600 抗氧化性
产品C 92 91 580 抗氧化性 Gul、Ala、Leu、
实施例4以小麦胚芽为原料制备植物多肽
步骤如下：
(1)原料预处理：首先对小麦胚芽进行检测，保证无腐败发霉现象，然后，进行超声波预处理500秒，然后粉碎，过80目筛，备用。
(2)调浆：在搅拌条件下，将上述粉碎过筛的原料缓慢加入pH值为9.5的氢氧化钠溶液中，固液比为1:11(质量比)。
(3)提取与分离：在搅拌条件下，升温至60±2℃，反应3.5h，以充分浸提；反应后，固液分离，得上清液，备用。
(4)净化：调节上述上清液的pH至5，静置以使蛋白质充分絮凝，然后固液分离，得到粗蛋白，用95％乙醇溶液洗涤2次，除去醇溶性物质，水洗至中性，配制得质量浓度为1％的中性蛋白液。
(5)酶解：上述蛋白液加热至90℃，变性25min，然后加入0.1％Na2SO3预处理；然后，再加入质量分数为1.5％的碱性蛋白酶，60℃下酶解3h，得水解液。
(6)多肽脱苦：上述水解液，先用40％粉末状活性炭(按多肽含量计)25℃下吸附60min，抽滤去除活性炭，再加入2％β-环糊精(按多肽含量计)进行脱苦处理(40℃，25min)；得无苦味水解液。
(7)上述无苦味水解液，过纳滤膜系统：一号膜孔径为2000，二号膜孔径为1000；操作压强为60pis；膜分离后干燥得到产品：过一号膜前为产品A；过一号膜后、二号膜前产品为B；过二号膜后产品为C，产品A、B、C的情况如表4所示：产品A与质量标准(GB/T2249-2008)要求粗蛋白(90％)肽含量(80％)相当，产品B较标准粗蛋白含量提高5.5％，肽含量提高16.3％；产品C较标准粗蛋白含量提高8.9％，肽含量提高17.8％。
表4

Claims (6)

1.一种分子量区间可控的植物多肽/蛋白的清洁制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)原料预处理：取原料，进行超声波预处理300～800秒，然后粉碎，过10～100目筛，备用；所述原料选自大豆粕、花生粕、玉米黄粉或/和小麦胚芽；
(2)调浆：在搅拌条件下，将上述粉碎过筛的原料加入pH值为9～10的碱溶液中，控制固液比为1:5～15，得浆液；
所述碱溶液选自氢氧化钠溶液、氢氧化钙溶液或/和氨水；
(3)提取与分离：在搅拌条件下，将上述浆液升温至40～70℃，反应1～5h；反应后，固液分离，得上清液，备用；
(4)净化：调节上述上清液的pH至3～5，静置使蛋白质充分絮凝，然后固液分离，得到粗蛋白，用95％乙醇溶液洗涤两次，然后再用水洗至中性，得蛋白液；
(5)酶解：将上述蛋白液加热至80℃～100℃，变性10min～30min；然后，加入0.1％的Na2SO3，搅拌均匀，再加入蛋白酶，在30～70℃下酶解3～24h，得水解液；
所述蛋白酶选自以下蛋白酶中的一种或任几种：Alcalase碱性蛋白酶，AS1398中性蛋白酶，胃蛋白酶，木瓜蛋白酶；
(6)多肽脱苦：上述水解液，在25～30℃条件下，通过活性碳柱，或直接加入活性炭，活性炭脱色后固液分离，再加入β-环糊精，进行脱苦处理，得无苦味水解液；
(7)上述无苦味水解液，用纳滤膜进行分离，操作压力为10～500psi，得多肽溶液；
(8)上述多肽溶液，经干燥失水得多肽产品。
2.根据权利要求1所述的分子量区间可控的植物多肽/蛋白的清洁制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中，蛋白酶的加入量为粗蛋白质量的1％～5％。
3.根据权利要求1所述的分子量区间可控的植物多肽/蛋白的清洁制备方法，其特征在于：所述步骤(6)中，活性炭的用量为多肽质量的30％～50％，β-环糊精的用量为多肽质量的6％～10％。
4.根据权利要求1所述的分子量区间可控的植物多肽/蛋白的清洁制备方法，其特征在于：所述步骤(6)中，活性碳柱的规格为直径0.5米，高3.5米活性碳柱，控制流速为0.5方/小时。
5.利用权利要求1～4中任一项所述的分子量区间可控的植物多肽/蛋白的清洁制备方法制备得到的多肽产品或蛋白产品。
6.根据权利要求6所述的多肽产品，其特征在于：所得多肽产品包括以下产品：
①具有高ACE活性抑制率产品：多肽相对分子质量为628.7，氨基酸序列为Tyr-Gly-Asn-Leu-Tyr；
②具有高清除.OH的多肽产品：以相对分子质量为268的二或三肽为主,并含有少量相对分质量为670的组分，主要由Ser、Gly、Tyr、Phe和Ile组成；
③具有抗氧化功能的玉米多肽产品：分子量分布在1000Da以下，主要集中在500～600Da左右，富含Glu、Ala、Leu和Pro；
④分子量2000Da以下的大豆肽。
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