CN1593646A - 大豆肽、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种低分子量的大豆功能短肽产品、产品的制备方面及该产品在用于抗机体疲劳、提高机体抗氧化能力方面的应用。该大豆肽是以低温脱溶豆粕为原料，经豆粕预处理、酶水解、酶灭活、精制和干燥制粉等步骤制得。大豆肽干粉是一种淡黄色的粉末，分子量主要分布在200－900Da，平均链长3－5个氨基酸，含有天门东氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸等多种氨基酸。本发明的大豆肽具有制备工艺简单、高营养价值、物理性状良好、多种生理功能等优点，作为基料可以用于保健食品、普通食品添加剂、医药品和化妆品等领域。

Description

大豆肽、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种低分子量的大豆肽产品、利用酶法直接降解低温脱溶大豆豆粕制备该大豆肽的方法以及该大豆肽产品在抗疲劳及提高抗氧化能力方面的应用。

背景技术

蛋白质是由氨基酸组成的最基本的生命物质之一，它的片段称为肽。具有特定生理功能的肽称为生物活性肽，是生命活动中起调节作用的一类重要生命物质。近年来，国外的研究人员发现，从一些食物蛋白的酶水解产物中分离出的多种小肽具有调节人体的各种生理活性的作用。此外，长久以来人们知道，食物蛋白要经过复杂的消化过程才能被人体吸收。然而，最近在医学上发现，小肽可由肠道直接吸收，而且吸收速度要比相同组成的游离氨基酸还快，这些发现对开发肽类新型功能保健食品具有重要意义。

大豆肽是大豆蛋白经过酶降解而获得的多种肽的混合物。功能性食品应该是具有合理营养和保健功能的营养健康食品。众所周知，大豆蛋白是营养价值很高的食物蛋白，也是唯一能取代动物蛋白的植物蛋白。与大豆蛋白相比，大豆肽往往具有更良好的物理性质和加工性能，例如，大豆蛋白的粘度随浓度增加而迅速升高，但低分子量的大豆肽即使在50％的高浓度下也仍然保持流动性。大约10％浓度的大豆蛋白水溶液，一经加热就会凝固，而大豆多肽则不会。在溶解性方面，大豆蛋白在其等电点会形成沉淀，但大豆多肽仍然会保持溶解状态。不仅如此，大豆多肽还具有抑制蛋白质形成凝胶的能力。这些性质对大豆肽的开发利用是非常有利的因素。除了营养功能而外，近年来人们已经发现，大豆多肽还具有许多生理功能，如调节脂肪代谢，降低胆固醇，抑制血压升高，非过敏性，增强免疫功能等。

长久以来，大豆是生产食用油的主要原料，尽管制油工业的副产品豆粕中一小部分用来生产大豆分离蛋白，但大部分豆粕用来加工饲料，利用价值太低。然而，对大豆来说，豆粕中含有全部大豆蛋白质。如果能以豆粕为原料并且直接用酶水解制备具有多种生理功能的高附加值的肽类功能食品，医药品以及包括化妆品在内的其它产品。这可以使粮油资源得到综合利用。

发明内容

本发明的目的是提供一种原料易得、生产工艺简单的制备一种低分子量的大豆肽的方法。

本发明的另一个目的是提供一种低分子量的大豆肽产品。

本发明的再一个目的是提供该低分子量肽产品在食品、药品及化妆品行业中的应用。

本发明是以大豆低温脱溶豆粕(而不是以大豆分离蛋白)为原料，酶法制备低分子量大豆肽。这样使大豆肽的生产工艺大大简化，明显降低成本。

本发明所述大豆肽的制备方法涉及大豆豆粕原料预处理、酸洗除杂、酶解等步骤，原料预处理即将大豆豆粕原料粉碎和过筛，目的是使大豆蛋白易溶出；酸洗除杂的目的是在使大豆蛋白沉淀的同时，使留在上清液中的可溶性寡糖等水溶性成分与其分开；在酶解过程中，蛋白质被降解成肽，进入水溶液中，而纤维素类的不溶物留在沉淀中，固液分离后即得到大豆肽原液。最后采用超滤膜分离技术进行大豆肽的精制。

本发明涉及所采用的酶制剂底物专一性广泛，容易获得低分子量的肽片段，大豆肽基本无苦味。如果酶制剂选择不当，则大豆肽有苦味。

制备上述大豆肽产品的步骤如下：

制备步骤中所用水均为去离子水。

1、原材料预处理

将市售大豆低温脱溶豆粕用粉碎机粉碎，过60-80目筛；

2、酸沉与水洗

按固液比1∶8-1∶12往豆粕粉中加水，升温至30-60℃，搅拌下用浓盐酸调pH至3.0-6.0，沉淀大豆蛋白，继续搅拌1-2h，6000-9000r/min离心，倾去上清；再按上述固液比往沉淀中加水(不需要升温，也不调PH值)，搅拌15-20min洗沉淀，6000-9000r/min离心，去除上清液后收集沉淀；按同样操作再水洗一次沉淀，弃上清，收集沉淀；

3、酶水解

按固液比1∶8-1∶12将步骤2中收集的沉淀与水混合，搅拌，用NaOH溶液调pH至8.0-10.0，升温至35℃-60℃，按每kg豆粕加40-100ml酶液的比例，加入卡氏枯草杆菌丝氨酸碱性蛋白酶液^[1]，开始水解反应，在反应的过程中，滴加0.05mol/LNaOH维持体系pH值恒定，当蛋白质水解度达到20-30％时，停止反应；

4、酶灭活

步骤3结束后，快速升温至90-100℃，保持10-20min使酶灭活，然后，快速(10-20min内)降至室温，调pH至中性，12,000-15,000rpm，离心20-30min，固液分离，上清液为大豆肽原液；

5、精制

使大豆肽原液通过截止分子量5000-10,000Da的超滤膜系统，去掉大豆肽原液中的大分子片段完成其精制过程，膜上液回到步骤3继续水解；

6、浓缩

由步骤5中得到的过膜液，减压浓缩至固型物含量35-40％；

7、干燥

精制的大豆肽液浓缩后，经喷雾干燥或冷冻干燥制成干粉，产率为20-30％(肽干粉/豆粕)；

本发明大豆肽产品具有如下性能：

一.生物化学特征

1、精制的大豆肽干粉是一种微黄色的粉末，粗蛋白质量含量80％-85％，灰分5-7％，糖、水份及其他成分含量8-15％，其中糖为4-6％，产品的氮溶指数NSI为98.0-99.9％，三氯醋酸可溶蛋白(TCA Pr.)99.5％-99.9％；

2、精制的大豆肽是一种寡肽的混合物，含有大约10-15％游离氨基酸，60％-70％寡肽的分子量分布在200-900Da；用TNBS法测定平均链长为3-5个氨基酸；

3、大豆肽在所有pH下都能溶解于水；

4、大豆肽对热稳定，100℃煮沸不出沉淀；

5、大豆肽产品在室温下保存3个月，肽含量无明显变化；

6、大豆肽氨基酸组成：天门东氨酸；苏氨酸；丝氨酸；谷氨酸；甘氨酸；丙氨酸；半胱氨酸；缬氨酸；蛋氨酸；异亮氨酸；亮氨酸；酪氨酸；苯丙氨酸；赖氨酸；组氨酸；精氨酸；脯氨酸。

二.生物功能

1.大豆肽抗疲劳作用

(1).检测方法

检测动物：昆明种雄性小鼠，6-8周龄，体重18-22g。随机分成实验组与对照组，以灌胃途径给药。实验组每天灌服大豆肽溶液，给药剂量：实验I组，100mg干粉/kg体重；实验II组，200mg干粉/kg体重；实验III组，400mg干粉/kg体重。干粉配成溶液后按小鼠每10g体重给药0.2ml，对照组给同体积的蒸馏水。

运动耐力试验，即负重游泳试验：40只小鼠，随机分成四组，对照组及实验I、II、III组。小鼠给药25天后，将其置于游泳槽中游泳，水温26±0.5℃，水深28cm，小鼠负重为体重的2％，记录小鼠自由游泳从开始到死亡的时间。

血乳酸浓度测定：40只小鼠，随机分成对照组及实验I、II、III组。给药25天后，让小鼠在30±2℃水中游泳30min，泳前安静时及泳后15min、50min各取尾血一次，用对羟基联苯比色法测定血乳酸含量。

肝糖原含量测定：40只小鼠，随机分成对照组及实验I、II、III组。实验第25天，处死小鼠，立即取出肝脏，用蒽酮比色法测定其糖原含量。

(2).检测结果

①小鼠负重游泳实验

从表1中数据可见，中剂量与高剂量组大豆肽的动物负重游泳时间与对照组比较，有明显的延长并有显著差异(与对照组相比P＜0.05)。

                表1：大豆肽对小鼠游泳时间的影响(X±SD)

组  别          动物数(只)    游泳时间(min)

对照组          10            79.64±12.24

低剂量组        10            80.70±21.39

中剂量组        10            96.93±8.27^*

高剂量组        10            112.45±9.36^*

^*与对照组相比P＜0.05

②大豆肽对小鼠血乳酸浓度的影响

从表2中的数据可以看出，大豆肽中、高剂量组的小鼠在实验第25天，运动后15分钟和50分钟血乳酸值明显低于对照组，且具显著差异。在本实验中，大豆肽实验组小鼠在运动后15分钟血乳酸值明显低于对照组，证明在这个期间，有氧代谢在供能中所占比例很高，所以产生的乳酸少，则酵解过程中产生的乳酸不容易在肌肉中积累，从而可延缓疲劳的产生。实验中，大豆肽实验组小鼠在运动停止后50分钟的血乳酸值明显低于对照组，则表明在运动恢复期，肌肉中过多的乳酸能够迅速被清除，这意味着能够较快恢复疲劳。

             表2：大豆肽对小鼠乳酸含量的影响(mg/100ml，X±S)

组  别         运动前       运动停止后15分钟     运动停止后50分钟

对照组         28.97±2.95  57.48±2.98          49.04±1.77

低剂量组       27.42±2.49  57.24±2.37          48.72±2.18

中剂量组       27.51±2.43  52.38±1.56^*        44.44±2.87^**

高剂量组       28.01±2.97  48.78±1.78^**       40.29±2.00^**

^*P＜0.05；^**P＜0.01

③大豆肽对小鼠肝糖原含量的影响

从表3中的数据可以看出，小鼠在给药(大豆肽)第25天，其肝糖原含量，与对照组相比，低剂量组无显著变化，而中剂量组小鼠肝糖原含量增加了22.30％(P＜0.05)，高剂量组小鼠肝糖原含量增加了35.98％(P＜0.01)。

如果机体在运动中肝糖原及肌糖原耗竭，则糖异生作用受阻，血糖浓度降低，并会干扰中枢神经系统而出现疲劳。本实验大豆肽实验组肝糖原比对照组明显提高，说明大豆肽能够通过增加肝糖原储备，维持运动时血糖水平，从而为机体提供更多的能量，使机体迅速恢复疲劳。

                表3大豆肽对小鼠肝糖原的影响(X±SD)

组别             肝糖原含量(mg/100g组织)

对照组           2.78±0.30

低剂量组         2.81±0.26

中剂量组         3.48±0.21^*

高剂量组         3.79±0.23^**

^*P＜0.05；^**P＜0.01

上述实验结果表明本发明所制备的大豆肽具有明显的缓解体力疲劳的功能。此外，大豆肽富含人体必需氨基酸，且平衡良好，因而具有很高的营养价值。以大豆肽为基料，可以开发成保健食品和医药品(如肠道营养剂)，具有可以迅速消除疲劳，提高耐力以及补充营养等功效。该类产品适合长时间学习或工作的人，长时间开车或乘车的人以及从事体育运动或从事体力劳动的人食用。该产品也适合术后的病人或消化功能弱的老年人和婴幼儿食用。该产品具有人群覆盖面大的特点。

2.大豆肽抗氧化作用

(1).检测方法

①邻苯三酚自氧化

邻苯三酚(PR)在碱性条件下能迅速自氧化，释放出O₂ ^-，生成有色的中间产物，可用分光光度法进行测定。PR自氧化过程的初始阶段，中间产物的累积在30-40s后与时间成线性关系，且在320nm有强烈吸收，当有抗氧化剂存在时，可清除O₂ ^-，从而阻止中间产物的积累，据此可求出抗氧化剂的类超氧化物歧化酶(SOD)活性。

反应体积3ml，空白管加0.1ml重蒸馏水，2.8ml 0.1mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.2，)，25℃保温10min，然后加入0.1ml预热的3mmol/L邻苯三酚，混匀，开始计时，反应30s后，于320nm处作时间扫描，反应时间4min。空白最佳的自氧化速率控制为0.06A/min；样品管加0.1ml大豆肽(10mg/1ml)，2.8ml 0.1mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.2)，同样25℃保温10min，加入0.1ml 3mmol/L邻苯三酚。30s后，于320nm处扫描。最后计算抑制率，用来评价样品的清除超氧阴离子自由基的活性。

②亚油酸过氧化

脂质中的多不饱和脂肪酸由于含有多个双键而化学性质活泼，最易受到自由基的破坏发生过氧化反应。一个不饱和脂肪酸分子通过自由基反应形成共轭双键和丙二醛。亚油酸是多不饱和脂肪酸的模型化合物，也含有多个双键，亚油酸的过氧化可以代表体内脂质过氧化的过程。

制备亚油酸微团液：向避光容器中加入0.01mol/L，pH7.4的硼酸缓冲液，滴入适量的亚油酸，充分混匀至乳白色得亚油酸微团，浓度为6.4mmol/L，4℃冷藏保存，24小时内使用。

亚油酸过氧化度的测定：亚油酸过氧化由三个阶段组成，即诱导期，延长期和终止期。在诱导期有共轭二烯生成，它反映亚油酸的过氧化程度，而共轭二烯在234nm有特征吸收；在亚油酸过氧化反应的中期，有亚油酸过氧化物(LOOH)的生成，过氧化程度可以用过氧化值(POV)来表示；作为亚油酸过氧化反应的终产物丙二醛(MDA)在终止期生成。而丙二醛可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应，形成红色的产物，在532nm的消光系数为1.56×10⁵L·mol^-1·cm^-1。由此可以计算MDA的量，进而求出以MDA为代表的脂类过氧化值。

在测共轭二烯时，首先建立系统I，即0,01mol/L，pH7.4的硼酸缓冲液，含Vc 0.025mmol/L，Cu²⁺10μmol/L，亚油酸64μmol/L。其次，在系统I的基础，通过分别加入终浓度为0.02，0.04，0.08mg/ml的大豆肽，0.04mg/ml的谷胱甘肽(GSH)建立系统II，III，IV和V。在25℃下，以相同浓度的亚油酸储备液为空白，同步测定以上五个系统的OD₂₃₄随时间的变化，检测大豆肽的抑制亚油酸过氧化的能力。

在测亚油酸过氧化物时(即测POV值)，每隔20分钟，分别从上述体系I，III，V中取样20ml，加入1.5ml 1N的HCl，将pH调至2.0以终止过氧化反应。再加入4ml 40％的KI，于暗处放置10分钟后，用准确标定的Na₂S₂O₃滴定。当溶液颜色由黄变为淡黄时，加入两滴1％的淀粉作指示剂，滴定至无色，记录Na₂S₂O₃的量。平行实验三次。因为Cu²⁺也能氧化I^-为I₂，所以首先对只含Cu²⁺的空白体系进行滴定。以每ml反应液中LOOH的生成量表示POV。

在测产物丙二醛时，先配制硫代巴比妥酸(TBA)溶液，称取0.67g TBA，用100ml 5.6％的乙酸于56℃水浴溶解，保存于棕色瓶中待用。然后，建立以下四个系统：

系统I：亚油酸的终浓度为64μmol/L，进行自氧化。

系统II：亚油酸的终浓度为64μmol/L，Cu²⁺的终浓度的为10μmol/L，Vc的浓度为25μmol/L，使其进行过氧化。

系统III：在系统II中加入终浓度为0.04mg/ml的大豆肽。

系统IV：在系统II中加入终浓度为0.04mg/ml的GSH。

反应启动后，每隔20分钟从各体系中取样1ml，加入0.5ml的TBA后，沸水浴15分钟，然后用去离子水稀释至3.0ml。以去离子水为空白，测定OD₅₃₂的值，平行实验三次。

③大鼠红细胞氧化溶血

红细胞悬液的制备：Wistar大鼠断头取血，以4％的柠檬酸钠作抗凝剂，加入2-3倍的生理盐水悬浮，离心(1500r/min，5min，4℃)，去上清及黄色薄层，重复洗涤三次，悬浮于0.01mol/L，pH7.4的磷酸缓冲液中，配成1％的红细胞悬液，冷藏待用。

红细胞自溶血系统：

系统I：10ml红细胞悬液

系统II：系统I+0.1mmol/L大豆肽

系统III：系统I+0.1mmol/L Vc

系统IV：系统I+0.1mmol/L GSH

过氧化氢诱导的红细胞氧化溶血系统：

系统A：10ml红细胞悬液+100mmol/LH₂O₂；

系统B：系统A+0.1mmol/L大豆肽；

系统C：系统A+0.1mmol/LVc；

系统D：系统A+0.1mmol/L GSH

系统A-D于37℃温浴1h。

红细胞自氧化溶血度的测定：在测定血红蛋白含量时，从系统I-IV1500r/min离心5min后的上清中取样，测OD₅₄₀；在测定氧化产物的量时，从系统I-IV1500r/min离心5min后的上清中取1.5ml加入1ml的TBA(硫代巴比妥酸)，置于沸水浴中30min，冷却后1500r/min离心5min测OD₅₃₂。OD₅₃₂值与有色的反应产物的浓度线性相关。

过氧化氢诱导的红细胞过氧化溶血度的测定：包括血红蛋白的测定，方法是将系统A-D1500r/min离心5min后，取上清，测OD₅₄₀，测定血红蛋白的含量；氧化产物的测定方法：从系统A-D1500r/min离心5min后的上清中取1.5ml，加入1ml的TBA溶液，沸水浴30min，冷却后1500r/min离心5min，取上清液测定OD₅₃₂，测定TBA反应物的含量。

(2).检验结果

①大豆肽对邻苯三酚自氧化的抑制作用

大豆肽对邻三酚自氧化的抑制率按下式计算：

I＝(ΔA_o-ΔA)/ΔA_o×100％

I表示抑制率；ΔA_o、ΔA分别表示未加入和加入抗氧化剂后邻苯三酚自氧化速率，即每分钟其光吸收的平均变化率。经测定，邻苯三酚自氧化速率(ΔA_o)为0.06A/min。

实验结果表明，不同浓度大豆肽对邻苯三酚自氧化的抑制率随着样品浓度的增加呈线性关系，其抑制率达到50％的大豆肽浓度(IC₅₀)为4.5mg/ml。

②大豆肽对亚油酸过氧化的抑制作用

共轭二烯测定结果：以实验条件下的亚油酸过氧化体系为对照组，加入不同浓度的大豆肽，测定反应体系中共轭二烯生成量的变化，结果如附图1所示。从图中可见，大豆肽浓度为20μg/ml时的抑制率就已经达到了80％，表现出较高的抗氧化活性。但是随着浓度的增高，抑制率的增大并不十分明显。分析其原因，可能是由于大豆肽的抗氧化活性主要表现为阻断自由基的链式反应，捕捉自由基反应链中的过氧自由基，因而可以减缓自由基的链式反应。而对于清除链引发阶段自由基的能力较SOD等酶类要弱一些。因而即使抑制剂的浓度提高几倍，抑制率的提高也不大。

过氧化亚油酸的测定结果：亚油酸过氧化反应生成的LOOH在弱酸条件下，可以把I^-氧化成I₂，I₂又可与Na₂S₂O₃进行定量反应，由此可间接测定反应生成的LOOH的量。因为Cu²⁺也能氧化I^-，所以首先对只含Cu²⁺的空白体系进行滴定，以除去Cu²⁺对反应的影响。

以大豆肽和谷胱甘肽(GSH)作为抗氧化剂，加入反应体系，以检验大豆肽和GSH的抗氧化性，结果如附图2所示。由图2可知，大豆肽和GSH对过氧化亚油酸的生成都有抑制作用，但是在相同的肽浓度条件下大豆肽的抑制作用更强，大豆肽的抑制率为68.4％，GSH的抑制率为22.4％。

丙二醛的测定结果：如附图3所示，比较了大豆肽和GSH抑制亚油酸过氧化的终产物丙二醛的生成的作用。其中，GSH表现出较强的抑制作用，在浓度为0.04mg/ml时，其抑制率为46.2％，而大豆肽在相同的作用浓度下的抑制率为41.7％。

③大豆肽对大鼠红细胞氧化溶血的影响

以不加抗氧化剂的血红蛋白的溶血为100％，计算加抗氧化剂的血红蛋白的溶血度。由表4中可以看出，在有大豆肽存在时，红细胞溶血度下降了38.6％，说明大豆肽对红细胞的自氧化损伤有保护作用，强于谷胱甘肽(GSH)和Vc。

                表4：大豆肽对大鼠红细胞自氧化溶血的影响

                自溶血    大豆肽    GSH     Vc

OD₅₄₀          0.474     0.344     0.389   0.384

溶血度          100％     72.6％    82.1％  81.0％

抑制率          --        27.4％    17.9％  19％

此外，在加入了外源活性氧(H₂O₂，O₂ ^-及·OH)作用于红细胞之后，含有大豆肽的体系溶血度明显下降(见表5)，由此可以推测大豆肽可能使红细胞产生的超氧自由基减少。

               表5 ：大豆肽对大鼠H₂O₂诱导的红细胞溶血的影响

           H₂O₂诱导的溶血     大豆肽       GSH           Vc

OD₅₄₀     0.786±0.05          0.333±0.04  0.311±0.05   0.625±0.07

溶血度     100％                42.4％       39.6％        79.5％

抑制度     -----                57.3％       60.4％        20.5％

自由基从化学结构上看是指含有未配对电子的基团、原子或分子。人体内存在的氧自由基即活性氧，包括超氧阴离子(O₂ ^-)、羟自由基(^·OH)、过氧化氢(H₂O₂)，氢过氧基(HO₂)，烷氧基(RO^·)，烷过氧基(ROO^·)，氢过氧化物(ROOH)和单线态氧(¹O₂)等。自由基是机体正常组织中的代谢产物，生成与被清除处于动态平衡，有的自由基对机体无明显毒性，而大多数自由基对机体损害严重。只是在生理情况下这些自由基不断产生，但也不断被抗氧化剂清除，因而显不出自由基对机体的损伤。而在某些病理情况下，自由基产生过多或清除过慢，它通过攻击生物大分子使组织造成损伤，引起机体衰老，甚至引发肿瘤等恶性疾病。为了防御自由基的损伤，可以给予机体额外的自由基消除剂，以达到由于机体内自由剂过剩所引发的疾病的目的。

随着自由基理论的发展，天然小分子抗氧化剂的作用机理不断被阐明，特别是维生素C(Vc)和谷胱甘肽(GSH)的作用机理已经明了。上述实验结果表明本发明所制备的大豆肽也是小分子的抗氧化剂。在摩尔浓度与GSH相当的情况下，大豆肽抑制亚油酸过氧化活性与GSH相接近。在反应的第一与第二阶段，大豆肽的抑制率略低于GSH，但在反应第三阶段高于GSH，表明大豆肽比巯基化合物更稳定。红细胞过氧化溶血实验表明，在相同的摩尔浓度下，大豆肽抑制红细胞过氧化溶血损伤能力，较Vc和GSH都强。

本发明所制备的大豆短肽具有清除自由基的抗氧化活性，这一生理功能可应用于医药行业和化妆品行业，适合于预防和治疗由于自由基损伤所引起的疾病如癌症，器官组织细胞的破坏和减少，免疫功能低下等。大豆肽可以用于普通食品的保鲜，如防止油类氧化酸败。大豆肽可用于生产化妆品，如发乳剂，具有护发和保湿作用；又如面霜，有类似SOD的抗氧化作用，可以养颜(抗衰老)。与其他小分子抗氧化剂相比较，大豆肽更具有易制备，价格低廉，稳定性好等特点。

三.大豆肽稳定性检验

对两批大豆肽中试产品主要功效成分，即寡肽的稳定性进行了检验。样品在室温条件下保存，每个月测定样品中的肽的含量，观察时间为三个月，测试结果见表6。

              表6：大豆肽稳定性检验

保存期(月)      批次I/mg/ml       批次II/mg/ml

0               30.7              29.3

1               29.0              29.3

2               31.5              30.9

3               30.9              30.1

由以上可以看出，本发明的大豆肽的具有制备工艺简单，良好的物理性状(低分子量，稳定性高等)和多种生理功能(抗疲劳作用和较强的抗氧化作用)优点。

附图说明

图1：大豆肽浓度对亚油酸过氧化影响的实验曲线；

图2：大豆肽和谷胱甘肽对过氧化亚油酸生成抑制作用的实验曲线；

图3：大豆肽和GSH抑制亚油酸过氧化的终产物MDA生成的实验曲线。

具体实施方式

下面举例说明本发明大豆肽的制备：

实施例1：

取20g大豆豆粕粉(蛋白含量为45％)，加200ml水，搅拌，升温至45℃，搅拌下用浓盐酸调pH至4.2。2h后停止搅拌，离心(9000rpm，30min)，去掉上清，加200ml水，洗沉淀，搅拌20min，离心(9000rpm，30min)，去上清；此步骤再重复一遍。收集沉淀，加200ml水，搅拌，加0.5mol/LNaOH调pH9.5，升温至35℃，加1.1ml酶液(卡氏枯草杆菌丝氨酸碱性蛋白酶^[1]，Novo Nordisk)，开始水解反应。在反应的过程中，保持温度50℃，维持pH9.5。当水解度达到25％时，停止反应。反应结束后，快速升温至95℃，保持10-15min使酶灭活。然后，降至室温，调pH至6.8。12,000rpm，离心30min，上清液为粗制大豆肽液。大豆肽液过截止分子量为5000Da的超滤膜，去除大分子片段。膜上液回到酶解罐中再次水解。精制的大豆肽液减压浓缩至固形物含量35-40％，喷雾干燥得到精制的大豆肽干粉。产率：0.51g/g蛋白，

大豆肽含蛋白粗82.5％，灰分5.5％，糖及其他5.0％，水分7.0％；氮溶指数(NSI)99.9％，三氯醋酸可溶蛋白(TCA Pr.)99.8％，平均链长3.3，游离氨基酸14.8％。

实施例2：

取20g大豆豆粕粉(蛋白含量为45％)，加200ml水，搅拌，升温至45℃，搅拌下用浓盐酸调pH至4.2。2h后停止搅拌，离心(9000rpm，30min)，去掉上清，加200ml水，洗沉淀，搅拌20min，离心(9000rpm，30min)，去上清；此步骤再重复一遍，收集沉淀，加200ml水，调pH8.5，升温至55℃，加1.6ml酶液(卡氏枯草杆菌丝氨酸碱性蛋白酶^[1]，Novo Nordisk)，开始水解反应。使pH维持在8.5。当水解度达到30％时，停止反应。快速升温至95℃，保持15min使酶灭活。然后，降温至室温。调pH至7.0。12,000rpm，离心30min，上清液为粗制大豆肽液。大豆肽液过截止分子量10,000Da超滤膜。过膜液减压浓缩至固形物含量35-40％，喷雾干燥，得到精制的大豆肽干粉。产率：0.63g/g蛋白

大豆肽含蛋白粗82.2％，灰分6.1％，糖及其他5.0％，水分6.7％；氮溶指数(NSI)99.9％，三氯醋酸可溶蛋白(TCA Pr.)99.6％，平均链长4.5，游离氨基酸14.5％。

文献1：

Shui-Tein Chen，Shiah-Yun Chen，and Kung-Tsung Wang，Kinetically Controlled Peptide BondFormation in Anhydrous Alcohol Catalyzed by the Industrial Protease Alcalase，The Journal ofOrganic Chemistry，1992，57(25)：6960-6965.

Claims (10)

1、一种大豆肽产品，其具有如下特征：

(1).精制的大豆肽干粉是一种微黄色的粉末，粗蛋白质量含量80％-85％，灰分5-7％，糖、水份及其他成分含量8-15％，其中糖为4-6％，产品的氮溶指数NSI为98.0-99.9％，三氯醋酸可溶蛋白(TCA Pr.)99.5％-99.9％；

(2).精制的大豆肽是一种寡肽的混合物，含有大约10-15％游离氨基酸，60％-70％寡肽的分子量分布在200-900Da；用TNBS法测定平均链长为3-5个氨基酸；

(3).大豆肽在所有pH下都能溶解于水；

(4).大豆肽对热很稳定，100℃煮沸不出沉淀；

(5).大豆肽产品室温下保存3个月肽含量无明显变化；

(6).大豆肽氨基酸组成：天门东氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸。

2、权利要求1所述的大豆肽产品在抗疲劳方面的应用。

3、如权利要求2所述的大豆肽产品在抗疲劳方面的应用，其特征在于：用于制备具有抗疲劳作用的保健食品或医药品。

4、如权利要求3所述的大豆肽产品在抗疲劳方面的应用，其特征在于：用于制备肠道营养剂。

5、权利要求1所述的大豆肽产品在用于提高抗氧化能力方面的应用。

6、如权利要求5所述的大豆肽产品在用于提高抗氧化能力方面的应用，其特征在于：用于食品保鲜或用于制备化妆品。

7、如权利要求6所述的大豆肽产品在用于提高抗氧化能力方面的应用，其特征在于：用于制备具有护发和保湿作用的发乳剂或具有抗氧化作用的面霜。

8、如权利要求5所述的大豆肽产品在用于提高抗氧化能力方面的应用，其特征在于：用于制备预防和治疗由于自由基损伤所引起的疾病的药品。

9、如权利要求8所述的大豆肽产品在用于提高抗氧化能力方面的应用，其特征在于：用于制备预防和治疗自由基损伤所引起的癌症、器官组织细胞破坏和减少或免疫功能低下药品。

10.一种制备权利要求1所述的大豆肽产品的方法，其步骤如下：

(1)原材料预处理

大豆低温脱脂豆粕粉碎，过60-80目筛；

(2)酸沉与水洗

按固液比1∶8-1∶12往豆粕粉中加去离子水，升温至30-60℃，搅拌下用浓盐酸调pH至3.0-6.0，沉淀大豆蛋白，继续搅拌1-2h，6000-9000r/min离心，倾去上清；再按上述固液比往沉淀中加去离子水，搅拌15-20min洗沉淀，6000-9000r/min离心，去除上清液后收集沉淀，按同样操作再水洗一次沉淀，弃上清，收集沉淀；

(3)酶水解

按固液比1∶8-1∶12将步骤2中收集的沉淀与去离子水混合，搅拌，用NaOH溶液调pH至8.0-10.0，升温至35℃-60℃，按每kg豆粕加40-100ml酶液的比例，加入卡氏枯草杆菌丝氨酸碱性蛋白酶液，开始水解反应，在反应的过程中，滴加0.05mol/L NaOH维持体系pH值恒定，当蛋白质水解度达到20-30％时，停止反应；

(4)酶灭活

步骤3结束后，快速升温至90-95℃，保持10-20min使酶灭活，然后，快速使温度降至室温，调pH至中性，12,000-15,000rpm离心20-30min，固液分离，得上清液，为大豆肽原液；

(5)精制

使大豆肽原液通过截止分子量5000-10,000Da的超滤膜系统，去掉大豆肽原液中的大分子片段完成其精制过程，膜上液回到步骤3继续水解；

(6)浓缩

由步骤5中得到的过膜液，减压浓缩至固型物含量35-40％；

(7)干燥

精制的大豆肽液浓缩后，经喷雾干燥或冷冻干燥制成干粉，产率为20-30％。

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