CN108949887A - 一种大豆多功能降糖肽的制备方法 - Google Patents

一种大豆多功能降糖肽的制备方法 Download PDF

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Abstract

为了扩大大豆的应用范围，提升其药食两用价值，本发明记载了一种大豆多功能降糖肽的制备方法，包括以下步骤：将大豆除杂并磨粉，并提取大豆分离蛋白；将大豆分离蛋白用去离子水配制成浓度为2‑5％(w/v)的溶液，搅拌均匀，沸水浴保温10‑15min，冷却至室温；并调节溶液pH和温度至蛋白水解酶的最适pH和最适温度，加入蛋白水解酶使E/S为6000U/g。在蛋白质水解过程中，滴加NaOH溶液，维持pH值恒定在初始pH值处，直至反应到终点，并记录消耗的NaOH的体积，计算蛋白质的水解度；水解度达到平稳后，迅速将反应体系置于沸水中加热8‑20min灭酶后冷却至室温，离心收集上清液，冷冻干燥得到大豆多功能降糖肽。本发明属于多肽制备领域，具有降低血糖和降血压的作用和抗氧化活性。

Description

一种大豆多功能降糖肽的制备方法
技术领域
本发明属于多肽制备领域，具体而言，涉及一种大豆多功能降糖肽的制备方法。
背景技术
糖尿病被称为健康杀手，对人体造成很大的威胁。目前对糖尿病只能治疗，未能治愈，糖尿病患者长期高血糖会引起一系列并发症，慢性心血管疾病、慢性肾衰竭及视网膜损伤等而丧失生命。据统计73.6％糖尿病患者患有高血压病症，且机体的氧化对糖尿病患者病情的恶化起到了促进作用。
研究表明，通过抑制体内产生的促进葡萄糖吸收的酶(α-葡萄糖苷酶和DPP-IV酶)，可间接阻止葡萄糖进入血液循环而引起高血糖。酶的抑制源于生物反应，因而目标聚集在天然动植物蛋白中的生物活肽，这种小肽相比于原蛋白质具有多种生物活性，无复杂空间结构，理化性质稳定，且分子链段小，易于人体吸收，为治疗糖尿病提供了安全、有效的新途径。
相比于成本价格高昂，有严重副作用或毒性的合成试剂，探索天然和安全的抗糖尿病药物才是治疗Ⅱ型糖尿病的有效途径之一。生物体内存在着种类繁多的能够调节机体正常生命活动或者具有一些较为特殊的生理活性的肽段，选用恰当的蛋白酶对其水解，一些存在于蛋白质长链中的未处于活性状态的生物活性肽就会得以释放。活性肽分子量偏小且化学结构特别，可以与某些引发重要疾病的调节酶的活性位点内的氨基酸作用，产生抑制效果。例如抑制α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、抑制血管紧张素转换酶(ACE)、抑制二肽基肽酶IV(DPP-IV)。
我国是大豆的故乡，已有5000年的种植历史，大豆中富含蛋白质，含量高达40％，还含有卵磷脂等促进脑部发育的有效成分，具有极高的营养价值和应用价值。水解大豆得到的活性肽所含必需氨基酸与大豆蛋白质完全一致，且含量丰富，更适于人体的消化吸收机制；对比大豆蛋白质，活性肽各种理化及生理性质优势更为突出；但目前存在对大豆提取物化学成分研究相对单一、制备过程复杂、产物溶解性低的问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种大豆多功能降糖肽的制备方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种大豆多功能降糖肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：将大豆除杂并磨粉，得到大豆粉，利用大豆粉提取大豆分离蛋白；
步骤二：将大豆分离蛋白用去离子水配制成浓度为2-5％(w/v，质量/体积)的溶液，充分搅拌均匀后，沸水浴保温10-15min，冷却至室温，得到大豆分离蛋白溶液；
步骤三：调节大豆分离蛋白溶液的pH值和温度至蛋白水解酶的最适pH值和最适温度，加入一定量的蛋白水解酶，使E/S为6000U/g；
步骤四：在蛋白质水解过程中，分别在反应的不同时刻，向反应体系中滴加NaOH溶液，维持pH值恒定在初始pH值处，直至pH恒定，即达到反应终点，并记录不同时刻消耗的NaOH的体积，计算蛋白质的水解度；水解度达到平稳后，迅速将反应体系置于沸水中加热8-20min灭酶，后冷却至室温，离心收集上清液，冷冻干燥得到大豆多功能降糖肽。
进一步的，在步骤一中，大豆分离蛋白的提取方法采用碱提酸沉法。
优选的，在步骤二中，所述蛋白水解酶为碱性蛋白酶，所述碱性蛋白酶的最适pH值为9.0-11.0，最适温度为40-60℃，酶解时间为6-10h。
优选的，在步骤二中，所述蛋白水解酶为胰蛋白酶，所述胰蛋白酶的最适pH值为6.0-8.0，最适温度为40-60℃，酶解时间为6-10h。
优选的，在步骤二中，所述蛋白水解酶为木瓜蛋白酶，所述木瓜蛋白酶的最适pH值6.0-9.0，最适温度为50-70℃，酶解时间为6-10h。
进一步的，在步骤四中，所述NaOH溶液的浓度为0.5mol/L。
进一步的，所述大豆多功能降糖肽具有α-葡萄糖苷酶和二肽基肽酶IV抑制活性，以及血管紧张素转换酶的抑制活性，在降低血糖的同时，还具有降压的作用和抗氧化活性。
本发明相对于现有技术的有益效果是：
本发明记载了一种简便可行的大豆多功能降糖肽的制备方法，其制备工艺单纯，操作条件温和，最大程度的保留了大豆降糖肽的降糖活性，保证了产品的安全性；本发明的制备过程操作简便，成本低，适合工业化生产。
本发明制备的大豆多功能降糖肽具有较高的安全性、同时具有降压及抗氧化活性以及良好的胃肠稳定性和良好的降糖活性，可以作为天然降糖药物及保健品，很好的用于药品及食品行业；极大的丰富了大豆有效成分的研究范围，提升了其药食两用价值。
附图说明
图1为大豆多功能降糖肽的浓度对α-葡萄糖苷酶抑制率的影响图；
图2为不同浓度大豆多功能降糖肽自由基捕获能力图和总还原能力图；
图3为大豆多功能降糖肽在不同的消化过程中对降血糖活性酶的抑制率影响图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做详细的介绍。
具体实施方式一：本实施方式披露了一种大豆多功能降糖肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：将大豆除杂并磨粉，得到大豆粉，采用碱提酸沉法提取大豆分离蛋白；
步骤二：将大豆分离蛋白用去离子水配制成浓度为2-5％(w/v，质量/体积)的溶液，充分搅拌均匀后，沸水浴保温10-15min，冷却至室温，得到大豆分离蛋白溶液；
步骤三：调节大豆分离蛋白溶液的pH值为9.0-11.0，温度为40-60℃，加入一定量的碱性蛋白酶，使E/S为6000U/g，酶解时间为6-10h；
步骤四：在蛋白质水解过程中，分别在反应的不同时刻，向反应体系中滴加0.5mol/L的NaOH溶液，维持pH值恒定在初始pH值处，直至pH恒定，即达到反应终点，并记录不同时刻消耗的NaOH的体积，计算蛋白质的水解度；水解度达到平稳后，迅速将反应体系置于沸水中加热8-20min灭酶，后冷却至室温，离心收集上清液，冷冻干燥得到大豆多功能降糖肽。
具体实施方式二：本实施方式披露了一种大豆多功能降糖肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：将大豆除杂并磨粉，得到大豆粉，采用碱提酸沉法提取大豆分离蛋白；
步骤二：将大豆分离蛋白用去离子水配制成浓度为2-5％(w/v，质量/体积)的溶液，充分搅拌均匀后，沸水浴保温10-15min，冷却至室温，得到大豆分离蛋白溶液；
步骤三：调节大豆分离蛋白溶液的pH值为6.0-8.0，温度为40-60℃，加入一定量的胰蛋白酶，使E/S为6000U/g，酶解时间为6-10h；
步骤四：在蛋白质水解过程中，分别在反应的不同时刻，向反应体系中滴加0.5mol/L的NaOH溶液，维持pH值恒定在初始pH值处，直至pH恒定，即达到反应终点，并记录不同时刻消耗的NaOH的体积，计算蛋白质的水解度；水解度达到平稳后，迅速将反应体系置于沸水中加热8-20min灭酶，后冷却至室温，离心收集上清液，冷冻干燥得到大豆多功能降糖肽。
具体实施方式三：本实施方式披露了一种大豆多功能降糖肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：将大豆除杂并磨粉，得到大豆粉，采用碱提酸沉法提取大豆分离蛋白；
步骤二：将大豆分离蛋白用去离子水配制成浓度为2-5％(w/v，质量/体积)的溶液，充分搅拌均匀后，沸水浴保温10-15min，冷却至室温，得到大豆分离蛋白溶液；
步骤三：调节大豆分离蛋白溶液的pH值为6.0-9.0，温度为50-70℃，加入一定量的木瓜蛋白酶，使E/S为6000U/g，酶解时间为6-10h；
步骤四：在蛋白质水解过程中，分别在反应的不同时刻，向反应体系中滴加0.5mol/L的NaOH溶液，维持pH值恒定在初始pH值处，直至pH恒定，即达到反应终点，并记录不同时刻消耗的NaOH的体积，计算蛋白质的水解度；水解度达到平稳后，迅速将反应体系置于沸水中加热8-20min灭酶，后冷却至室温，离心收集上清液，冷冻干燥得到大豆多功能降糖肽。
具体实施方式四：本实施方式披露了一种大豆多功能降糖肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：将大豆除杂并磨粉，得到大豆粉，采用碱提酸沉法提取大豆分离蛋白；
步骤二：将大豆分离蛋白用去离子水配制成浓度为2％(w/v，质量/体积)的溶液，充分搅拌均匀后，沸水浴保温10min，冷却至室温，得到大豆分离蛋白溶液；
步骤三：调节大豆分离蛋白溶液的pH值为9，温度为60℃，加入一定量的碱性蛋白酶，使E/S(酶/底物)为6000U/g，酶解时间为10h；
步骤四：在蛋白质水解过程中，分别在反应的不同时刻，向反应体系中滴加0.5mol/LNaOH溶液，维持pH值恒定在初始pH值处，直至pH恒定，即达到反应终点，并记录不同时刻消耗的NaOH的体积，计算蛋白质的水解度；水解度达到平稳后，迅速将反应体系置于沸水中加热20min灭酶，后冷却至室温，离心收集上清液，冷冻干燥得到大豆多功能降糖肽。
具体实施方式五：本实施方式披露了一种大豆多功能降糖肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：将大豆除杂并磨粉，得到大豆粉，采用碱提酸沉法提取大豆分离蛋白；
步骤二：将大豆分离蛋白用去离子水配制成浓度为5％(w/v，质量/体积)的溶液，充分搅拌均匀后，沸水浴保温15min，冷却至室温，得到大豆分离蛋白溶液；
步骤三：调节大豆分离蛋白溶液的pH值为11，温度为40℃，加入一定量的碱性蛋白酶，使E/S(酶/底物)为6000U/g，酶解时间为6h；
步骤四：在蛋白质水解过程中，分别在反应的不同时刻，向反应体系中滴加0.5mol/LNaOH溶液，维持pH值恒定在初始pH值处，直至pH恒定，即达到反应终点，并记录不同时刻消耗的NaOH的体积，计算蛋白质的水解度；水解度达到平稳后，迅速将反应体系置于沸水中加热8min灭酶，后冷却至室温，离心收集上清液，冷冻干燥得到大豆多功能降糖肽。
具体实施方式六：本实施方式披露了一种大豆多功能降糖肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：将大豆除杂并磨粉，得到大豆粉，采用碱提酸沉法提取大豆分离蛋白；
步骤二：将大豆分离蛋白用去离子水配制成浓度为4％(w/v，质量/体积)的溶液，充分搅拌均匀后，沸水浴保温13min，冷却至室温，得到大豆分离蛋白溶液；
步骤三：调节大豆分离蛋白溶液的pH值为10，温度为50℃，加入一定量的碱性蛋白酶，使E/S(酶/底物)为6000U/g，酶解时间为8h；
步骤四：在蛋白质水解过程中，分别在反应的不同时刻，向反应体系中滴加0.5mol/LNaOH溶液，维持pH值恒定在初始pH值处，直至pH恒定，即达到反应终点，并记录不同时刻消耗的NaOH的体积，计算蛋白质的水解度；水解度达到平稳后，迅速将反应体系置于沸水中加热15min灭酶，后冷却至室温，离心收集上清液，冷冻干燥得到大豆多功能降糖肽。
具体实施方式七：本实施方式披露了一种大豆多功能降糖肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：将大豆除杂并磨粉，得到大豆粉，采用碱提酸沉法提取大豆分离蛋白；
步骤二：将大豆分离蛋白用去离子水配制成浓度为2％(w/v，质量/体积)的溶液，充分搅拌均匀后，沸水浴保温10min，冷却至室温，得到大豆分离蛋白溶液；
步骤三：调节大豆分离蛋白溶液的pH值为6，温度为60℃，加入一定量的胰蛋白酶，使E/S(酶/底物)为6000U/g，酶解时间为6h；
步骤四：在蛋白质水解过程中，分别在反应的不同时刻，向反应体系中滴加0.5mol/LNaOH溶液，维持pH值恒定在初始pH值处，直至pH恒定，即达到反应终点，并记录不同时刻消耗的NaOH的体积，计算蛋白质的水解度；水解度达到平稳后，迅速将反应体系置于沸水中加热20min灭酶，后冷却至室温，离心收集上清液，冷冻干燥得到大豆多功能降糖肽。
具体实施方式八：本实施方式披露了一种大豆多功能降糖肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：将大豆除杂并磨粉，得到大豆粉，采用碱提酸沉法提取大豆分离蛋白；
步骤二：将大豆分离蛋白用去离子水配制成浓度为5％(w/v，质量/体积)的溶液，充分搅拌均匀后，沸水浴保温15min，冷却至室温，得到大豆分离蛋白溶液；
步骤三：调节大豆分离蛋白溶液的pH值为8，温度为40℃，加入一定量的胰蛋白酶，使E/S(酶/底物)为6000U/g，酶解时间为10h；
步骤四：在蛋白质水解过程中，分别在反应的不同时刻，向反应体系中滴加0.5mol/LNaOH溶液，维持pH值恒定在初始pH值处，直至pH恒定，即达到反应终点，并记录不同时刻消耗的NaOH的体积，计算蛋白质的水解度；水解度达到平稳后，迅速将反应体系置于沸水中加热8min灭酶，后冷却至室温，离心收集上清液，冷冻干燥得到大豆多功能降糖肽。
具体实施方式九：本实施方式披露了一种大豆多功能降糖肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：将大豆除杂并磨粉，得到大豆粉，采用碱提酸沉法提取大豆分离蛋白；
步骤二：将大豆分离蛋白用去离子水配制成浓度为3％(w/v，质量/体积)的溶液，充分搅拌均匀后，沸水浴保温12min，冷却至室温，得到大豆分离蛋白溶液；
步骤三：调节大豆分离蛋白溶液的pH值为7，温度为50℃，加入一定量的胰蛋白酶，使E/S(酶/底物)为6000U/g，酶解时间为8h；
步骤四：在蛋白质水解过程中，分别在反应的不同时刻，向反应体系中滴加0.5mol/LNaOH溶液，维持pH值恒定在初始pH值处，直至pH恒定，即达到反应终点，并记录不同时刻消耗的NaOH的体积，计算蛋白质的水解度；水解度达到平稳后，迅速将反应体系置于沸水中加16min灭酶，后冷却至室温，离心收集上清液，冷冻干燥得到大豆多功能降糖肽。
具体实施方式十：本实施方式披露了一种大豆多功能降糖肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：将大豆除杂并磨粉，得到大豆粉，采用碱提酸沉法提取大豆分离蛋白；
步骤二：将大豆分离蛋白用去离子水配制成浓度为2％(w/v，质量/体积)的溶液，充分搅拌均匀后，沸水浴保温10min，冷却至室温，得到大豆分离蛋白溶液；
步骤三：调节大豆分离蛋白溶液的pH值为9，温度为50℃，加入一定量的木瓜蛋白酶，使E/S(酶/底物)为6000U/g，酶解时间为6h；
步骤四：在蛋白质水解过程中，分别在反应的不同时刻，向反应体系中滴加0.5mol/LNaOH溶液，维持pH值恒定在初始pH值处，直至pH恒定，即达到反应终点，并记录不同时刻消耗的NaOH的体积，计算蛋白质的水解度；水解度达到平稳后，迅速将反应体系置于沸水中加8min灭酶，后冷却至室温，离心收集上清液，冷冻干燥得到大豆多功能降糖肽。
具体实施方式十一：本实施方式披露了一种大豆多功能降糖肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：将大豆除杂并磨粉，得到大豆粉，采用碱提酸沉法提取大豆分离蛋白；
步骤二：将大豆分离蛋白用去离子水配制成浓度为5％(w/v，质量/体积)的溶液，充分搅拌均匀后，沸水浴保温15min，冷却至室温，得到大豆分离蛋白溶液；
步骤三：调节大豆分离蛋白溶液的pH值为6，温度为70℃，加入一定量的木瓜蛋白酶，使E/S(酶/底物)为6000U/g，酶解时间为10h；
步骤四：在蛋白质水解过程中，分别在反应的不同时刻，向反应体系中滴加0.5mol/LNaOH溶液，维持pH值恒定在初始pH值处，直至pH恒定，即达到反应终点，并记录不同时刻消耗的NaOH的体积，计算蛋白质的水解度；水解度达到平稳后，迅速将反应体系置于沸水中加20min灭酶，后冷却至室温，离心收集上清液，冷冻干燥得到大豆多功能降糖肽。
具体实施方式十二：本实施方式披露了一种大豆多功能降糖肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：将大豆除杂并磨粉，得到大豆粉，采用碱提酸沉法提取大豆分离蛋白；
步骤二：将大豆分离蛋白用去离子水配制成浓度为4％(w/v，质量/体积)的溶液，充分搅拌均匀后，沸水浴保温14min，冷却至室温，得到大豆分离蛋白溶液；
步骤三：调节大豆分离蛋白溶液的pH值为8，温度为60℃，加入一定量的木瓜蛋白酶，使E/S(酶/底物)为6000U/g，酶解时间为8h；
步骤四：在蛋白质水解过程中，分别在反应的不同时刻，向反应体系中滴加0.5mol/LNaOH溶液，维持pH值恒定在初始pH值处，直至pH恒定，即达到反应终点，并记录不同时刻消耗的NaOH的体积，计算蛋白质的水解度；水解度达到平稳后，迅速将反应体系置于沸水中加13min灭酶，后冷却至室温，离心收集上清液，冷冻干燥得到大豆多功能降糖肽。
实施例1
本实施例记载了一种大豆多功能降糖肽的制备方法，将大豆在冷水(室温，约20℃)中浸泡18h，脱掉种皮后，将豆瓣40℃烘干，烘干后的豆瓣放入粉碎机粉碎5min，再用筛子获取不超过80目的粉体，得到大豆粉；利用碱提酸沉法提取大豆分离蛋白，大豆分离蛋白用去离子水配置成底物浓度为3％(w/v，质量/体积)的溶液，充分搅拌均匀后，沸水浴(水温100℃)灭活13min，冷却至室温；调节蛋白溶液的pH值和温度至碱性蛋白酶的最适pH值为10.0和最适温度50℃，加入一定量的碱性蛋白酶，使E/S(酶/底物)为6000U/g。在水解过程中，分别在反应的不同时刻(0.5h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h)测定反应体系的pH值，并向反应体系中滴加0.5M NaOH溶液，使反应体系pH值恒定在初始pH值处，至pH值恒定，即达到反应终点，并记录不同时刻消耗NaOH的体积，计算蛋白质的水解度，当水解度达到稳定后，迅速将反应体系置于沸水(水温100℃)中加热10min灭酶，后冷却至室温，3000-4000rpm离心10-30min收集上清液，-50--55℃冷冻干燥10-20h得到大豆多功能降糖肽，并置于-20℃冰箱中保存，以备后续使用。
进一步的，大豆粉通过碱提酸沉法提取大豆分离蛋白的具体步骤如下：大豆粉与蒸馏水1:15(w/v)混合并搅拌均匀，利用0.5mol/LNaOH溶液调节大豆粉与蒸馏水的混合溶液pH＝10，磁力搅拌提取溶液40min后，4000rpm离心10min，取上层清液，用0.5mol/L的HCl调其pH值为4.6，使其在蛋白等电点处沉淀30min，再将其装入300Da透析袋以除去盐离子；透析完全后的蛋白质溶液4000rpm离心10min，弃去上清液将蛋白沉淀冻干，得到大豆分离蛋白。
进一步的，蛋白质的水解度表示蛋白质在水解过程中肽键被裂解的程度，它是被裂解的肽键数(h)与原蛋白质中的总肽键数(htot)的比值；蛋白质水解度的测定方法采用pH-state法进行水解度测定；pH-state法主要是基于蛋白质水解过程中，总是要伴随质子的释放或吸收，质子化的多少，依赖于溶液的pH值，通过加入的用于维持体系pH的碱或酸的量直接计算出水解度，即DH。
B：消耗NaOH的体积，mL；
NB：NaOH的摩尔浓度，mol/L；
M：底物所含蛋白质总量，g；
htot：单位质量底物蛋白质中肽键总数，mmol/g；
α：α-氨基的解离度，其中pK为氨基的平均pK，按7.0计算，pH：反应起始的pH值。
(1)大豆多功能降糖肽进行α-葡萄糖苷酶抑制活性测定
用0.2M，pH6.8的磷酸钠缓冲液将α-葡萄糖苷酶和D-吡喃葡萄糖苷分别配置成0.2U/mL和1mg/mL的溶液；移取50μL磷酸缓冲液，50μL D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)及50μL样品多肽溶液于96孔板中，其中样品浓度分别为5mg/mL、15mg/mL、30mg/mL、45mg/mL、55mg/mL，在37℃下孵育5min，充分混合，然后再加入10μLα-葡萄糖苷酶溶液启动反应，37℃条件下充分反应30min，80μL浓度为1M/L的Na2CO3终止反应，酶标仪405nm波长下检测反应体系生成的4-硝基苯酚(PNP)的含量并记录；实验设置空白组、对照组和样品组；空白组只添加D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)，其余用等量缓冲液代替，排除pNPG在孵育过程中自然分解生成显示物质PNP的干扰；对照组只有pNPG和α-葡萄糖苷酶进行反应，等量缓冲液代替多肽样品溶液，得到同等反应条件下可生成PNP的最高含量，以此比对出多肽样品是否起到抑制作用；采用阿卡波糖作为阳性对照，比对实验制得的多肽样品对α-葡萄糖苷酶的抑制效果。
如图1所示，大豆多功能降糖肽的浓度对于α-葡萄糖苷酶抑制率影响显著，抑制率随大豆多功能降糖肽浓度增大呈现对数趋势。当大豆多功能降糖肽浓度在5-30mg/mL间，抑制率随浓度增大而迅速增长，当浓度达到40mg/mL后，抑制率逐渐趋于平稳，增长幅度很小，保持在69.37±0.72％左右。实验所得大豆多功能降糖肽溶液的IC50值为4.94±0.07mg/mL。
(2)DPP-IV抑制活性测定
实验测定DPP-IV抑制活性在Harnedy的方法[1]基础上稍加改动。用pH值为8的Tris-HCL缓冲液将DPP-IV酶和甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺分别配置成0.02U/mL和12mmol的溶液。移取25μL甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺及25μL样品多肽溶液于96孔板中，在37℃下孵育10min，充分混合，然后再加入50μLDPP-IV酶溶液启动反应，37℃条件下充分反应30min。加入100μL浓度为1M/L的乙酸-乙酸钠溶液终止反应，酶标仪检测并记录405nm波长下的吸光值。由于反应体系略带浑浊，因此实验设置空白组，对照组，样品组和样品对照组。样品对照组中DPP-IV酶溶液用等量缓冲液代替，排除体系中悬浊物影响。如下计算DPP-IV百分比抑制率：
ODA：对照组吸光值，酶与底物充分作用后体系的吸光度；
ODS：样品组吸光值，是测试样品上清液的吸光度；
ODB：空白组吸光值，其中被测样品和DPP-IV溶液被相同量的缓冲液代替的上清液的吸光度；
ODN：样品对照组吸光值，其中DPP-IV溶液被相同量的缓冲液代替的上清液的吸光度。
本实施例为评价大豆多功能降糖肽对DPP-IV酶的抑制效果，将冻干后的大豆多功能降糖肽粉末配置成2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL7个浓度梯度，并通过紫外吸光值测算其对于DPP-IV酶的抑制率。大豆多功能降糖肽较低浓度时抑制率随浓度的增长并不明显，而当浓度在10mg/mL到20mg/mL之间抑制率大幅度增大，呈现出线性增长趋势。继续增大多肽浓度，其抑制率达到相对稳定值，抑制率增长较为缓慢，趋于稳定。本实施例测得大豆多功能降糖肽对于DPP-IV酶抑制活性的IC50值为2.73mg/mL。
(3)ACE酶抑制活性测定
ACE抑制活性的测定采用Cheung[2]描述的体外方法进行，稍作修改。本实验体系所用缓冲液为含0.3M NaCL，pH 8.3的0.1M硼酸缓冲液，ACE酶浓度为0.1U/mL，马尿酰组胺酰亮氨酸(HHL)浓度为5mM；将100μL大豆多功能降糖肽样品和200μLACE溶液混合，于37℃下温育10min，而后加入200μLHHL溶液，37℃下继续反应60min；终止反应时滴加100μL 1M HCL，随即用1.5mL乙酸乙酯萃取生成的马尿酸(HA)，剧烈震荡10min，获得萃取效果。弃去水层，将含有马尿酸的有机层置于90℃下干燥，蒸干有机溶剂后趁热滴加2mL蒸馏水复溶，生成马尿酸溶液。通过HPLC系统测定HA含量。[甲酸(0.4％)：甲醇(3:7)洗脱，通过配备有WatersC18柱(ODS，150×4.6mm，5μm粒径)的HPLC系统分析来自反应混合物的50μL等分试样v/v)以0.5mL/min的恒定流量进行，并且通过UV检测器在228nm处检测HA。ACE抑制百分比计算如下：
ACE抑制率(％)＝[(A-C)/(A-B)]*100
A:对照组，等量缓冲液代替测试样品的上清液的峰面积；
B:空白组，无测试样品无ACE溶液的上清液的峰面积；
C:样品组，测试样品上清液的峰面积。
本实施例所测定的大豆多功能降糖肽对ACE酶的抑制率达到35.33±1.57％。
(4)抗氧化活性测定
Ⅰ)羟基自由基清除能力测定
将大豆多功能降糖肽样品配制成溶液，稀释至0.1mg/mL，0.5mg/mL，2mg/mL，5mg/mL，10mg/mL的梯度溶液，向其中分别加入0.009mol/L的FeSO41.00mL，0.009mol/L的水杨酸-乙醇溶液(50％乙醇溶液)1.00mL，用漩涡振荡器混合均匀，加入1.00mL0.0088mol/LH2O2(0.03％)启动反应；将混合液置于37℃水浴中反应30min，若有沉淀产生，5000r/min离心5min，得到上清液。用紫外可见光分光光度计在510nm测得上清液吸光值A1；用1mL 50％乙醇代替水杨酸-乙醇溶液，其他条件不变，测得吸光值A2，作为本底；用1mL蒸馏水代替提取液样品溶液，其他条件不变，测得空白对照吸光值A0；则提取液对羟基自由基的清除率为：
清除率(％)＝[1-(A1-A2)/A0]*100％
A1：样品反应后的吸光值
A2：乙醇对照吸光值
A0：空白对照吸光值
如图2所述，根据样品不同稀释浓度所对应的自由基捕获能力作图(纵坐标为捕获能力％，横坐标为浓度mg/mL，图中，○代表羟基自由基捕获能力)，根据线性方程计算IC50(自由基捕获能力为50％时所对应的样品浓度)为5mg/ml。大豆多肽的浓度与羟自由基清除率呈现出明显的线性相关关系，随着多肽浓度由0.1-10mg/mL逐渐增大的过程中，对于羟自由基清除率越来越高，当大豆多肽浓度达到10mg/mL时，该溶液体系对于羟自由基的清除率达到90％以上，说明大豆多肽中存在某种对羟自由基具有功能活性的多肽片段，并且随着其含量的升高，对于实验体系中存在的羟自由基束缚效果越好，体现出越好的抗氧化性质。
Ⅱ)总还原能力测定
取1ml不同质量浓度的大豆多功能降糖肽溶液(1mg/mL，2mg/mL，5mg/mL，10mg/mL，20mg/mL)，与2.5mL 0.2mol/L磷酸钠缓冲液(pH6.6)和2.5mL 1％(w/v)铁氰化钾溶液混合，50℃保温30min，迅速冷却，再加入2.5mL 10％(v/v)的三氯乙酸溶液，之后3000r/min离心10min后取2.5mL上清液，加2.5mL蒸馏水和0.5mL 0.1％(w/v)的氯化铁溶液，混合均匀。反应10min后在700nm波长处测吸光度，吸光度越大，说明还原能力越强。
如图2所示，根据样品不同稀释浓度所对应的吸光度值作图，(纵坐标吸光值，横坐标为浓度mg/mL，图中，△代表总还原力)。
大豆多功能降糖肽在一定质量浓度范围内，A700显示的吸光值与浓度呈线性正相关性，即总还原能力随着浓度的增加而升高。当多肽浓度达到20mg/mL时，A700值接近于1，显示出较高的还原能力。
(4)体外消化特性
将大豆多功能降糖肽配置成10mg/ml溶液，用1M的HCl调节溶液pH值至2.0，加入一定比例(2.5U/mg-溶质)的胃蛋白酶，混合均匀，37℃水浴震荡2h模拟多肽在胃部的消化过程；向混合体系中滴加1M NaOH调节其pH值至7.2，以底物多肽：胰酶(4：100)的比例加入胰酶，将空透析袋(6000Da)置于体系中，37℃震荡水浴2h，模拟肠道内部消化环境。为确定消化过程对于多肽样品的影响，分别测定胃蛋白酶消化2h体系，胰酶消化2h体系对于α-葡萄糖苷酶、DPP-Ⅳ酶和ACE酶的抑制活性。由于ACE酶主要存在于血液中，多肽经消化吸收至小肠上皮细胞进入血液方可起作用，所以用透析袋(6000Da)模拟肠壁，提取透析袋内的溶液进行ACE酶抑制活性的测定。
如图3结果可以看出，复杂的消化环境并没有使多肽失活，反而一定程度上增强了其生物活性。大豆多肽的浓度为10mg/mL，测定其对α-葡萄糖苷酶抑制率为：29.04±1.49％，DPP-IV酶的抑制率为：40.85±0.82％。经胃蛋白酶消化后多肽对α-葡萄糖苷酶抑制活性显著升高，抑制率为75.53±1.44％，而后在胰酶作用下活性仍有小幅度上升，最终的消化产物的抑制率为：77.64±1.07％。证明消化过程对于粗多肽中能够起到α-葡萄糖苷酶抑制作用的肽段有促进作用。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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Claims (6)

1.一种大豆多功能降糖肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：将大豆除杂并磨粉，得到大豆粉，利用大豆粉提取大豆分离蛋白；
步骤二：将大豆分离蛋白用去离子水配制成浓度为2-5％(w/v)的溶液，充分搅拌均匀后，沸水浴保温10-15min，冷却至室温，得到大豆分离蛋白溶液；
步骤三：调节大豆分离蛋白溶液的pH值和温度至蛋白水解酶的最适pH值和最适温度，加入一定量的蛋白水解酶，使E/S为6000U/g；
步骤四：在蛋白质水解过程中，分别在反应的不同时刻，向反应体系中滴加NaOH溶液，维持pH值恒定在初始pH值处，直至pH恒定，即达到反应终点，并记录不同时刻消耗的NaOH的体积，计算蛋白质的水解度；水解度达到平稳后，迅速将反应体系置于沸水中加热8-20min灭酶，后冷却至室温，离心收集上清液，冷冻干燥得到大豆多功能降糖肽。
2.根据权利要求1所述的一种大豆多功能降糖肽的制备方法，其特征在于：在步骤三中，所述蛋白水解酶为碱性蛋白酶，所述碱性蛋白酶的最适pH值为9.0-11.0，最适温度为40-60℃，酶解时间为6-10h。
3.根据权利要求1所述的一种大豆多功能降糖肽的制备方法，其特征在于：在步骤三中，所述蛋白水解酶为胰蛋白酶，所述胰蛋白酶的最适pH值为6.0-8.0，最适温度为40-60℃，酶解时间为6-10h。
4.根据权利要求1所述的一种大豆多功能降糖肽的制备方法，其特征在于：在步骤三中，所述蛋白水解酶为木瓜蛋白酶，所述木瓜蛋白酶的最适pH值为6.0-9.0，最适温度为50-70℃，酶解时间为6-10h。
5.根据权利要求1所述的一种大豆多功能降糖肽的制备方法，其特征在于：在步骤一中，大豆粉提取大豆分离蛋白采用碱提酸沉法。
6.根据权利要求1所述的一种大豆多功能降糖肽的制备方法，其特征在于：在步骤四中，所述NaOH溶液的浓度为0.5mol/L。
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